Estudos imunológicos em urologia

A prescrição de um imunograma a um paciente urológico significa que o médico assistente suspeita da presença de distúrbios no sistema imunológico. Infecções bacterianas, virais e fúngicas recorrentes, manifestações alérgicas e doenças sistêmicas podem ser sinais desses distúrbios, que se caracterizam por uma série de síndromes (infecciosas, oncológicas, alérgicas, autoimunes e linfoproliferativas). Um paciente pode apresentar várias síndromes. Por exemplo, doenças infecciosas crônicas (síndrome infecciosa) podem causar imunodeficiência, e a imunodeficiência pode se manifestar como uma predisposição a doenças infecciosas e oncológicas (síndrome oncológica). A predisposição a infecções pode ocorrer no contexto de imunodeficiência secundária, que se desenvolveu como resultado de uma doença linfoproliferativa, como a leucemia. Existem três grupos principais de alterações patológicas no sistema imunológico:

• deficiência quantitativa ou funcional de um ou outro elo do sistema imunológico, o que leva ao desenvolvimento de um estado de imunodeficiência;
• um distúrbio no reconhecimento de antígenos pelo sistema imunológico, levando ao desenvolvimento de processos autoimunes;
• uma resposta imune hiper-reativa ou "pervertida", manifestada pelo desenvolvimento de doenças alérgicas.

Existem métodos de triagem (testes de nível 1) e métodos de esclarecimento (testes de nível 2) de imunodiagnóstico. Os primeiros existem para registrar distúrbios no sistema imunológico, os segundos para estabelecer os mecanismos envolvidos em sua implementação com o objetivo de posterior imunocorreção.

Imunidade de células B

Métodos de triagem

• Determinação do número relativo e absoluto de linfócitos B por imunofluorescência ou citofluorometria de fluxo com anticorpos monoclonais para antígenos de células B (CD19, CD20, onde CD são clusters de diferenciação). O conteúdo normal de linfócitos B em adultos é de 8 a 19% do número total de leucócitos, ou 190 a 380 células/μl. Um aumento no conteúdo de linfócitos B ocorre em infecções bacterianas e fúngicas agudas e crônicas, doenças hepáticas crônicas, doenças sistêmicas do tecido conjuntivo, leucemia linfocítica crônica e mieloma.
• Determinação da concentração de imunoglobulinas não específicas (F, M, G, E) por imunodifusão radial simples, nefelometria ou turbometria, radioimunoensaio ou ensaio imunoenzimático (ELISA). Normas para adultos: imunoglobulina (Ig) A 0,9-4,5 g/l. IgM 0,3-3,7 g/l. IgG 8,0-17 g/l. Um aumento na concentração de imunoglobulinas ocorre nas mesmas condições patológicas em que ocorre um aumento no conteúdo de linfócitos B. Uma diminuição na concentração de imunoglobulinas ocorre na hipogamaglobulinemia congênita, neoplasias do sistema imunológico, remoção do baço, perda de proteínas, doenças renais ou intestinais, tratamento com citostáticos e imunossupressores.

Métodos de esclarecimento

• Determinação de imunocomplexos circulantes no sangue por precipitação seletiva em polietilenoglicol seguida de densitometria (normalmente 80-20 U). Um aumento nos imunocomplexos circulantes é típico de infecções agudas bacterianas, fúngicas e virais, doenças autoimunes, imunocomplexos, doença do soro e reações alérgicas do tipo 3.
• Determinação de imunoglobulinas específicas no sangue em relação a antígenos bacterianos e virais, ácido desoxirribonucleico (DNA) em doenças autoimunes, detecção de anticorpos antiespermatozoides (infertilidade autoimune) e antirrenais (pielonefrite e glomerulonefrite) pelo método de imunodifusão radial ou ELISA.
• Determinação de anticorpos antiespermatozoides em espermatozoides [teste MAR (reação mista de antiglobulina)], resultado normal - negativo.
• Determinação da concentração de imunoglobulinas na urina para fins de diagnóstico diferencial entre pielonefrite e glomerulonefrite (seletividade da proteinúria).
• Determinação do conteúdo de IgE no suco da próstata para fins de diagnóstico de prostatite alérgica usando o método de imunodifusão radial ou ELISA.
• Estudo da resposta na reação de transformação de blastos de linfócitos B ao mitógeno de células B (mitógeno de erva-de-são-joão para estimulação da reação de transformação de blastos de linfócitos B na presença de linfócitos T), cujo valor normativo é de 95-100%.

Ligação das células T à imunidade

Métodos de triagem

• Determinação do número relativo e absoluto de linfócitos T CD3 maduros por reação de imunofluorescência ou citofluorometria de fluxo usando anticorpos monoclonais anti-CD3. A norma para adultos é de 58-76% ou 1100-1700 células/μl. Uma diminuição no número de linfócitos T é um indicador de insuficiência da ligação celular da imunidade. Isso é típico de algumas imunodeficiências secundárias e primárias (infecções bacterianas e virais crônicas: tuberculose, síndrome da imunodeficiência adquirida, tumores malignos, insuficiência renal crônica, lesões, estresse, envelhecimento, desnutrição, tratamento com citostáticos, exposição à radiação ionizante). Um aumento no número de linfócitos T ocorre no contexto de hiperatividade imunológica ou em doenças linfoproliferativas. Com a inflamação, o número de linfócitos T primeiro aumenta e depois diminui. A ausência de diminuição de linfócitos T indica um processo inflamatório crônico.
• Avaliação de subpopulações de linfócitos.
  • Determinação do número de células T auxiliares (anticorpos anti-CD4). Normalmente, 36-55% ou 400-1100 células/mcl. Um aumento no número dessas células ocorre em doenças autoimunes, doença de Waldenstrom, ativação da imunidade antitransplante; uma diminuição no número de células T auxiliares ocorre em infecções crônicas bacterianas, virais e protozoárias, tuberculose, síndrome da imunodeficiência adquirida, tumores malignos, queimaduras, lesões, desnutrição, envelhecimento, tratamento com citostáticos e exposição à radiação ionizante.
  • Determinação do número de T-supressores (anticorpos anti-CD4). Normalmente 17-37% ou 300-700 células/μl. Um aumento no número de T-supressores ocorre nas mesmas condições em que o número de T-helpers diminui, e sua diminuição ocorre nas mesmas condições em que o conteúdo de T-helpers aumenta.
  • Índice imunorregulador CD4/CD8, normalmente 1,5-2,5. Hiperatividade acima de 2,5 (doenças alérgicas e autoimunes); hipoatividade menor que 1,0 (predisposição a infecções crônicas). No início do processo inflamatório, o índice imunorregulador aumenta e, quando diminui, se normaliza.

Métodos de esclarecimento

• Determinação do número de células assassinas naturais (células NK) - anticorpos anti-CD16 e anti-CD56. A norma para linfócitos CD16 é de 6 a 26%, CD56 - 9 a 19%. Um aumento no número de células NK ocorre durante a rejeição de transplantes, uma diminuição - com infecções virais, câncer, imunodeficiências primárias e secundárias, queimaduras, lesões e estresse, tratamento com citostáticos e exposição à radiação ionizante.
• Determinação do número de linfócitos T com receptor para interleucina-2 (marcador de ativação) - anticorpos anti-CD25. A norma é de 10-15%. Observa-se um aumento em seu número em doenças alérgicas, rejeição de transplantes, resposta a antígenos dependentes do timo no período agudo da infecção primária e uma diminuição nas mesmas doenças em que há diminuição do número de células NK.
• Estudo da expressão do marcador de ativação - molécula de histocompatibilidade de classe II HLA-DR. O aumento da expressão ocorre em processos inflamatórios, em pacientes com hepatite C, doença celíaca, sífilis e doenças respiratórias agudas.
• Avaliação da apoptose de linfócitos. Uma ideia aproximada da prontidão dos linfócitos para apoptose pode ser determinada pela expressão do receptor Fas (CD95) em sua superfície e do proto-oncogene bd-2 na mitocôndria. A apoptose dos linfócitos é avaliada tratando-os com dois corantes fluorescentes: iodeto de propídio, que se liga a fragmentos de DNA, e anexina Y, que se liga à fosfatidilserina, que aparece na membrana celular no início da apoptose. Os resultados são avaliados usando um citofluorômetro de fluxo. Os resultados são calculados com base na proporção de células coradas com diferentes corantes. Células não coradas são viáveis, células ligadas apenas à anexina Y são manifestações precoces de apoptose, com iodeto de propídio e anexina Y são manifestações tardias de apoptose, a coloração apenas com iodeto de propídio indica necrose.
• Avaliação da proliferação de linfócitos T in vitro.
  • Alterações na blastogênese celular - reação de transformação de blastos em linfócitos. Os leucócitos são incubados com qualquer mitógeno de origem vegetal (lectinas). A fitohemaglutinina é mais frequentemente usada por 72 horas, após o que um esfregaço é coletado, corado e o número de blastos é contado! O índice de estimulação é a razão entre a porcentagem de células transformadas no experimento (cultura com fitohemaglutinina) e a porcentagem de células transformadas no controle (cultura sem fitohemaglutinina). A reação de transformação de blastos em linfócitos pode ser avaliada pela inclusão de um marcador radioativo (ZN-timíndio) nas células cultivadas, uma vez que a síntese de DNA aumenta durante a divisão celular. Distúrbios na resposta proliferativa ocorrem em imunodeficiências primárias e secundárias associadas a infecções, câncer, insuficiência renal e intervenções cirúrgicas.
  • Nestes estudos, avalia-se a expressão de marcadores de ativação (CD25, receptor de transferrina - CD71) e da molécula do complexo principal de histocompatibilidade classe II HLA-DR, praticamente ausentes em linfócitos T em repouso. Os linfócitos T são estimulados com fitohemaglutinina e, após 3 dias, a expressão dos marcadores de ativação é analisada pelo método de reação de imunofluorescência direta ou indireta, citofluorometria de fluxo, utilizando anticorpos monoclonais para os receptores isolados.
  • Medição da quantidade de mediadores sintetizados por linfócitos T ativados [interleucina (IL) 2, IL-4, IL-5, IL-6, interferon-gama, etc.] por radioimunoensaio ou ELISA. De particular importância é a avaliação da concentração de interferon-gama e IL-4 como marcadores de Th1 e Th2 no sobrenadante de culturas ativadas e no interior da célula. Se possível, é útil determinar a expressão gênica da citocina correspondente pelo nível de ácido ribonucleico da matriz na célula produtora e pela intensidade da expressão dos receptores para as citocinas correspondentes.
    
• Reação de inibição da migração de linfócitos. Linfócitos T sensibilizados, em reação ao antígeno, secretam linfocinas, incluindo fatores que inibem a migração de linfócitos. O fenômeno de inibição é observado quando mitógenos são introduzidos na cultura de células. A avaliação do grau de inibição permite avaliar a capacidade dos linfócitos de secretar citocinas. Normalmente, a frequência de migração, dependendo do mitógeno específico, é de 20 a 80%.
• Avaliação da citotoxicidade das células NK. A capacidade das células assassinas naturais de destruir células-alvo da linhagem eritromielóide K-562 é determinada. Se a citotoxicidade dependente de anticorpos for avaliada, células-alvo revestidas com anticorpos IgG são utilizadas. As células-alvo são marcadas com 3H-uridina e incubadas com células efetoras. A morte das células-alvo é avaliada pela liberação do marcador radioativo na solução. Uma diminuição da citotoxicidade ocorre em neoplasias malignas. Em alguns casos, quando é necessário prever a eficácia do tratamento com interleucinas, a citotoxicidade das células NK é avaliada durante a incubação com determinadas citocinas.

Estudo da função dos fagócitos

Métodos de triagem

Estudo da intensidade de absorção de células microbianas por fagócitos (fagocitose de partículas de látex, cultura de teste de estafilococos, E. coli ou microrganismos isolados do paciente). Por centrifugação de sangue heparinizado, isola-se uma suspensão de leucócitos e adiciona-se soro do grupo sanguíneo IV para opsonização (opsoninas são proteínas que potencializam a fagocitose). A suspensão microbiana é diluída, misturada com leucócitos e incubada por 120 minutos, com coleta de amostras para análise 30, 90 e 120 minutos após o início da incubação. São realizados esfregaços a partir da suspensão de leucócitos coletada. Os seguintes indicadores de fagocitose são determinados:

• índice fagocítico - a porcentagem de células que entraram em fagocitose dentro de 30 min e 120 min de incubação; o valor padrão do índice fagocítico (30) é 94%, o índice fagocítico (120) é 92%;
• número fagocítico - o número médio de bactérias localizadas intracelularmente; o valor padrão do número fagocítico (30) é 11%, o número fagocítico (120) é 9,8%;
• coeficiente do número fagocítico - a razão entre o número fagocítico (30) e o número fagocítico (120); normalmente 1,16;
• Índice bactericida de neutrófilos - a razão entre o número de micróbios mortos dentro dos fagócitos e o número total de micróbios absorvidos; normalmente 66%.

Métodos de esclarecimento

• Estudo da capacidade bactericida de fagócitos no teste com nitroazul de tetrazólio (NBT) - teste NBT. O corante amarelo nitroazul de tetrazólio é adicionado aos leucócitos. Quando um neutrófilo absorve o corante, ocorre um processo de redução sob a influência de radicais livres de oxigênio, resultando em coloração azul. A reação é realizada em uma placa de fundo plano de 96 poços. A solução de Hanks (NBT espontâneo) é adicionada aos três primeiros poços com uma mistura de NBT e leucócitos, e partículas de látex são adicionadas ao segundo; a mistura é incubada a 37 °C por 25 minutos. Os resultados são lidos a 540 nm em um leitor e expressos em unidades arbitrárias. O coeficiente de estimulação (K _st ) é calculado, igual à razão entre a densidade óptica nos poços estimulados e a densidade óptica média nos poços sem estimulação. Em pessoas saudáveis, NBT _espontâneo = 90 ± 45 UC, NBT _estimulado = 140 ± 60 UC. K _st = 1,78±0,36.
• Estudo de moléculas de adesão. A citofluorometria de fluxo é utilizada para determinar a expressão dos antígenos de superfície CD11a/CD18, CD11b/CD18, CD11c/CD18. Imunodeficiências com comprometimento da adesão manifestam-se por infecções recorrentes, cicatrização lenta de feridas e ausência de pus nos focos de infecção.

Estudo do sistema complemento

Métodos de triagem

A determinação da atividade hemolítica do complemento é um estudo da via clássica de ativação do complemento. Diferentes diluições de soro de uma pessoa doente e saudável são adicionadas a eritrócitos revestidos com anticorpos. A unidade de atividade hemolítica é o inverso da diluição do soro na qual 50% dos eritrócitos são destruídos. O grau de hemólise é estimado fotometricamente pela liberação de hemoglobina na solução. Uma diminuição na atividade hemolítica do complemento é observada no lúpus eritematoso sistêmico com lesão renal, glomerulonefrite aguda, imunodeficiências combinadas, miastenia gravis, hepatite viral, linfomas, um aumento na icterícia obstrutiva, tireoidite de Hashimoto, reumatismo, artrite reumatoide, periarterite nodular, dermatomiosite, infarto do miocárdio, colite ulcerativa, síndrome de Reiter, gota.

Métodos de esclarecimento

• Determinação dos componentes do complemento. A determinação quantitativa é realizada por imunodifusão radial e nefelometria.
  O estudo não é informativo, a menos que as propriedades antigênicas dos componentes do complemento sejam alteradas.
• Foi estabelecido que o componente Clq do complemento aumenta a fagocitose e medeia a citotoxicidade celular. Sua diminuição ocorre em doenças imunocomplexas, lúpus eritematoso sistêmico, infecções purulentas e tumores.
• O componente C3 está envolvido na ativação das vias clássica e alternativa do complemento. Uma diminuição em sua concentração está associada a infecções bacterianas e fúngicas crônicas e à presença de imunocomplexos circulantes ou teciduais.
• O componente C4 está envolvido na ativação da via clássica. Uma diminuição em sua concentração está associada à ativação prolongada do complemento por imunocomplexos e à diminuição da concentração do inibidor de C1, que controla a ativação da via clássica do complemento. A deficiência de C4 ocorre no lúpus eritematoso sistêmico, enquanto o aumento de C4 ocorre na doença renal, rejeição de transplantes, inflamação aguda e doenças gastrointestinais.
• C5a é um pequeno fragmento da molécula C5, que se desprende dela como resultado da ativação do sistema complemento. Sua concentração aumenta durante inflamações, sepse e doenças atópicas e alérgicas.
• O inibidor de Cl é um fator multifuncional. Controla a ativação do componente C1 do complemento, inibe a atividade da calicreína, da plasmina e do fator de Hageman ativado, das proteases Cls e Or. A deficiência do inibidor de C1 leva ao angioedema.
• Estudos funcionais do complemento. O soro de teste é adicionado a um soro padrão sem qualquer componente do complemento e a atividade hemolítica do complemento é determinada. Se a atividade hemolítica não for restaurada ao normal, a atividade desse componente do complemento no soro de teste é considerada reduzida.

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