Pesquisa imunológica em urologia

A atribuição de um imunograma a um paciente urológico significa que o médico assistente assume a presença de distúrbios no sistema imunológico. As infecções bacterianas, virais, fúngicas repetidas, manifestações alérgicas, doenças sistêmicas podem ser sinais desses distúrbios, que são caracterizados por várias síndromes (infecciosas, oncológicas, alérgicas, auto-imunes, linfoproliferativas). Um paciente pode ter várias síndromes. Por exemplo, doenças infecciosas crônicas (síndrome infecciosa) podem causar imunodeficiência e a imunodeficiência pode ser manifestada por uma predisposição a doenças infecciosas e oncológicas (síndrome oncológica). A predisposição a infecções pode ocorrer em um contexto de imunodeficiência secundária, que se desenvolveu como resultado de uma doença linfoproliferativa, por exemplo, leucemia. Existem três grupos principais de alterações patológicas no sistema imunológico:

• insuficiência quantitativa ou funcional de uma ou outra ligação de imunidade, o que leva ao desenvolvimento de um estado de imunodeficiência;
• uma violação no reconhecimento do antígeno pelo sistema imunológico, levando ao desenvolvimento de processos auto-imunes;
• resposta imune hiperreactiva ou "pervertida", manifestada pelo desenvolvimento de doenças alérgicas.

Existem métodos de triagem (testes de nível 1) e qualificação (testes do nível 2) de imunodiagnóstico. O primeiro existe para corrigir violações no sistema imunológico, o último - para estabelecer os mecanismos envolvidos na sua implementação com o objetivo de uma nova imunocorreção.

B-Link celular da imunidade

Métodos de triagem

• Determinação do número relativo e absoluto de linfócitos B por meio de uma reação de imunofluorescência ou citofluorimetria de fluxo usando anticorpos monoclonais para antígenos de células B (CD19, CD20, onde os clusters de CD são diferenciados). O conteúdo de linfócitos B é normal em adultos: 8-19% do número total de leucócitos ou 190-380 células / μl. Um aumento nos níveis de linfócitos B ocorre com infecções bacterianas e fúngicas agudas e crônicas, doenças hepáticas crônicas, doenças do tecido conjuntivo sistêmico, leucemia linfocítica crônica, mieloma.
• Determinação da concentração de imunoglobulinas não específicas (F, M, G, E) por simples imunodifusão radial, nefelometria ou turbometria, radioimunoensaio ou imunoensaio enzimático (ELISA). Normas para adultos: imunoglobulina (Ig) A 0,9-4,5 g / l. IgM 03-3,7 g / l. IgG 8,0-17 g / l. Um aumento na concentração de imunoglobulinas ocorre com as mesmas condições patológicas nas quais ocorre um aumento no conteúdo dos linfócitos B. A redução da concentração de imunoglobulinas ocorre com hipogamaglobulinemia congênita, neoplasias do sistema imunológico, remoção do baço, perda de proteína, doenças renais ou intestinais, tratamento com citostáticos e imunodepressivos.

Especificando métodos

• Determinação de complexos imunes circulantes no sangue por precipitação seletiva em polissileno glicol seguido de teste de densidade espectrofotométrica (80-20 UE normal). O aumento dos complexos imunes circulantes é característico de infecções bacterianas, fúngicas agudas, doenças autoimunes, imunocomplexas, doenças do soro, reações alérgicas do tipo 3;
• Determinação de imunoglobulinas específicas no sangue em relação aos antigénios bacterianos e virais, ácido desoxirribonucleico (DNA) em doenças auto-imunes, a identificação de esperma (infertilidade auto-imune) e anticorpos protivopochechnyh (pielonefrite e glomerulonefrite) por imunodifusão radial ou ELISA.
• Determinação de anticorpos antisperma no esperma [teste MAR (reação mista de antiglobulina)], a norma é negativa.
• Determinação da concentração de imunoglobulinas na urina para fins de diagnóstico diferencial entre pielonefrite e glomerulonefrite (seletividade da proteinúria).
• Determinação de IgE no suco da próstata para o diagnóstico de prostatite alérgica por imunodifusão radial ou ELISA. 
• Estudo da resposta na reação da transformação de explosão de linfócitos B para mitogênio de células B (mitogênio dos lakonos para estimular a reação da transformação por explosão de linfócitos B na presença de linfócitos T), cujo valor normativo é de 95-100%.

Ligação de células T de imunidade

Métodos de triagem

• Determinação do número relativo e absoluto de reacção de linfócitos T maduras CD3 por imunofluorescência ou fluir citofluorometria utilizando anti-SDZ anticorpos monoclonais. A norma para adultos é de 58-76% ou 1100-1700 células / μl. A diminuição do número de linfócitos T é um indicador da insuficiência da ligação celular da imunidade. Esta é uma característica de várias imunodeficiências primárias e secundárias (bacterianas e infecções virais crónicas: tuberculose, adquirida síndrome deficiência imunológica, cancro, insuficiência renal crónica, o trauma, o stress, envelhecimento, desnutrição, tratamento com drogas citotóxicas, radiação ionizante). Um aumento no número de linfócitos T ocorre contra um fundo de hiperatividade da imunidade ou em doenças linfoproliferativas. Com a inflamação, o número de linfócitos T primeiro aumenta, e depois diminui. A ausência de uma diminuição nos linfócitos T sugere cronização do processo inflamatório.
• Avaliação das subpopulações de linfócitos.
  • Determinação do número de T-helpers (anticorpo anti-CD4). Normalmente, 36-55% ou 400-1100 células / μl. Um aumento no número dessas células ocorre em doenças auto-imunes, doença de Waldenstrom, ativação da implantação de anti-enxertos; redução do número de células T-helper ocorre em, virais, infecções bacterianas crónicas por protozoários, a tuberculose, a síndrome da imunodeficiência adquirida, malignidades, queimaduras, trauma, má nutrição, envelhecimento, tratamento citostáticos, radiação ionizante.
  • Determinação do número de supressores de T (anticorpo anti-CD4). Normalmente, 17-37% ou 300-700 células / μl. Um aumento no número de supressores de T ocorre com as mesmas condições nas quais o número de ajudantes de T diminui e sua diminuição nas mesmas condições, quando o conteúdo de T-helpers aumenta.
  • Índice imunorregulador CD4 / CD8, na norma 1,5-2,5. Hiperatividade a taxas superiores a 2,5 (doenças alérgicas e auto-imunes); hipoatividade - menos de 1,0 (predisposição a infecções crônicas). No início do processo inflamatório, o índice imunorregulador sobe, e quando ele diminui, ele normaliza.

Especificando métodos

• Determinação do número de assassinos naturais (células NK) - anticorpos anti-CD16 e anti-CD56. A norma para os linfócitos CD 16 é 6-26%, CD56 - 9-19%. Um aumento no número de células NK ocorre com rejeição do enxerto, diminuição das infecções virais, doenças oncológicas, imunodeficiências primárias e secundárias, queimaduras, trauma e estresse, tratamento com citostáticos e exposição a radiações ionizantes. 
• Determinação do número de linfócitos T com o receptor para interleucina-2 (marcador de ativação) - anticorpos anti-CD25. A norma é de 10 a 15%. Um aumento no número deles é observado em doenças alérgicas, rejeição de transplantes, resposta a antígenos dependentes de timo no período agudo de infecção primária, diminuição nas mesmas doenças nas quais o número de células NK diminui.
• Exame da expressão do marcador de ativação - a molécula de histocompatibilidade da classe II HLA-DR. A expressão aumentada ocorre em processos inflamatórios, em pacientes com hepatite C, doença celíaca, sífilis, infecções respiratórias agudas.
• Avaliação da apoptose dos linfócitos. Uma indicação da disponibilidade de apoptose de linfócitos podem ser identificados pela sua expressão de superfície do receptor de Fas (CD95) e em mitocôndrias do BD-2 protooncogene. A apoptose foi avaliada pelo processamento dos linfócitos dois corantes fluorescentes: o iodeto de propídio, o qual se liga a fragmentos de ADN e anexina Y, se ligar a fosfatidilserina na membrana celular aparecendo em apoptose precoce. A avaliação dos resultados é realizada em um citofluorímetro de fluxo. O cálculo dos resultados baseia-se na proporção de células coradas com vários corantes. Células não coradas são células viáveis, associados unicamente com a anexina a Y, - os primeiros sinais de apoptose, com iodeto de propio e anexina I - manifestações tardios de apoptose, a coloração única iodeto de propio indica necrose.
• Avaliação da proliferação de linfócitos T in vitro.
  • A mudança na blastogênese celular é uma reação da transformação explosiva de linfócitos. Os leucócitos são incubados com qualquer mitógeno de origem vegetal (lectinas). Mais freqüentemente, uso de fitohemaglutinina por 72 horas, em seguida, faça um esfregaço, coloque-o e conte o número de explosões! O índice de estimulação é a proporção da porcentagem de células transformadas no experimento (cultura com fitohemaglutinina) para a porcentagem de células transformadas no controle (cultura sem fitohemaglutinina). A reação da transformação explosiva dos linfócitos pode ser avaliada pela inclusão de um rótulo radioativo (ZN-timidina) em células cultivadas, uma vez que a síntese de DNA aumenta ao dividir as células. Os distúrbios na resposta proliferativa ocorrem tanto nas imunodeficiências primárias e secundárias associadas a infecções, doenças oncológicas, insuficiência renal e intervenções cirúrgicas.
  • A avaliação destes estudos, a expressão dos marcadores de activação CD25 (receptor de transferrina, para - CD71) e moléculas de HLA-DR do MHC de classe II, que são substancialmente ausente em descanso linfócitos-T. Os linfócitos T são estimulados com fitohemaglutinina; após 3 dias, a expressão de marcadores de ativação é analisada por reação direta ou indireta de imunofluorescência, citometria de fluxo, utilizando anticorpos monoclonais para receptores secretos.
  • Medição do número de mediadores sintetizados por linfócitos T ativados [interleucina (IL) 2, IL-4, IL-5, IL-6, γ-interferão, etc.], por meio de radioimunoensaio ou ELISA. Especialmente importante é a avaliação da concentração de y-interferon e IL-4 como marcadores de TH e Th2 no sobrenadante de culturas ativadas e dentro da célula. Se possível, é útil determinar a expressão do gene para a citoquina correspondente pelo nível do ácido ribonucleico da matriz na célula produtora e a intensidade de expressão dos receptores para as citoquinas correspondentes.
    
• A reação da inibição da migração de linfócitos. Linfócitos T sensibilizados na reação com linfocinas de libertação de antígenos, incluindo fatores. Inibindo a migração de linfócitos. O fenômeno da inibição é observado quando os mitógenos são introduzidos na cultura das células. A avaliação do grau de inibição permite avaliar a capacidade dos linfócitos para liberar citocinas. Normalmente, a freqüência de migração, dependendo do mitógeno específico, é de 20 a 80%.
• Avaliação da citotoxicidade das células NK. Determine a capacidade das células assassinas naturais para matar células-alvo da linha eritromoelóide K-562. Se a citotoxicidade dependente de anticorpos for avaliada, são utilizadas células alvo revestidas com anticorpos IgG. As células alvo são marcadas com 3H-uridina e incubadas com células efectoras. A morte das células alvo é estimada a partir da liberação do rótulo radioativo na solução. A redução da citotoxicidade ocorre com neoplasias malignas. Em alguns casos, quando é necessário um prognóstico da eficácia do tratamento com interleucinas, a citotoxicidade das células NK é avaliada quando incubadas com certas citocinas.

Investigação da função dos fagócitos

Métodos de triagem

Investigação da absorção de células microbianas por fagocitos (fagocitose de partículas de látex, cultura de teste de estafilococos, Escherichia coli ou microorganismos isolados do paciente). Por centrifugação do sangue heparinizado, uma suspensão de leucócitos é isolada, o soro do grupo sanguíneo IV é adicionado para opsonização (as opsoninas são proteínas que melhoram a fagocitose). A suspensão microbiana é diluída, misturada com leucócitos e incubada durante 120 minutos, amostragem para análise após 30,90.120 min após o início da incubação. Das suspensões de leucócitos selecionadas fazem esfregaços. Determine os seguintes indicadores de fagocitose:

• índice fagocítico - a porcentagem de células que entraram na fagocitose em 30 min e 120 min de incubação; valor normativo do índice fagocítico (30) 94% do índice fagocítico (120) - 92%;
• número fagocítico - o número médio de bactérias que são intracelularmente; o valor normativo do número fagocítico (30) 11%, número fagocítico (120) - 9,8%;  
• coeficiente de número fagocítico - relação do número fagocítico (30) para o número fagocítico (120); normal 1,16;
• o índice bactericida de neutrófilos é a proporção do número de micróbios mortos dentro dos fagócitos para o número total de micróbios absorvidos; na norma de 66%.

Especificando métodos

• A investigação da atividade bactericida de fagócitos no teste com nitrosina tetrazólio (NST) é o teste NST. Para os leucócitos, adiciona-se corante de amarelo tetrazolio nitroso. Quando o corante é absorvido pelo neutrófilo, o processo de redução ocorre sob a ação de radicais livres de oxigênio, resultando em uma coloração azul. A reação é realizada em uma placa de 96 poços de fundo plano. Nos três primeiros poços com uma mistura de HCT e leucócitos, adiciona-se a solução de Hanks (HCT espontâneo), nas últimas partículas de látex; incubar a 37 ° C durante 25 minutos. Os resultados são lidos em 540 nm no leitor e expressados em unidades convencionais. Calcule o fator de estimulação (K _st ), igual à proporção de densidade óptica nos poços estimulados para a densidade óptica média nos poços sem estimulação. Em pessoas saudáveis, _{HCT spont} = 90 ± 45 UE, NST _Stim = 140 ± 60 UE. K _st = 1,78 ± 0,36.
• Investigação de moléculas de adesão. Com a ajuda da citotofluorimetria de fluxo, determina-se a expressão de antígenos de superfície CD11a / CD18, CD11b / CD18, CD11c / CD18. As imunodeficiências com violação da adesão são manifestadas por infecções recorrentes, cicatrização lenta de feridas e ausência de pus nos focos de infecção.

Investigação do sistema do complemento

Métodos de triagem

Determinação da atividade hemolítica do complemento - um estudo da via clássica da ativação do complemento. Diferentes diluições do soro do paciente e uma pessoa saudável são adicionados aos eritrócitos de uma ovelha revestida com anticorpos. Uma unidade de atividade hemolítica é tomada como inversa da diluição do soro, na qual 50% dos eritrócitos são destruídos. O grau de hemólise é avaliado fotométricamente pelo rendimento da hemoglobina na solução. A redução da atividade hemolítica do complemento é observada no lúpus eritematoso sistêmico com envolvimento renal, glomerulonefrite aguda. Imunodeficiências combinadas, miastenia gravis, hepatite viral, linfomas, aumento - com ictericia obstrutiva, tireoidite Hashimoto. Reumatismo, artrite reumatóide, periarterite nodular. Dermatomiosite, infarto do miocárdio, colite ulcerativa, síndrome de Reiter, gota.

Especificando métodos

• Determinação dos componentes do complemento. A determinação quantitativa é realizada pelo método de imunodifusão radial e nefelometria.
  O estudo não é informativo, a menos que as propriedades antigênicas dos componentes do complemento sejam alteradas.
• Verificou-se que o componente Clq do complemento melhora a fagocitose e medeia a citotoxicidade celular. Sua diminuição ocorre em doenças de complexos imunes, lúpus eritematoso sistêmico, infecções purulentas e tumores.
• O componente C3 participa da ativação da via do complemento clássico e alternativo. A redução da sua concentração está associada a infecções bacterianas e fúngicas crônicas, a presença de complexos imunes circulantes ou teciduais.
• O componente C4 participa da ativação da via clássica. A redução da sua concentração está associada a uma ativação prolongada do complemento com complexos imunes e a uma diminuição da concentração do inibidor C1, que controla a ativação da via do complemento clássico. A deficiência de C4 ocorre com lúpus eritematoso sistêmico, um aumento no C4 ocorre com doença renal, rejeição de transplantes, inflamação aguda e doenças do trato gastrointestinal.
• C5a é um pequeno fragmento da molécula C5, separada dela como resultado da ativação do sistema do complemento. O aumento da sua concentração ocorre com inflamação, sepse, doenças atópicas e alérgicas.
• O inibidor de Cl é um fator multifuncional. Ele controla a ativação do componente C1 do complemento, inibe a atividade de kalicreína, plasmina e Hageman do fator ativado, proteases Cls e Or. A deficiência de inibidor C1 conduz a angioedema.
• estudos complementares. Para o soro padrão sem componente de complemento, o soro de teste é adicionado e a atividade hemolítica do complemento é determinada. Se a atividade hemolítica não for restaurada ao normal, acredita-se que a atividade desse componente do complemento no soro de teste seja reduzida.

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