O papel das enzimas e citocinas na patogênese da osteoartrite

Nos últimos anos, uma grande pesquisa se concentrou na identificação de proteases responsáveis pela degradação de ECM de cartilagem articular na osteoartrite. De acordo com as idéias modernas, um papel importante na patogênese da osteoartrite é desempenhado pelas metaloproteases da matriz (MMP). Os pacientes com osteoartrite têm um nível aumentado de três representantes de MMP - colagenases, estromelisinas e gelatinases. A colagenase é responsável pela degradação do colágeno nativo, estromelisina - colágeno tipo IV, proteoglicanos e laminina, gelatinase para degradação de gelatina, tipos de colágeno IV, Vh XI, elastina. Além disso, a presença de outra enzima - aggrecanase, que tem as propriedades das MMPs e é responsável pela proteólise dos agregados de proteoglicanos cartilaginosos.

Foram identificados três tipos de colagenases na cartilagem articular da pessoa, cujo nível aumentou significativamente em pacientes com osteoartrite - colagenase-1 (MMP-1), colagenase-2 (MMP-8) e colagenase-3 (MMP-13). A coexistência de três diferentes tipos de colagenases na cartilagem articular indica que cada um deles desempenha seu próprio papel específico. Na verdade, as colagenases-1 e -2 estão localizadas principalmente na superfície e partes superiores da zona intermediária da cartilagem articular, enquanto a colagenase-3 é encontrada na parte inferior das zonas intermediárias e profundas. Além disso, os resultados do estudo imuno-histoquímico demonstraram que, durante a progressão da osteoartrite, o nível de colagenase-3 atinge um patamar e até diminui, enquanto o nível de colagenase-1 aumenta gradualmente. Há evidências de que, no caso da osteoartrite, a colagenase-1 está envolvida principalmente no processo inflamatório na cartilagem articular, enquanto que a colagenase-3 está envolvida na remodelação do tecido. A cartilagin-3, expressa na cartilagem de pacientes com OA, realiza a degradação do colágeno tipo II mais intensamente do que a colagenase-1.

Dos representantes do segundo grupo de metaloproteases, stromelisina, três-estromelisina-1 (MMP-3), estromelisina-2 (MMP-10) e estromelisina-3 (MMP-11) também foram identificados. Hoje é sabido que apenas a estromelisina-1 está envolvida no processo patológico na osteoartrite. Na membrana sinovial de pacientes com osteoartrite, a estromelisina-2 não é detectada, mas foi detectada em uma quantidade muito pequena em fibroblastos sinoviais em pacientes com artrite reumatóide. A estromelisina-3 também é encontrada na membrana sinovial de pacientes com artrite reumatóide perto dos fibroblastos, especialmente em zonas de fibrose.

No grupo gelatinase, apenas dois foram identificados no tecido da cartilagem humana: gelatinase de 92 kD (gelatinase B ou MMP-9) e gelatina a 72 kD (gelatinase A ou MMP-2); em pacientes com osteoartrite, é determinado um aumento no nível de gelatinase de 92 kD.

Não há muito tempo atrás, identificou-se outro grupo de MMPs que estão localizados na superfície das membranas celulares e são chamados de tipo de membrana MMP (MMP-MT). Para este grupo pertencem quatro enzimas - MMP-MT1-MMP-MT-4. A expressão de MMP-MT é encontrada na cartilagem articular humana. Embora o MMP-MT-1 possua as propriedades da colagenase, tanto MMP-MT-1 como MMP-MT-2 são capazes de ativar a gelatinase-72 kD e colagenase-3. O papel desse grupo de MMP na patogênese da OA requer refinamento.

As proteinases são segregadas sob a forma de um zimogénio, que é ativado por outras proteinases ou compostos orgânicos de mercúrio. A atividade catalítica da MMP depende da presença de zinco na zona ativa da enzima.

A atividade biológica da MMP é controlada por TIMP específicos. Até à data, três tipos de TIMP foram identificados nos tecidos articulares humanos, TIMP-1-TIMP-3. O quarto tipo de TIMP é identificado e clonado, mas ainda não foi detectado nos tecidos articulares humanos. Essas moléculas se ligam especificamente ao local ativo da MMP, embora algumas delas possam ligar o centro ativo de gelatinase de 72 kD (TIMP-2, -3, -4) e gelatinase de 92 kD (TIMP-2, -3, -4) e de gelatinase de 92 kD (TIMP-1 e -3). Os dados indicam que, com OA na cartilagem articular, há um desequilíbrio entre MMP e TIMP, o que resulta em uma deficiência relativa de inibidores, o que pode ser em parte devido ao aumento do nível de MMP ativa no tecido. TIMP-1 e -2 são encontrados na cartilagem articular, são sintetizados por condrócitos. Com osteoartrite na membrana sinovial e fluido sinovial, apenas o primeiro tipo de TIMP foi detectado. O TIMP-3 é detectado exclusivamente no ECM. TIMP-4 tem uma sequência de aminoácidos idêntica com TIMP-2 e-ZIN de quase US $ 38% -STIMP-1 em quase 50%. Em outras células alvo, o TIMP-4 é responsável pela modulação da ativação de progestogênase de 72 kD na superfície celular, o que indica um papel importante como um regulador específico do tecido do remodelamento ECM.

Outro mecanismo para controlar a atividade biológica de MMP é a ativação fisiológica deles. Acredita-se que enzimas da família de serina e proteases de cisteína, como AP / plasmina e catepsina B, respectivamente, são ativadores fisiológicos de MMP. Na cartilagem articular de pacientes com osteoartrite, foi detectado um nível elevado de uroquinase (UAP) e plasmina.

Apesar do fato de que vários tipos de catepsinas são encontradas nos tecidos das articulações, a catepsina-B é considerada o ativador mais provável da MMP na cartilagem. Nos tecidos da articulação humana, foram detectados inibidores fisiológicos de serina e cisteína proteases. A atividade do inibidor AP-1 (IAP-1), bem como cisteína proteases, é reduzida em pacientes com osteoartrite. Da mesma forma que o MMP / TIMP, é o desequilíbrio entre as proteases de serina e cisteína e seus inibidores que podem explicar o aumento da atividade da MMP na cartilagem articular de pacientes com osteoartrite. Além disso, as MMPs podem se ativar. Por exemplo, a estromelisina-1 activa colagenase-1, colagenase-3 e gelatinase 92 kD; A colagenase-3 activa a gelatinase de 92 kD; A MMP-MT activa a colagenase-3 e a gelatinase-72 kD potencia esta ativação; O MMP-MT também ativa a gelatinase de 72 kD. As citoquinas podem ser divididas em três grupos - destrutivos (pró-inflamatórios), reguladores (incluindo anti-inflamatórios) e anabolizantes (fatores de crescimento).

Tipos de citocinas (de acordo com van den Berg WB et al)

Destrutiva	Interleucina-1 TNF-a Fator Inibitório Leucêmico Interleucina-17
Regulamentar	Interlekin-4 Interleucina-10 Interleucina-13 Inibidores de enzimas
Anabólico	Fatores de crescimento semelhantes a Msulin TGF-b Proteínas morfogenéticas do osso Proteínas morfogenéticas derivadas da cartilagem

As citoquinas destrutivas, em particular a IL-1, induzem um aumento na liberação de proteases e inibem a síntese de proteoglicanos e colágenos por condrócitos. As citocinas reguladoras, em particular a IL-4 e -10, inibem a produção de IL-1, aumentam a produção do antagonista dos receptores de IL-1 (IL-1 RA) e reduzem o nível de NO-sintase em condrócitos. Assim, a IL-4 neutraliza a IL-1 de três maneiras: 1) reduz a produção, evita seus efeitos, 2) aumenta a produção do principal "scavenger" IL-1RA e 3) reduz a produção do principal "mensageiro" NO. Além disso, a IL-4 reduz a degradação enzimática do tecido. Sob condições in vivo efeito terapêutico óptimo é conseguida com combinações de IL-4 e IL-10. Factores anabólicos, tais kakTFR-p e IGF-1, não se interferir com a produção ou acção de IL-1, mas que mostra a actividade oposta, por exemplo, estimulam a síntese de proteoglicanos e colagénio, inibir a actividade de protease e o TGF (3, também inibe a libertação de enzimas e estimula seus inibidores.

As citocinas pró-inflamatórias são responsáveis pelo aumento da síntese e expressão de MMP nos tecidos das articulações. Eles são sintetizados na membrana sinovial e, em seguida, difundem para dentro da cartilagem articular através do líquido sinovial. As citocinas pró-inflamatórias ativam os condrócitos, que por sua vez também são capazes de produzir citoquinas pró-inflamatórias. Nas articulações afetadas pela osteoartrose, o papel do efetor da inflamação é desempenhado principalmente pelas células da membrana sinovial. É a sinovite do tipo macrófago que secreta proteases e mediadores inflamatórios. Entre eles, na patogênese da osteoartrite, IL-f, TNF-a, IL-6, fator inibidor leucêmico (LIF) e IL-17 estão envolvidos na maior extensão.

Substâncias biologicamente ativas que estimulam a degradação da cartilagem articular na osteoartrite

• Interleucina-1
• Interlekin-3
• Interlekin-4
• TNF-a
• Fatores estimulantes de colônias: macrófagos (monocíticos) e granulócitos-macrófagos
• Substância P
• PGE ₂
• Ativadores de plasminogênio (tipos de tecido e uroquinase) e plasmina
• Metaloproteases (colagenases, ellastases, stromelisins)
• Cathepsins A e B
• Suspense
• Lipopolissacarídeos bacterianos
• Fosfolipase Ag

Os dados da literatura indicam que a IL-ip e, possivelmente, o TNF-a, são os principais mediadores da destruição dos tecidos articulares na osteoartrite. No entanto, ainda não se sabe se eles operam independentemente uns dos outros ou há uma hierarquia funcional entre eles. Nos modelos de osteoartrose em animais, demonstrou-se que o bloqueio da IL-1 efetivamente evita a destruição da cartilagem articular, enquanto o bloqueio do TNF-α leva apenas a uma diminuição da inflamação nos tecidos da articulação. Na membrana sinovial, líquido sinovial e cartilagem dos pacientes, foram detectadas concentrações aumentadas de ambas as citoquinas. Nos condrócitos, eles são capazes de aumentar a síntese de não só proteases (principalmente MMP e AP), mas também colágenos menores, por exemplo, tipos I e III, e também reduzir a síntese de colágenos e proteoglicanos tipo II e IX. Essas citocinas também estimulam espécies de oxigênio ativo e mediadores inflamatórios como PGE ₂. O resultado de tais alterações macromoleculares na cartilagem articular com osteoartrite é a ineficiência dos processos de reparação, o que leva a uma maior degradação da cartilagem.

As citocinas pró-inflamatórias acima mencionadas modulam os processos de inibição / ativação de MMP na osteoartrite. Por exemplo, o desequilíbrio entre os níveis de TIMP-1 e MMP na cartilagem em osteoartrite pode ser mediada por IL-ip, porque o estudo in vitro demonstraram que concentrações crescentes de IL-1 beta reduz a concentração de TIMP-1 e MMP síntese aumentada pelos condrócitos. A síntese de AP também é modulada por IL-1beta. A estimulação de condrócitos de cartilagem articular in vitro utilizando IL-1 provoca um aumento dose-dependente na síntese de AP e uma diminuição acentuada na síntese de IAP-1. A capacidade da IL-1 para reduzir a síntese de IAP-1 e estimular a síntese de AP é um poderoso mecanismo para a geração de plasmina e a ativação de MMP. Além disso, a plasmina não é apenas uma enzima que ativa outras enzimas, também faz parte do processo de degradação da cartilagem por proteólise direta.

IL-ip é sintetizado como um precursor inativo com uma massa de 31 kD (pré-IL-ip) e, após a clivagem do péptido sinal, é convertido em uma citocina activa com uma massa de 17,5 kDa. Nos tecidos das articulações, incluindo a membrana sinovial e líquido sinovial de cartilagem articular, a IL-ip detectado na forma activa, e em estudos in vivo demonstraram a capacidade da membrana sinovial de osteoartrite segregam dessa citocina. Algumas serina proteases são capazes de converter pré-IL-ip em sua forma bioativa. Nos mamíferos, tais propriedades são encontradas apenas em uma protease, que pertence à família de enzimas específicas de cateteina aspartato e é chamada de enzima conversora de IL-1p (ICP ou caspase-1). Esta enzima é capaz de converter especificamente pré-IL-ip em uma IL-ip "madura" biologicamente ativa com uma massa de 17,5 kD. IKF é uma proenzima com uma massa molecular de 45 kD (p45), que está localizada na membrana celular. Após a clivagem proteolítica da proenzima p45 para formar duas subunidades, conhecidas como p10 e p20, que são caracterizadas por atividade enzimática.

O TNF-a também é sintetizado como um precursor ligado à membrana com uma massa de 26 kD; por clivagem proteolítica, é liberada da célula como uma forma solúvel ativa com uma massa de 17 kD. A clivagem proteolítica é realizada pela enzima conversora de TNF-a (TNF-KF), que pertence à família das adamalinsinas. AR Amin e co-autores (1997) encontraram maior expressão de mRNA de TNF-CF na cartilagem articular de pacientes com osteoartrite.

A ativação biológica de condrócitos e sinovitócitos IL-1 e TNF-a é mediada pela ligação a receptores específicos na superfície das células - IL-R e TNF-R. Para cada citocina, foram identificados dois tipos de receptores: IL-IP dos tipos I e II e TNF-P I (p55) e II (p75). Para a transmissão de sinais nas células dos tecidos das articulações, IL-1PI e p55 respondem. IL-1P tipo I tem uma afinidade ligeiramente maior para IL-1beta do que para IL-1a; IL-1P tipo II - pelo contrário, tem maior afinidade para IL-1a do que para IL-ip. Ainda não está claro se IL-IP II tipo II pode mediar os sinais IL-1 ou serve apenas para inibir competitivamente a ligação IL-1 ao tipo IL-1PI. Em chondroits e fibroblastos sinoviais em pacientes com osteoartrite, um grande número de IL-1PI e p55 são encontrados, o que, por sua vez, explica a alta sensibilidade dessas células à estimulação com citoquinas apropriadas. Este processo leva tanto a um aumento na secreção de enzimas proteolíticas quanto à destruição da cartilagem articular.

Não se exclui a participação da IL-6 no processo patológico na osteoartrite. Este pressuposto baseia-se nas seguintes observações:

• IL-6 aumenta o número de células inflamatórias na membrana sinovial,
• IL-6 estimula a proliferação de condrócitos,
• A IL-6 aumenta os efeitos da IL-1 no aumento da síntese de MMP e inibe a síntese de proteoglicanos.

No entanto, a IL-6 é capaz de induzir a produção de TIMP, mas não afeta a produção de MMP, portanto, acredita-se que essa citoquina particular participe em dissuadir a degradação proteolítica da cartilagem articular, que é realizada pelo mecanismo de feedback.

Outro representante da família IL-6 é a citocicina LIF, que é produzida por condrócitos obtidos de pacientes com osteoartrite, em resposta à estimulação de citoquinas proinflamatórias IL-ip e TNF-a. LIF estimula a reabsorção de proteoglicanos de cartilagem, bem como a síntese de MMP e produção de NO. O papel desta citocina na osteoartrite não é totalmente compreendido.

IL-17 é um homodímero de 20-30 kD com ação semelhante a IL-1, mas muito menos pronunciado. A IL-17 estimula a síntese e o isolamento de uma série de citocinas pró-inflamatórias, incluindo IL-ip, TNF-a, IL-6 e MMP em células alvo, por exemplo, em macrófagos humanos. Além disso, IL-17 estimula a produção de NO com condrócitos. Como o LIF, o papel da IL-17 na patogênese da OA tem sido pouco estudado.

O radical livre inorgânico NO desempenha um papel importante na degradação da cartilagem articular com OA. Os condrócitos obtidos de pacientes com osteoartrite produzem mais NO tão espontaneamente quanto após a estimulação com citocinas pró-inflamatórias em comparação com as células normais. Um alto teor de NO é encontrado no líquido sinovial e soro de pacientes com osteoartrite - o resultado do aumento da expressão e síntese da NO sintase induzida (hNOC), uma enzima responsável pela produção de NO. Recentemente, o DNA de hNOC específico de condrócito foi clonado, a sequência de aminoácidos da enzima foi determinada. A sequência de aminoácidos indica uma identidade de 50% e 70% de similaridade ao hNOC específico para o endotélio e tecido neural.

NÃO inibe a síntese de macromoléculas de ECM de cartilagem articular e estimula a síntese de MMP. Além disso, um aumento na produção de NO é acompanhado por uma diminuição na síntese do antagonista IL-IP (IL-1RA) por condrócitos. Assim, um aumento no nível de IL-1 e uma diminuição da RA de IL-1 conduz a hiperestimulação de condrócitos de NO, o que, por sua vez, leva a uma maior degradação da matriz da cartilagem. Houve relatos de um efeito terapêutico in vivo de um inibidor seletivo de hNOC na progressão da osteoartrite experimental.

Os inibidores de citoquinas naturais podem inibir diretamente a ligação das citocinas aos receptores das membranas celulares, reduzindo sua atividade pró-inflamatória. Os inibidores naturais das citocinas podem ser divididos em três classes de acordo com seu modo de ação.

A primeira classe de inibidores inclui antagonistas de receptores, que impedem a ligação do ligando ao seu receptor pela competição pelo local de ligação. Até à data, esse inibidor é encontrado apenas para IL-1 - este é o inibidor competitivo acima mencionado do sistema de IL-1 IL-1 PA IL-1. A IL-1 RA bloqueia muitos dos efeitos observados nos tecidos das articulações na osteoartrite, incluindo síntese de prostaglandinas por células sinoviais, produção de colagenase por condrócitos e degradação do CM na cartilagem articular.

A IL-1PA é detectada de várias formas - uma solúvel (rIL-1PA) e duas intercelulares (μIL-lPAI e μIL-1APAP). A afinidade da forma solúvel de IL-1RA é 5 vezes maior que a das formas intercelulares. Apesar da intensa busca científica, a função do último permanece desconhecida. Experimentos in vitro mostraram que, para inibir a atividade de IL-1bet, é necessária a concentração de IL-1PA, 10-100 vezes maior que o normal , in vivo, é necessário um aumento de mil vezes na concentração de IL-1PA. Esse fato pode explicar parcialmente a deficiência relativa de IL-1 RA e o excesso de IL-1 na sinóvia de pacientes com osteoartrite.

A segunda classe de inibidores naturais de citoquinas é representada por receptores solúveis de citoquinas. Um exemplo de tais inibidores em humanos relacionados à patogênese da osteoartrose é pIL-1P e pp55. Os receptores de citoquinas solúveis são formas truncadas de receptores normais, que se ligam a citocinas, interferem com a sua ligação a receptores associados às membranas de células alvo, atuando pelo mecanismo de antagonismo competitivo.

O principal precursor de receptores solúveis é IL-1PP ligado à membrana. A afinidade de RIL-IP com respeito a IL-1 e IL-1 PA é diferente. Assim, a pIL-1PH tem uma maior afinidade para IL-1p do que para IL-1 PA e pIL-1PI mostra uma maior afinidade para IL-1RA do que para IL-ip.

Para o TNF também existem dois tipos de receptores solúveis - pp55 e pp75, como os receptores IL-1 solúveis, eles são formados por "sheeding" (dumping). In vivo, ambos os receptores são encontrados nos tecidos das articulações afetadas. O papel dos receptores de TNF solúveis na patogênese da osteoartrite é debatido. Sugere-se que, em baixas concentrações, estabilizem a estrutura tridimensional do TNF e aumentam a meia-vida da citoquina bioativa, enquanto altas concentrações de pp55 e pp75 podem reduzir a atividade de TNF através do antagonismo competitivo. Aparentemente, pp75 pode atuar como um portador de TNF, facilitando a sua ligação ao receptor associado à membrana.

A terceira classe de inibidores naturais das citocinas é representada por um grupo de citocinas anti-inflamatórias, que incluem TGF-beta, IL-4, IL-10 e IL-13. As citocinas anti-inflamatórias reduzem a produção de pró-inflamatórios, bem como algumas proteases, estimulam a produção de IL-1RA e TIMP.