Papel das enzimas e das citocinas na patogénese da osteoartrite

Nos últimos anos, muita atenção dos pesquisadores tem sido dada à identificação de proteases responsáveis pela degradação da matriz extracelular (MEC) da cartilagem articular na osteoartrose. De acordo com conceitos modernos, as metaloproteases da matriz (MMPs) desempenham um papel importante na patogênese da osteoartrose. Em pacientes com osteoartrose, um nível aumentado de três MMPs é detectado - colagenases, estromelisinas e gelatinases. A colagenase é responsável pela degradação do colágeno nativo, a estromelisina - colágeno tipo IV, proteoglicanos e laminina, gelatinase - pela degradação da gelatina, colágenos tipos IV, Vh XI, elastina. Além disso, presume-se a presença de outra enzima - a agrecanase, que possui as propriedades das MMPs e é responsável pela proteólise de agregados de proteoglicanos cartilaginosos.

Três tipos de colagenases foram identificados na cartilagem articular humana, cujos níveis são significativamente elevados em pacientes com osteoartrite: colagenase-1 (MMP-1), colagenase-2 (MMP-8) e colagenase-3 (MMP-13). A coexistência de três tipos diferentes de colagenases na cartilagem articular sugere que cada uma delas desempenha seu próprio papel específico. De fato, as colagenases-1 e -2 estão localizadas principalmente na zona intermediária superficial e superior da cartilagem articular, enquanto a colagenase-3 é encontrada na zona intermediária inferior e na zona profunda. Além disso, os resultados do estudo imuno-histoquímico demonstraram que, à medida que a osteoartrite progride, o nível de colagenase-3 atinge um platô e até diminui, enquanto o nível de colagenase-1 aumenta gradualmente. Há evidências de que, na osteoartrite, a colagenase-1 está envolvida principalmente no processo inflamatório na cartilagem articular, enquanto a colagenase-3 está envolvida na remodelação do tecido. A colagenase-3, expressa na cartilagem de pacientes com OA, degrada o colágeno tipo II mais intensamente do que a colagenase-1.

Dos representantes do segundo grupo de metaloproteases, três também foram identificadas na estromelisina humana: estromelisina-1 (MMP-3), estromelisina-2 (MMP-10) e estromelisina-3 (MMP-11). Atualmente, sabe-se que apenas a estromelisina-1 está envolvida no processo patológico da osteoartrose. A estromelisina-2 não é detectada na membrana sinovial de pacientes com osteoartrose, mas é encontrada em quantidades muito pequenas nos fibroblastos sinoviais de pacientes com artrite reumatoide. A estromelisina-3 também é encontrada na membrana sinovial de pacientes com artrite reumatoide, próxima aos fibroblastos, especialmente em zonas de fibrose.

No grupo das gelatinases no tecido cartilaginoso humano, apenas duas foram identificadas: gelatinase de 92 kD (gelatinase B, ou MMP-9) e gelatinase de 72 kD (gelatinase A, ou MMP-2); em pacientes com osteoartrite, é determinado um aumento no nível de gelatinase de 92 kD.

Recentemente, foi identificado outro grupo de MMPs localizadas na superfície das membranas celulares, denominadas MMPs do tipo membrana (MMP-MT). Este grupo inclui quatro enzimas: MMP-MT1 e MMP-MT-4. A expressão de MMP-MT foi encontrada na cartilagem articular humana. Embora a MMP-MT-1 tenha propriedades de colagenase, ambas as enzimas, MMP-MT-1 e MMP-MT-2, são capazes de ativar a gelatinase-72 kDa e a colagenase-3. O papel deste grupo de MMPs na patogênese da osteoartrite ainda precisa ser esclarecido.

As proteinases são secretadas na forma de um zimogênio, que é ativado por outras proteinases ou compostos orgânicos de mercúrio. A atividade catalítica das MMPs depende da presença de zinco na zona ativa da enzima.

A atividade biológica das MMPs é controlada por TIMPs específicos. Até o momento, três tipos de TIMPs foram identificados e encontrados em tecidos articulares humanos: TIMP-1–TIMP-3. Um quarto tipo de TIMP foi identificado e clonado, mas ainda não foi detectado em tecidos articulares humanos. Essas moléculas se ligam especificamente ao sítio ativo das MMPs, embora algumas delas sejam capazes de se ligar ao sítio ativo da progelatinase de 72 kD (TIMP-2, -3, -4) e da progelatinase de 92 kD (TIMP-1 e -3). Evidências sugerem que, na OA, há um desequilíbrio entre MMPs e TIMPs na cartilagem articular, resultando em uma deficiência relativa de inibidores, possivelmente devido, em parte, a um aumento no nível de MMPs ativas no tecido. TIMP-1 e -2 são encontrados na cartilagem articular e são sintetizados por condrócitos. Na osteoartrose, apenas o TIMP tipo I é detectado na membrana sinovial e no líquido sinovial. O TIMP-3 é encontrado exclusivamente na MEC. O TIMP-4 compartilha quase 50% de sua sequência de aminoácidos com o TIMP-2 e 38% com o TIMP-1. Em outras células-alvo, o TIMP-4 é responsável por modular a ativação da progelatinase de 72 kD na superfície celular, indicando um papel importante como regulador específico do tecido da remodelação da MEC.

Outro mecanismo para controlar a atividade biológica das MMPs é sua ativação fisiológica. Acredita-se que enzimas da família das serina e cisteína proteases, como AP/plasmina e catepsina B, respectivamente, sejam ativadores fisiológicos das MMPs. Níveis elevados de uroquinase (uAP) e plasmina foram encontrados na cartilagem articular de pacientes com osteoartrite.

Apesar de vários tipos de catepsinas serem encontrados nos tecidos articulares, a catepsina-B é considerada o ativador mais provável das MMPs na cartilagem. Inibidores fisiológicos de serina e cisteína proteases foram encontrados em tecidos articulares humanos. A atividade do inibidor de AP-1 (IAI-1), bem como das cisteína proteases, é reduzida em pacientes com osteoartrite. Semelhante a MMP/TIMP, é o desequilíbrio entre serina e cisteína proteases e seus inibidores que pode explicar o aumento da atividade das MMPs na cartilagem articular de pacientes com osteoartrite. Além disso, as MMPs são capazes de se ativar mutuamente. Por exemplo, a estromelisina-1 ativa a colagenase-1, a colagenase-3 e a gelatinase de 92 kD; a colagenase-3 ativa a gelatinase de 92 kD; a MMP-MT ativa a colagenase-3 e a gelatinase de 72 kDa potencializa essa ativação; a MMP-MT também ativa a gelatinase de 72 kDa. As citocinas podem ser divididas em três grupos: destrutivas (inflamatórias), reguladoras (incluindo anti-inflamatórias) e anabólicas (fatores de crescimento).

Tipos de citocinas (de acordo com van den Berg WB et al)

Destrutivo	Interleucina-1 TNF-a Fator inibidor de leucemia Interleucina-17
Regulatório	Interleucina-4 Interleucina-10 Interleucina-13 Inibidores enzimáticos
Anabólico	Fatores de crescimento semelhantes à insulina TGF-b Proteínas morfogenéticas ósseas Proteínas morfogenéticas derivadas da cartilagem

Citocinas destrutivas, em particular a IL-1, induzem um aumento na liberação de proteases e inibem a síntese de proteoglicanos e colágenos pelos condrócitos. Citocinas reguladoras, em particular a IL-4 e a -10, inibem a produção de IL-1, aumentam a produção do antagonista do receptor de IL-1 (IL-1RA) e reduzem o nível de NO sintase nos condrócitos. Assim, a IL-4 neutraliza a IL-1 em três direções: 1) reduz a produção, prevenindo seus efeitos; 2) aumenta a produção do principal "descarregador" IL-1RA; e 3) reduz a produção do principal "mensageiro" secundário, o NO. Além disso, a IL-4 reduz a degradação enzimática do tecido. In vivo, o efeito terapêutico ideal é alcançado com uma combinação de IL-4 e IL-10. Fatores anabólicos como TGF-β e IGF-1 não interferem de fato na produção ou ação da IL-1, mas exibem atividade oposta, por exemplo, estimulando a síntese de proteoglicanos e colágeno, suprimindo a atividade de proteases, e o TGF-β também inibe a liberação de enzimas e estimula seus inibidores.

As citocinas pró-inflamatórias são responsáveis pelo aumento da síntese e expressão de MMPs nos tecidos articulares. São sintetizadas na membrana sinovial e, em seguida, difundem-se para a cartilagem articular através do líquido sinovial. As citocinas pró-inflamatórias ativam os condrócitos, que por sua vez também são capazes de produzir citocinas pró-inflamatórias. Nas articulações afetadas pela osteoartrose, o papel do efetor da inflamação é desempenhado principalmente pelas células da membrana sinovial. São os sinovócitos do tipo macrófago que secretam proteases e mediadores inflamatórios. Entre eles, IL-f, TNF-a, IL-6, fator inibidor de leucemia (LIF) e IL-17 são os mais "envolvidos" na patogênese da osteoartrose.

Substâncias biologicamente ativas que estimulam a degradação da cartilagem articular na osteoartrite

• Interleucina-1
• Interleucina-3
• Interleucina-4
• TNF-a
• Fatores estimuladores de colônias: macrófago (monócito) e granulócito-macrófago
• Substância P
• PGE ₂
• Ativadores de plasminogênio (tipos tecidual e uroquinase) e plasmina
• Metaloproteases (colagenases, elastases, estromelisinas)
• Catepsinas A e B
• Trilsin
• Lipopolissacarídeos bacterianos
• Fosfolipase Ag

Dados da literatura indicam que a IL-1 e, possivelmente, o TNF-a são os principais mediadores da destruição do tecido articular na osteoartrose. No entanto, ainda não se sabe se eles agem independentemente um do outro ou se há uma hierarquia funcional entre eles. Modelos animais de osteoartrose mostraram que o bloqueio da IL-1 previne efetivamente a destruição da cartilagem articular, enquanto o bloqueio do TNF-a leva apenas a uma diminuição da inflamação nos tecidos articulares. Concentrações aumentadas de ambas as citocinas foram encontradas na membrana sinovial, no líquido sinovial e na cartilagem dos pacientes. Nos condrócitos, elas são capazes de aumentar a síntese não apenas de proteases (principalmente MMP e AP), mas também de colágenos menores, como os tipos I e III, e reduzir a síntese de colágenos tipos II e IX e proteoglicanos. Essas citocinas também estimulam espécies reativas de oxigênio e mediadores inflamatórios, como a PGE2 _. O resultado dessas alterações macromoleculares na cartilagem articular na osteoartrite é a ineficácia dos processos reparativos, o que leva a uma maior degradação da cartilagem.

As citocinas pró-inflamatórias mencionadas acima modulam os processos de supressão/ativação de MMP na osteoartrose. Por exemplo, o desequilíbrio entre os níveis de TIMP-1 e MMP na cartilagem na osteoartrose pode ser mediado pela IL-1, uma vez que um estudo in vitro demonstrou que um aumento nas concentrações de IL-1 beta leva a uma diminuição nas concentrações de TIMP-1 e a um aumento na síntese de MMP pelos condrócitos. A síntese de PA também é modulada pela IL-1 beta. A estimulação in vitro de condrócitos da cartilagem articular com IL-1 causa um aumento dose-dependente na síntese de PA e uma diminuição acentuada na síntese de iAP-1. A capacidade da IL-1 de diminuir a síntese de iAP-1 e estimular a síntese de PA é um mecanismo potente para a geração de plasmina e ativação de MMP. Além disso, a plasmina não é apenas uma enzima que ativa outras enzimas, ela também participa do processo de degradação da cartilagem por proteólise direta.

A IL-ip é sintetizada como um precursor inativo com massa de 31 kD (pré-IL-ip) e, após a clivagem do peptídeo sinal, é convertida em uma citocina ativa com massa de 17,5 kD. Nos tecidos articulares, incluindo a membrana sinovial, o líquido sinovial e a cartilagem articular, a IL-ip é encontrada na forma ativa, e estudos in vivo demonstraram a capacidade da membrana sinovial na osteoartrose de secretar essa citocina. Algumas serina proteases são capazes de converter a pré-IL-ip em sua forma bioativa. Em mamíferos, tais propriedades foram encontradas em apenas uma protease, que pertence à família de enzimas específicas do aspartato de cisteína e é chamada de enzima conversora de IL-1β (ICF, ou caspase-1). Essa enzima é capaz de converter especificamente a pré-IL-ip em IL-ip "madura" biologicamente ativa com massa de 17,5 kD. O ICF é uma proenzima de 45 kD (p45) localizada na membrana celular. Após a clivagem proteolítica da proenzima p45, são formadas duas subunidades conhecidas como p10 e p20, caracterizadas pela atividade enzimática.

O TNF-a também é sintetizado como um precursor ligado à membrana com massa de 26 kDa; por clivagem proteolítica, é liberado da célula como uma forma solúvel ativa com massa de 17 kDa. A clivagem proteolítica é realizada pela enzima conversora de TNF-a (TNF-AC), que pertence à família da adamalizina. AR Amin et al. (1997) encontraram aumento da expressão do mRNA do TNF-AC na cartilagem articular de pacientes com osteoartrite.

A ativação biológica de condrócitos e sinovócitos por IL-1 e TNF-α é mediada pela ligação a receptores específicos na superfície celular – IL-R e TNF-α. Dois tipos de receptores foram identificados para cada citocina – IL-IP tipos I e II e TNF-R tipos I (p55) e II (p75). IL-1PI e p55 são responsáveis pela transmissão de sinais em células do tecido articular. O IL-1R tipo I tem afinidade ligeiramente maior por IL-1β do que por IL-1a; o IL-1R tipo II, por outro lado, tem afinidade maior por IL-1a do que por IL-β. Ainda não está claro se a IL-IP tipo II pode mediar os sinais de IL-1 ou se serve apenas para a inibição competitiva da associação de IL-1 com o IL-1R tipo I. Condroitídeos e fibroblastos sinoviais de pacientes com osteoartrose contêm grandes quantidades de IL-1IP e p55, o que, por sua vez, explica a alta sensibilidade dessas células à estimulação pelas citocinas correspondentes. Esse processo leva ao aumento da secreção de enzimas proteolíticas e à destruição da cartilagem articular.

O envolvimento da IL-6 no processo patológico da osteoartrite não pode ser descartado. Essa suposição se baseia nas seguintes observações:

• A IL-6 aumenta o número de células inflamatórias na membrana sinovial,
• A IL-6 estimula a proliferação de condrócitos,
• A IL-6 potencializa os efeitos da IL-1 no aumento da síntese de MMP e na inibição da síntese de proteoglicanos.

Entretanto, a IL-6 é capaz de induzir a produção de TIMPs, mas não afeta a produção de MMPs, por isso acredita-se que essa citocina esteja envolvida no processo de inibição da degradação proteolítica da cartilagem articular, que é realizada por um mecanismo de feedback.

Outro membro da família da IL-6 é o LIF, uma citocina produzida por condrócitos obtidos de pacientes com osteoartrose em resposta à estimulação pelas citocinas pró-inflamatórias IL-1β e TNF-α. O LIF estimula a reabsorção de proteoglicanos da cartilagem, bem como a síntese de MMPs e a produção de NO. O papel dessa citocina na osteoartrose ainda não foi totalmente elucidado.

A IL-17 é um homodímero de 20-30 kD com efeito semelhante ao da IL-1, porém muito menos pronunciado. A IL-17 estimula a síntese e a liberação de diversas citocinas pró-inflamatórias, incluindo IL-1β, TNF-α, IL-6 e MMP em células-alvo, como macrófagos humanos. Além disso, a IL-17 estimula a produção de NO pelos condrócitos. Assim como o LIF, o papel da IL-17 na patogênese da OA tem sido pouco estudado.

O radical livre inorgânico NO desempenha um papel importante na degradação da cartilagem articular na osteoartrite. Condrócitos isolados de pacientes com osteoartrite produzem maiores quantidades de NO, tanto espontaneamente quanto após estimulação com citocinas pró-inflamatórias, em comparação com células normais. Altos teores de NO foram encontrados no líquido sinovial e no soro de pacientes com osteoartrite - isso é resultado do aumento da expressão e síntese da NO sintase induzida (hNOC), a enzima responsável pela produção de NO. Recentemente, o DNA da hNOC específica de condrócitos foi clonado e a sequência de aminoácidos da enzima foi determinada. A sequência de aminoácidos indica 50% de identidade e 70% de similaridade com a hNOC específica para endotélio e tecido nervoso.

O NO inibe a síntese de macromoléculas da MEC da cartilagem articular e estimula a síntese de MMP. Além disso, um aumento na produção de NO é acompanhado por uma diminuição na síntese do antagonista da IL-IP (IL-1RA) pelos condrócitos. Assim, um aumento nos níveis de IL-1 e uma diminuição nos níveis de IL-1RA levam à hiperestimulação de NO nos condrócitos, o que, por sua vez, leva ao aumento da degradação da matriz da cartilagem. Há relatos do efeito terapêutico in vivo de um inibidor seletivo de hNOC na progressão da osteoartrose experimental.

Os inibidores naturais de citocinas são capazes de impedir diretamente a ligação das citocinas aos receptores da membrana celular, reduzindo sua atividade pró-inflamatória. Eles podem ser divididos em três classes com base em seu modo de ação.

A primeira classe de inibidores inclui antagonistas de receptores que impedem a ligação do ligante ao seu receptor, competindo pelo sítio de ligação. Até o momento, tal inibidor foi encontrado apenas para IL-1 – trata-se do inibidor competitivo do sistema IL-1/ILIP, IL-1 PA, já mencionado. A IL-1 PA bloqueia muitos efeitos observados nos tecidos articulares na osteoartrite, incluindo a síntese de prostaglandinas pelas células sinoviais, a produção de colagenase pelos condrócitos e a degradação da membrana basal da cartilagem articular.

O IL-1RA é encontrado em diferentes formas: uma solúvel (rIL-1RA) e duas intercelulares (μIL-lPAI e μIL-1RAP). A afinidade da forma solúvel do IL-1RA é cinco vezes maior do que a das formas intercelulares. Apesar da intensa pesquisa científica, a função desta última permanece desconhecida. Experimentos in vitro demonstraram que a inibição da atividade do IL-1beta requer uma concentração de IL-1RA 10 a 100 vezes maior que o normal, enquanto condições in vivo exigem um aumento de mil vezes na concentração de IL-1RA. Esse fato pode explicar parcialmente a deficiência relativa de IL-1RA e o excesso de IL-1 na membrana sinovial de pacientes com osteoartrose.

A segunda classe de inibidores naturais de citocinas são os receptores solúveis de citocinas. Exemplos desses inibidores em humanos, relacionados à patogênese da osteoartrite, são o rIL-1R e o pp55. Os receptores solúveis de citocinas são formas encurtadas dos receptores normais; quando se ligam às citocinas, impedem sua ligação aos receptores associados à membrana das células-alvo, agindo pelo mecanismo de antagonismo competitivo.

O principal precursor dos receptores solúveis é a IL-1RP ligada à membrana. A afinidade da rIL-IP por IL-1 e IL-1RA é diferente. Assim, a rIL-1RN tem maior afinidade por IL-1β do que por IL-1RA, e a rIL-1PI exibe maior afinidade por IL-1RA do que por IL-ip.

Existem também dois tipos de receptores solúveis para o TNF - pp55 e pp75. Assim como os receptores solúveis de IL-1, eles são formados por "descamação". In vivo, ambos os receptores são encontrados nos tecidos das articulações afetadas. O papel dos receptores solúveis de TNF na patogênese da osteoartrose é controverso. Supõe-se que, em baixas concentrações, eles estabilizem a estrutura tridimensional do TNF e aumentem a meia-vida da citocina bioativa, enquanto altas concentrações de pp55 e pp75 podem reduzir a atividade do TNF por antagonismo competitivo. Provavelmente, o pp75 pode atuar como um carreador de TNF, facilitando sua ligação ao receptor associado à membrana.

A terceira classe de inibidores naturais de citocinas é representada por um grupo de citocinas anti-inflamatórias, que incluem TGF-beta, IL-4, IL-10 e IL-13. As citocinas anti-inflamatórias reduzem a produção de proteases pró-inflamatórias e algumas proteases, e estimulam a produção de IL-1RA e TIMP.