Células estaminais mesenquimais

Entre as células estaminais regionais, as células estaminais mesenquimais (MSCs) ocupam um lugar especial, cujos derivados constituem a matriz estromal de todos os órgãos e tecidos do corpo humano. A prioridade na pesquisa do MSC pertence a representantes da ciência biológica russa.

Em meados do século passado, uma cultura homogênea de células-tronco de medula óssea estromal multipotente foi isolada pela primeira vez no laboratório de A. Friedenshtein. As células estaminais mesenquimais ligadas ao substrato mantêm uma alta intensidade de proliferação por um longo período de tempo, e em culturas com uma baixa densidade de semente, clones de células semelhantes a fibroblastos sem atividade fagocítica foram formados após a fixação no substrato. A parada da proliferação de MSC foi encerrada pela sua diferenciação espontânea in vitro em células de osso, gordura, cartilagem, tecido muscular ou conjuntivo. Outros estudos possibilitaram estabelecer o potencial osteogênico de células do tipo fibroblastos do estroma da medula óssea de várias espécies de mamíferos, bem como sua atividade formadora de colônias. Experimentos in vivo, mostrou-se que o transplante hetero e ortotópico de células tipo fibroblastos que formam colônia é completado pela formação de tecido ósseo, cartilaginoso, fibroso e adiposo. Uma vez que as células-tronco da medula óssea têm uma alta capacidade de auto-renovação e uma variedade de diferenciação dentro de uma única linhagem celular, elas foram denominadas células progenitoras mesenquimatosas multipotentes.

Deve-se notar que durante 45 anos de pesquisa fundamental de células estaminais mesenquimais, condições reais foram criadas para o uso de seus derivados na prática clínica.

Hoje, não há dúvida de que todos os tecidos do corpo humano são formados a partir das células-tronco de diferentes linhas celulares como resultado de processos de proliferação, migração, diferenciação e maturação. No entanto, mais recentemente, acreditava-se que as células estaminais no corpo adulto são específicas de tecido, isto é, capazes de produzir linhas celulares especializadas apenas dos tecidos em que estão localizados. Esta situação conceitual foi refutada pelos fatos de transformação de células estaminais hematopoiéticas, não só em elementos celulares de sangue periférico, mas também em células oculares ovais. Além disso, e as células estaminais neurais foram capazes de gerar neurônios e elementos gliais, bem como as linhas iniciais comprometidas de células progenitoras hematopoiéticas. Por sua vez, células-tronco mesenquimais, geralmente produzindo elementos celulares de osso, cartilagem e tecido adiposo, são capazes de se transformar em células-tronco neurais. Supõe-se que, no processo de crescimento, regeneração tecidual fisiológica e reparadora, as células progenitoras não comprometidas são geradas a partir de reservas de tronco específicas de tecido. Por exemplo, o reparo do tecido muscular pode ser realizado por meio de células estaminais mesenquimais que migram da medula óssea para os músculos esqueléticos.

Apesar de tais células estaminais transversal permutabilidade reconhecer nem todos os pesquisadores a possibilidade de utilização clínica das células estaminais mesenquimais como uma fonte para o transplante de células e o vector de células de informação genética não tem contestado como células estaminais estromais multipotentes da medula óssea, o que pode ser relativamente fácil de isolar e propagar em cultura in vitro. Ao mesmo tempo, na literatura científica continua a aparecer relatos sobre o potencial das células-tronco pluripotentes do estroma da medula óssea. Como protocolos de pesquisa provas apresentadas, que sob a influência de indutores específicos de transdiferenciação de MSCs são convertidas em células nervosas, cardiomiócitos e hepatócitos. No entanto, alguns cientistas a oportunidade para re-activação e a expressão de genes durante o desenvolvimento embrionário precoce em dúvida. Ao mesmo tempo, todos entendem que, se forem encontrados condições para expandir as células-tronco mesenquimais multipotentes a pluripotência dos CES em medicina regenerativa e plástico automaticamente resolvido muitos problemas de natureza ética, moral, religiosa e jurídica. Além disso, uma vez que, neste caso, a fonte de haste capacidade regenerativa do doente são células autólogas do estroma é resolvido e o problema da rejeição imunológica de transplante de células. Quão realista são as perspectivas próximo futuro mostrará.

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Uso de células estaminais mesenquimais em medicina

Na clínica, o uso de derivados de células estaminais mesenquimatosas está associado, em primeiro lugar, à restauração de defeitos de tecido causados por extensas e profundas lesões térmicas da pele. No estágio pré-clínico, foi feita uma avaliação experimental da conveniência de usar células-tronco mesenquimatosas semelhantes a fibroblastos alogênicos para o tratamento de queimaduras profundas. Mostra-se que as células estaminais de medula óssea mesenquimatosas como fibroblastos formam uma monocamada em cultura, o que possibilita o transplante para otimizar os processos de regeneração de feridas de queimaduras profundas. Os autores observam que os fibroblastos embrionários possuem uma propriedade similar, mas a aplicação clínica deste último é limitada pelos problemas éticos e legais existentes. Uma queima térmica profunda com dano a todas as camadas da pele foi modelada em ratos Wistar. A área da queimadura foi 18-20% da superfície total da pele. O primeiro grupo experimental incluiu ratos com queimadura térmica profunda e transplante de células-tronco mesenquimatosas semelhantes a fibroblastos alogênicos. O segundo grupo consistiu em animais com queimadura térmica profunda e plantação trans de fibroblastos embrionários alogênicos. O terceiro grupo foi representado por ratos de controle com queimadura térmica profunda, que não realizou terapia celular. Uma suspensão de células estaminais mesenquimais derivadas de fibroblastos e fibroblastos embrionários foi aplicada a uma superfície de queimadura ferida pipetadas em uma quantidade de 2 x 10 ⁴ culas no segundo dia após a excisão de modelagem queimadura necrótica e escara formado. Após o transplante de células, a superfície de queimadura foi coberta com um pano de gaze humedecido com uma solução isotônica de cloreto de sódio com gentamicina. A coleta de células da medula óssea para a produção de MSCs seguido de sua indução em uma linha de células-tronco mesenquimais semelhantes a fibroblastos foi realizada em ratos Wistar adultos do fêmur. Os fibroblastos embrionários foram obtidos dos pulmões de embriões de 14 a 17 dias de idade. Os fibroblastos embrionários e as células da medula óssea para a preparação de MSC foram pré-cultivados em placas de Petri a 37 ° C numa incubadora de CO2 numa atmosfera com 5% de CO2 a 95% de humidade. Os fibroblastos embrionários foram cultivados durante 4-6 dias, enquanto que para a formação de uma monocamada de MSC levou de 14 a 17 dias. Posteriormente, os MSCs foram preservados pelo método de criopreservação como material de partida para células estaminais mesenquimais semelhantes a fibroblastos, que foram obtidas por descongelação e cultura de MSCs por 4 dias. O número de células-tronco mesenquimais semelhantes a fibroblastos formados foi mais de 3 vezes maior do que o número de fibroblastos embrionários que apareceram durante o mesmo período de cultivo. Para identificar as células em transtslantirovannyh feridas de queimaduras no passo de cultura seu genoma viral marcado utilizando vector de transporte baseado em um tipo recombinante portador adenovírus V 1as-2 gene que codifica a ß-galactosidase de E. Coli. As células vivas em diferentes momentos após o transplante foram detectadas imuno-histoquimicamente em criosecções com a adição de substrato X-Gal, o que dá uma coloração azul-verde característica. Como um resultado de dinâmico visual, planimetria e condição de avaliação histológica de feridas de queimadura, verificou-se que, mesmo no terceiro dia após o transplante das células em grupos isolados aparecem diferenças significativas durante o processo de cicatrização. Especialmente distinta, essa diferença se tornou no 7º dia após o transplante de células. Os animais do primeiro grupo, que foram transplantadas células estaminais mesenquimais de tipo fibroblasto, ferida adquiriu cor intensa uniformemente rosado, tecido de granulação cresceu ao longo de toda a sua área até ao nível da epiderme, e queimar a superfície é consideravelmente reduzida em tamanho. O filme de colágeno formado na superfície da ferida foi um pouco diluente, mas continuou a cobrir toda a área de queimadura. Os animais do segundo grupo, que foram transplantados fibroblastos embrionários, tecido de granulação é elevada para o nível da epiderme dos bordos da ferida, mas apenas em alguns lugares, ao mesmo plazmoreya tempo da ferida foi mais intenso do que no grupo 1, e a película de colagénio inicialmente formado virtualmente desaparecido. Em animais que não receberam terapia celular, no 7º dia, a ferida de queimação era um tecido necrótico pálido, cavado com fibrina. A plasmorreia foi observada ao longo da superfície de queimadura. Histologicamente, em animais do 1º e 2º grupo houve diminuição na infiltração celular e desenvolvimento da vasculatura, e esses sinais do início do processo regenerativo foram mais pronunciados nos ratos do 1º grupo. No grupo controle havia sinais de infiltração celular da ferida, o padrão histológico dos vasos recém-formados estava ausente. No dia 15 a 30 dias de observação em animais do 1º grupo, a área de superfície de queimadura foi significativamente menor do que nos ratos dos demais grupos e a superfície de granulação estava mais desenvolvida. Nos animais de área de superfície de queima do segundo grupo é também diminuiu em comparação com o tamanho de feridas de queimadura no grupo de ratos que foi devido a epitelização marginal controlo. No controlo locais da superfície de gravação do grupo permaneceu granulações pálidos com raro, constantes dos mesmos, varizes, as ilhotas foram placa fibrinosa continuou plazmoreya moderada em toda a superfície da queimadura, algo que é difícil sarna destacável permaneceu. Em geral, os animais do terceiro grupo também reduziram o tamanho da ferida, mas as bordas da ferida permaneceram subcutadas.

Assim, durante um estudo comparativo das taxas de cura de feridas, utilizando células estaminais mesenquimais derivadas de fibroblastos e fibroblastos fetais, e sem o uso de terapia celular marcada aceleração da cicatrização de superfície de queima como um resultado de transplantação de células estaminais mesenquimais derivadas de fibroblastos e fibroblastos embrionários. No entanto, no caso da utilização de células estaminais mesenquimais alogénicas de ferida de fibroblastos taxa de cura foi maior do que no transplante de fibroblastos embrionários. Isto foi manifestado em acelerar a mudança de fases de regeneração do processo - para reduzir os períodos de infiltração celular, aumenta a taxa de proliferação das redes vasculares, bem como a formação de tecido de granulação.

Os resultados da planimetria dinâmica indicam que a taxa de cicatrização espontânea da ferida queimada (sem o uso de terapia celular) foi a mais baixa. Nos dias 15 e 30 após o transplante de células-tronco mesenquimatosas semelhantes a fibroblastos alogênicos, a taxa de cicatrização de feridas foi maior do que no transplante de fibroblastos embrionários. Histoquímica método para a detecção de beta-galactosidase mostraram que após o transplante de células estaminais mesenquimais de tipo fibroblasto e fibroblastos embrionários ao longo de todo o período de observação sobre a superfície e regeneração de células feridas profundas transplantados permanecem viáveis. Os autores acreditam que uma maior taxa de regeneração de feridas por queimadura ao usar células estaminais mesenquimais semelhantes a fibroblastos é devido à liberação de fatores estimulantes do crescimento biologicamente ativos por essas células durante a maturação.

O transplante de queratinócitos auto ou alogênicos e fibroblastos alogênicos para o tratamento de feridas por queimadura também foi utilizado na clínica. Deve-se notar que o tratamento cirúrgico de crianças com grandes queimaduras profundas é a tarefa mais difícil devido a altas intervenções cirúrgicas traumáticas e múltiplas, perda significativa de sangue, várias reações a meios de infusão utilizados. As principais dificuldades na realização de operações cutâneas e plásticas com extensas queimaduras profundas, em uma área superior a 40% da superfície corporal, são devidas à gravidade da condição das vítimas e à falta de recursos da pele do doador. O uso de enxertos de malha com um grande fator de perfuração não resolve o problema, uma vez que as células formadas após a perfuração são epitelizadas muito lentamente, e as próprias abas da pele são muitas vezes lisadas ou secas. Tais revestimentos de feridas de queimadura como xenotic, aloenxertos cadavéricos, revestimentos de película sintética nem sempre são efetivos, portanto, estão sendo desenvolvidos novos métodos para fechar superfícies de queimadura com camadas de queratinócitos e fibroblastos cultivados. Em particular, um método de fechar superfícies de queimaduras, utilizando allofibroblastov cultivadas fornecendo durante o transplante pronunciado efeito estimulador na proliferação epidermotsitov preservada na beira da ferida em queimaduras, e em enxertos de queratinócitos malha teias. No trabalho de L. Budkevich e co-autores (2000), são apresentados os resultados da aplicação deste método para o tratamento de queimaduras em crianças. 31 crianças com trauma térmico com idade entre 1 e 14 anos estavam sob observação. Em três crianças, a área total de feridas de queimadura IIIA-B - grau IV foi 40%, 25-50-70% e em três - 71-85% da superfície corporal. A necrosectomia cirúrgica precoce foi combinada com o transplante de fibroblastos aloés cultivados e autodermoplastia. No primeiro passo de tratamento foi conduzido a excisão de tecido necrótico, o segundo - no transplante de película de suporte allofibroblastov cultivadas, a terceira (48 horas após o transplante de allofibroblastov cultivadas) - remoção da matriz e da pele abas com um rácio de perfuração autodermoplasty de 1: 4. Três pacientes internados na clínica com uma doença de queimadura severa, fibroblastos alimentares cultivados foram transplantados para feridas de granulação. O transplante de alo-fibroblastos cultivados foi realizado uma vez em 18 crianças, duas vezes em 11 e três vezes em dois pacientes. A área da superfície da ferida coberta pela cultura celular era de 30 a 3500 cm2. A eficácia da aplicação de alo-fibroblastos cultivados foi avaliada pela percentagem total de enxertia de abas cutâneas, o tempo de cicatrização das queimaduras eo número de mortes de trauma térmico grave. O enxerto de transplantes foi completo em 86% dos pacientes. Uma falta de aparência parcial de abas de pele foi observada em 14% dos casos. Apesar do tratamento em curso, seis (19,3%) crianças morreram. A área de lesão total da pele era de 40 a 70% da superfície do corpo. O transplante de alo-fibroblastos cultivados não estava relacionado ao resultado fatal de uma lesão de queimadura em qualquer paciente.

Analisando os resultados do tratamento, os autores observam que queimaduras anteriores incompatível com a vida, para o tratamento de danos térmicos profunda da área de pele de 35-40% da superfície do corpo (para crianças pequenas - até 3 anos - são queimaduras profundas críticas com uma área de 30%, para crianças mais velhas idade - acima de 40% da superfície do corpo). Quando o transplante cirúrgico de culto autodermaplasty necrectomy allofibroblastov e pele posterior enxertos com grandes queimaduras, perfurações fator IIIB - grau IV continuam críticas, mas no momento há perspectivas em muitos casos, para salvar a vida do mesmo tais vítimas. Necrectomy cirúrgica em conjunção com transplante de allofibroblastov cultivadas e autodermaplasty em crianças com queimaduras profundas provou ser particularmente eficaz em pacientes com lesões avançadas da pele com um défice de locais dadores. Tática cirúrgica ativa e transplante allofibroblastov culta promover a rápida estabilização da condição geral desses pacientes, redução do número de complicações infecciosas da doença queimadura, criando condições favoráveis para o enxerto, reduzir o tempo para restaurar a pele perdida e duração do tratamento hospitalar, reduzindo a incidência de mortes em pacientes com queimaduras extensas. Assim, o transplante de alo-fibroblastos cultivados seguido de autodermoplastia com abas de pele permite a recuperação em crianças com queimaduras graves, que foram previamente consideradas doenadas.

É amplamente reconhecido que o principal objetivo do tratamento de uma doença de queimadura é maximizar a recuperação completa e rápida da pele danificada para prevenir os efeitos tóxicos resultantes, complicações infecciosas e desidratação do corpo. Os resultados da aplicação de células cultivadas dependem em grande parte da preparação para o transplante da própria ferida de queimadura. Em casos de transplante de queratinócitos cultivados, 55% (por área) das células transplantadas sobrevivem na superfície da ferida após necrectomia cirúrgica, enquanto que nas feridas de enxertia a freqüência de enxerto é reduzida para 15%. Portanto, o tratamento bem sucedido de queimaduras profundas na pele precisa, em primeiro lugar, de táticas cirúrgicas ativas. Na presença de graus de queimaduras com grau IIIB-IV, a superfície de queimadura é imediatamente liberada de tecidos necróticos, a fim de reduzir os efeitos da intoxicação e reduzir o número de complicações da doença de queimadura. O uso de tais táticas é a chave para reduzir o tempo desde o momento de se queimar até o fechamento das feridas e o período de permanência dos pacientes com queimaduras extensas no hospital e também reduzir significativamente o número de óbitos.

Os primeiros relatos sobre o uso bem sucedido de queratinócitos cultivados para cobrir a superfície de queimadura apareceram no início dos anos 80 do século passado. Posteriormente, essa manipulação foi realizada com a ajuda de camadas de queratinócitos cultivados, obtidos na maioria das vezes de autostruções, muito menos frequentemente de aloqueratinócitos. No entanto, a tecnologia da autoqueratinocitoplastia não permite a criação de um banco de células, enquanto o tempo necessário para produzir um enxerto suficiente de queratinócitos é grande e é de 3-4 semanas. Durante este período, o risco de desenvolver complicações infecciosas e outras complicações da doença de queimadura aumenta acentuadamente, o que prolonga significativamente o tempo total de permanência dos pacientes no hospital. Além disso, os autoqueratinócitos praticamente não sobrevivem durante o transplante para granular feridas por queimação e o alto custo de meios de crescimento especiais e estimulantes de crescimento de queratinócitos biologicamente ativos limita significativamente a sua aplicação clínica. Outros métodos biotecnológicos, como colagenoplastia, transplante de xenoides criopreservados, e o uso de vários revestimentos de biopolímeros aumentam a eficácia do tratamento da superfície extensa, mas não de queimaduras profundas. O método de revestimento da superfície da ferida com fibroblastos cultivados é fundamentalmente diferente, na medida em que o componente principal do grupo de células cultivadas não é queratinócitos, mas fibroblastos.

Um pré-requisito para o desenvolvimento do método serviu como evidência de que pericitos que circundam os pequenos vasos são células genitornymi mesenquimais pró capazes de transformar-se em fibroblastos, que produzem muitos factores de crescimento e fornecer a cicatrização de feridas, devido ao forte efeito estimulante sobre a proliferação e a adesão de queratinócitos. O uso de fibroblastos cultivados para fechar as superfícies do ferimento revelou imediatamente uma série de vantagens significativas deste método em comparação com o uso de queratinócitos cultivados. Em particular, a produção de fibroblastos em cultura não requer o uso de meios nutrientes especiais e estimulantes de crescimento, o que reduz o custo do transplante em mais de 10 vezes o custo de obtenção de queratinócitos. Os fibroblastos são facilmente passados, durante os quais eles perdem parcialmente os antígenos de superfície da histocompatibilidade, o que, por sua vez, abre a possibilidade de usar células alogênicas para a produção de enxertos e criar seus bancos. O tempo é curto para a obtenção de enxertos prontos para uso na clínica, de 3 semanas (para queratinócitos) a 1-2 dias (para fibroblastos). A cultura primária de fibroblastos pode ser obtida cultivando fragmentos de pele retirados de autodermoplastia de células e a densidade de cultura celular na produção de subculturas de fibroblastos humanos é de apenas 20 x 10 ³ por 1 cm ².

Para estudar o efeito de fibroblastos e suas proteínas reguladoras na proliferação e diferenciação de queratinócitos, uma análise comparativa das características e morfologia da proliferação de queratinócitos sobre substratos de colagénio dos tipos I e III e de fibronectina em co-cultura com fibroblastos humanos. Os queratinócitos humanos foram isolados de fragmentos da pele de pacientes com queimaduras realizadas durante a operação de autodermoplastia. A densidade de queratinócitos foi de 50 x 103 células por cm2. A eficácia clínica do transplante de fibroblastos cultivados foi avaliada em 517 pacientes. Todos os pacientes foram divididos em dois grupos: 1º - adultos afetados com queimaduras IIA, grau B - IV; 2º - crianças com queimaduras profundas do grau IIIB - IV. Avaliação da dinâmica de organização estrutural e funcional da cultura em monocamada de fibroblastos no que diz respeito ao papel no processo de regeneração de glicosaminoglicanos, fibronectina, colágeno, e permitiu que os autores para determinar o terceiro dia como as condições mais favoráveis do uso de culturas de fibroblastos para a produção de transplantes. Investigação do impacto na proliferação de fibroblastos e a diferenciação de queratinócitos mostrou que sob in vitro fibroblastos têm um efeito estimulante pronunciado, principalmente em processos de adesão de queratinócitos, o aumento do número de células aderentes e que fixa a taxa de mais de 2 vezes. A estimulação dos processos de adesão é acompanhada por um aumento na intensidade da síntese de DNA e no nível de proliferação de queratinócitos. Além disso, verificou-se que a presença de fibroblastos e matriz extracelular formado por eles é um pré-requisito para a formação de ligações intercelulares tonofibrillyarnogo aparelho de queratinócitos e, em última análise, para a diferenciação dos queratinócitos e a formação de membrana basal. No tratamento de crianças com queimaduras profundas, foi estabelecida uma alta eficácia clínica do transplante de células de alo-fibroblastos, especialmente no grupo de pacientes com lesões cutâneas extensas em condições de deficiência de dadores. O estudo morfofuncional complexo mostrou que os fibroblastos de enxerto são caracterizados por síntese ativa de DNA, bem como colágeno, fibronectina e glicosaminoglicanos que fazem parte da matriz extracelular formada por células. Os autores sugerem uma alta percentagem de enxerto de fibroblastos transplantados (a 96%), uma redução acentuada em termos da sua preparação (dentro de 2-3 horas em vez de 24-48 semanas, no caso de queratinócitos), uma aceleração significativa da epitelização da superfície da queimadura, e uma redução significativa no preço (em 10 vezes) da tecnologia de crescimento do enxerto de fibroblastos em comparação com o transplante de queratinócitos. A aplicação do transplante de alo-fibroblastos cultivados permite salvar vidas de crianças com queimaduras críticas - uma lesão térmica de mais de 50% da superfície corporal, que antes era considerada incompatível com a vida. Vale ressaltar que o transplante alogênico de fibroblastos embrionárias também convincentemente provado não só regeneração mais rápida de feridas e pacientes convalescença com vários grau queimadura e região, mas também uma redução substancial da mortalidade.

Os fibroblastos autólogos também são usados em uma área tão complexa de cirurgia plástica como correção restauradora de lesões de cordas vocais. Geralmente, para este propósito, é utilizado colágeno bovino, cuja duração é limitada pela sua imunogenicidade. Sendo uma proteína estranha, o colágeno bovino é sensível à colagenase do receptor e pode induzir reações imunes, para reduzir o risco de que, as tecnologias tenham sido desenvolvidas para a obtenção de preparações de colágeno reticuladas com glutaraldeído. Sua vantagem reside em maior estabilidade e menor imunogenicidade, que encontrou aplicação prática na eliminação de defeitos e atrofia das cordas vocais. As injeções de colágeno autólogo foram utilizadas pela primeira vez em 1995. A técnica assegurou a preservação da estrutura primária de fibras de colágeno autólogas, incluindo reticulações intramoleculares enzimaticamente catalisadas. O fato é que as fibras de colágeno naturais são mais resistentes à destruição da protease do que o colágeno reconstituído, no qual os talopéptidos são cortados. A integridade dos talopéptidos é importante para a estrutura quaternária das fibras de colágeno e a formação de ligações cruzadas entre moléculas de colágeno adjacentes. Ao contrário das preparações de colágeno bovino, o colágeno autólogo não causa respostas imunes no receptor, no entanto, não é eficaz o suficiente como agente de reposição. A correção persistente pode ser alcançada pela produção local de colágeno por transplante autólogo de fibroblastos. No entanto, estudos sobre a eficácia do transplante de fibroblastos autólogos na clínica revelaram certas dificuldades. No período inicial após o transplante de fibroblasto, o efeito clínico foi mais fraco em relação ao após a administração de colágeno bovino. Quando fibroblastos autólogos cultivados não se pode excluir a possibilidade de transformação de fibroblastos normais em anormal, os chamados miofibroblastos, responsáveis pelo desenvolvimento de fibrose e cicatrizes, como evidenciado pela redução do gel de colagénio, devido à interacção específica de fibroblastos e fibrilas de colagénio. Além disso, após a passagem em série in vitro, os fibroblastos perdem a capacidade de sintetizar proteínas da matriz extracelular.

No entanto, no presente, a técnica de cultura de fibroblastos humanos autólogos foi eliminada experimentalmente, eliminando as desvantagens acima e não conduzindo à transformação oncogênica de fibroblastos normais. Os fibroblastos autólogos obtidos por este método são utilizados para preencher os defeitos dos tecidos moles da face. Em um estudo de H. Keller e co-autores (2000), 20 pacientes com idade entre 37 e 61 anos com rugas e cicatrizes atróficas receberam tratamento. As biópsias cutâneas (4 mm) do BTE foram transportadas para o laboratório em tubos estéreis contendo 10 ml de meio de cultura (meio de Eagle com soro de bezerro antibiótico, myco-séptico, piruvato e fetal). O material foi colocado dentro de 3-5 pratos de cultura com um diâmetro de 60 mm e incubado em um termostato com uma atmosfera contendo 5% de CO2. Após 1 semana, as células foram removidas dos pratos por tripsinização e colocadas em frascos de 25 cm2. As células foram administradas a pacientes em uma quantidade de 4 x 107. Observou-se efeito clínico significativo e persistente em pacientes com correção de dobras nasolabiais, bem como em pacientes com cicatrizes aos 7 e 12 meses após o terceiro transplante de fibroblastos autólogos. De acordo com a citometria de fluxo, os fibroblastos cultivados produziram uma grande quantidade de colágeno de Tipo I. Estudos in vitro, a contractilidade normal de fibroblastos injetáveis é mostrada. Dois meses após a administração subcutânea de fibroblastos cultivados em uma dose de 4 x 107 células, não foram detectados ratos nus. Os fibroblastos injetáveis não causaram formação de cicatriz e fibrose difusa em pacientes. Segundo o autor, os fibroblastos autólogos implantados são capazes de produzir constantemente colágeno, o que proporcionará efeito de rejuvenescimento cosmético. Neste caso, uma vez que a duração das células diferenciadas é limitada, os fibroblastos retirados de um paciente jovem são mais eficazes do que os obtidos em idosos. No futuro, supõe-se que a possibilidade de criopreservação de uma cultura de fibroblastos de um doador jovem transforme mais tarde para um paciente idoso suas próprias células jovens. Em conclusão, não é inteiramente correta a conclusão de que os fibroblastos autólogos sob a condição de sua preservação funcional são o meio ideal de correção de defeitos nos tecidos moles do rosto. Ao mesmo tempo, o próprio autor observa que, no processo de pesquisa, surgiram também algumas situações problemáticas ligadas ao uso de um sistema autólogo de fibroblastos colágeno. O efeito clínico foi frequentemente mais fraco do que com o uso de colágeno bovino, o que causou decepção nos pacientes.

Em geral, os dados da literatura sobre as perspectivas do uso clínico de células-tronco mesenquimais parecem bastante otimistas. Tentativas são feitas para usar células progenitoras mesenquimatosas multiponentes de medula óssea autóloga para o tratamento de lesões articulares degenerativas. Os primeiros ensaios clínicos das células progenitoras mesenquimatosas cultivadas no tratamento de fraturas complexas do osso são conduzidos. As células mesenquimais autógenas e alogênicas do estroma da medula óssea são usadas para criar tecido cartilaginoso com o propósito de transplante ao corrigir defeitos da cartilagem articular devido a trauma ou lesões auto-imunes. Métodos para o uso clínico de células progenitoras mesenquimatosas multipotentes para a eliminação de defeitos ósseos em crianças com formas graves de osteogênese incompleta causada por mutações do gene tipo I de colágeno estão sendo desenvolvidas. Após a mieloablação, a medula óssea de dadores saudáveis compatíveis com HLA é transplantada para crianças receptoras, uma vez que a medula óssea não absorvida pode conter um número suficiente de células estaminais mesenquimais para reabastecer um defeito ósseo grave. Após o transplante de medula óssea alogênica, essas crianças apresentaram alterações histológicas positivas nos ossos trabeculares, aumento da taxa de crescimento e diminuição da incidência de fraturas ósseas. Em alguns casos, um resultado clínico positivo é conseguido através do transplante de medula óssea alogênica e osteoblastos estreitamente relacionados. Para o tratamento da fragilidade congênita dos ossos devido ao desequilíbrio de osteoblastos e osteoclastos no tecido ósseo, o transplante de MSK também é usado. A restauração da formação óssea neste caso é conseguida devido à quimerização do agrupamento de células do estro e progênero no tecido ósseo dos pacientes.

Os métodos de modificação genética das células-tronco mesenquimais do doador estão sendo melhorados para corrigir defeitos genéticos de tecidos estromais. Espera-se que, no futuro próximo, células progenitoras mesenquimais sejam usadas em neurologia para a quimerização dirigida de células cerebrais e criação de um grupo saudável de células capazes de gerar uma enzima deficiente ou um fator responsável pelas manifestações clínicas da doença. O transplante de células estaminais mesenquimais pode ser usado para restaurar o estroma da medula óssea em pacientes com câncer após rádio e quimioterapia, e em combinação com células da medula óssea - para restaurar a hemopoiese. O desenvolvimento de terapia de substituição destinada a eliminar defeitos no sistema músculo-esquelético com a ajuda de MSCs é promovido por desenvolvimentos de engenharia no campo de concepção de biomateriais de matriz ou biomiméticos que formam esqueletos populados por descendentes de células-tronco mesenquimais.

Fontes de células estaminais mesenquimais

A principal fonte de células estaminais mesenquimais é de medula óssea as células estaminais hematopoiéticas, que, em mamíferos está constantemente a diferenciar-se em células do sangue e do sistema imune, enquanto que as células estaminais mesenquimais apresentou pequenas populações de células estromais de medula óssea de tipo fibroblasto e ajudam a manter o estado não diferenciado das células estaminais hematopoiéticas. Sob certas condições, as células-tronco mesenquimais se diferenciam em células de tecido cartilaginoso e ósseo. Quando plaqueadas em um meio de cultura em células estromais de medula óssea de plantação mononucleares de baixa densidade de formar colónias de células aderentes, que, de facto, são células precursoras mesenquimais multipotentes de fibroblastos. Alguns autores sugerem que a medula óssea depositada células-tronco mesenquimais não confirmadas, que, graças à capacidade de auto-renovação e alto potencial de diferenciação, fornecer todos os tecidos do corpo antecessores células estromais mesenquimais ao longo da vida organismo dos mamíferos.

Na medula óssea, os elementos das células do estroma formam uma rede que enche o espaço entre sinusoides e tecido ósseo. O conteúdo do MSC dormente na medula óssea de um adulto é comparável ao número de células-tronco hematopoiéticas e não excede 0,01-0,001%. As células estaminais mesenquimais isoladas da medula óssea e não submetidas ao cultivo são desprovidas de moléculas adesivas. Tais MSCs não expressam CD34, ICAM, VCAM, colágeno tipo I e III, CD44 e CD29. Portanto, in vitro, as células estaminais mesenquimais não são fixadas no substrato de cultura, mas os derivados progenitores mais avançados de células estaminais mesenquimais que já formaram componentes do citoesqueleto e aparelho receptor de moléculas de adesão celular. As células do estroma com o fenótipo CD34 são encontradas mesmo no sangue periférico, embora sejam muito menores na medula óssea do que as células mononucleares CD34-positivas. As células CD34 isoladas do sangue e transferidas para a cultura se ligam ao substrato e formam colónias de células semelhantes a fibroblastos.

Sabe-se que no período embrionário a base estromal de todos os órgãos e tecidos de mamíferos e humanos surge de um conjunto comum de células estaminais mesenquimais antes e no estágio de organogênese. Portanto, acredita-se que, em um corpo maduro, a maioria das células estaminais mesenquimais deve estar no tecido conjuntivo e ósseo. Foi estabelecido que a maioria dos elementos celulares do estroma de tecido conjuntivo e ósseo solto são representados por células progenitoras comprometidas, que, no entanto, retem a capacidade de proliferar e formar clones in vitro. Com a introdução de tais células no fluxo sanguíneo total, mais de 20% das células progenitoras mesenquimais são implantadas entre os elementos estromais do tecido hematopoiético e os órgãos parenquimatosos.

A fonte potencial de células estaminais mesenquimais é o tecido adiposo, entre as células-tronco das quais os precursores de adipócitos se comprometeram em diferentes graus foram identificados. Elementos progenitoras menos maduras de tecido adiposo - células estromais-vascular, o que é o mesmo que as progenitoras mesenquimais multipotentes da medula óssea podem diferenciar em adipitos sob a acção dos glucocorticóides, factor de crescimento semelhante à insulina e insulina. Na cultura, as células estromal-vasculares se diferenciam em adipócitos e condrócitos, e no tecido adiposo da origem da medula óssea existem células que formam adipócitos e osteoblastos.

Nos músculos, fontes de haste estromal também foram encontradas. Na cultura primária das células isoladas dos músculos esqueléticos humanos, são detectadas células de forma estrelada e miotubos multinucleados. Na presença de células estreladas de soro de cavalo proliferar in vitro sem sinais de citodiferenciação e após a adição de dexametasona para o meio de cultura de diferenciação é caracterizada pelo aparecimento de células de elementos de células com o fenótipo de músculo esquelético e liso, osso, cartilagem e tecido adiposo. Conseqüentemente, tanto as células progenitoras mesenquimatosas multiponentes cometidas quanto não comprometidas estão presentes no tecido muscular humano. Foi demonstrado que a população de células progenitoras representada no músculo esquelético é originária de precursores de medula óssea mesenquimatosa multiparentes não compensados e difere de células satélites de células miogênicas.

No miocárdio de ratos recém-nascidos também encontradas células estreladas adesivas, apropriados para o potencial de diferenciação das células mesenquimatosas progenitoras multipotentes, como sob a influência de dexametasona que se diferenciam em adipócitos, osteoblastos, condrócitos, células musculares lisas, os miotubos de músculo esquelético e os miócitos cardíacos. Tem sido mostrado que células do músculo liso vascular (pericitos) são derivadas de células precursoras mesenquimais perivascular multipotentes indiferenciada. Na cultura de células estaminais mesenquimais perivasculares expressam a-actina de músculo liso e receptor do factor de crescimento derivado de plaquetas e são capazes de diferenciar células do músculo liso, pelo menos.

Um lugar especial, em termos de reservas de caule, é o tecido cartilaginoso, cujo potencial de reparação extremamente baixo acredita-se ser devido a uma deficiência de células progenitoras mesenquimatosas multipotentes ou fatores de diferenciação e crescimento. Supõe-se que as células progenitoras mesenquimatosas multipotentes pré-doadas para a condro e osteogênese entram no tecido cartilaginoso de outras fontes de tecido.

A origem dos tecidos e as condições para a comissão de células progenitoras mesenquimatosas nos tendões também não estão estabelecidas. As observações de especialistas indicam que, no período pós-natal precoce, as células do tendão de Aquiles de coelhos nas culturas primárias e na primeira passagem retém a expressão do colágeno e decorina do tipo I, mas com o cultivo adicional, eles perdem os marcadores diferenciadores dos tenócitos.

Deve notar-se que a resposta à questão de saber se de facto localizados em vários tecidos de células progenitoras mesenquimais multipotentes estão sempre presentes no seu estroma, ou piscina de tecidos de células estaminais mesenquimais é compensada pela migração de células estaminais de medula estromal do osso, ele é ainda esperada.

Além da medula óssea e outras zonas de tecido mesenquimatoso de um organismo adulto, outra fonte de MSC pode ser o sangue do cordão umbilical. Tem sido demonstrado que umbilical sangue da veia do cordão contém células que têm características morfológicas e antigénicas semelhantes com células progenitoras mesenquimais pluripotentes são capazes de adesão, e não inferior células mesenquimatosas progenitoras multipotentes de origem de medula óssea através da diferenciação potencial. Nas culturas de células estaminais mesenquimais do sangue do cordão umbilical, foram detectadas 5 a 10% das células progenitoras mesenquimatosas multipotentes não comprometidas. Descobriu-se que sua quantidade no sangue do cordão umbilical é inversamente proporcional à duração da gestação, o que indiretamente indica a migração de células progenitoras mesenquimatosas multipotentes para vários tecidos no processo de desenvolvimento fetal. Havia primeira informação sobre a aplicação clínica das células estaminais mesenquimais isoladas a partir de sangue do cordão umbilical, bem como embrionário derivado biomaterial, que é baseado na capacidade conhecida de células estaminais fetais integrar e prizhivlyatsya função de órgãos e de sistemas de tecidos receptores adultos.

A busca de novas fontes de células estaminais mesenquimais

O uso de células-tronco mesenquimais de origem embrionária, como outras células do feto, cria uma série de problemas éticos, legais, legais e legislativos. Portanto, a busca de material de dador celular extraembriônico continua. A tentativa de aplicação clínica de fibroblastos de pele humana não teve êxito, o que foi predeterminado não só pela alta capacidade financeira da tecnologia, mas também pela rápida diferenciação de fibroblastos em fibroblastos, que têm significativamente menos potencial de proliferação e produzem um número limitado de fatores de crescimento. Mais progressos no estudo da biologia de MSK e precursores de medula óssea mesenquimatosa multipotentes permitiram o desenvolvimento de uma estratégia para o uso clínico de células-tronco mesenquimais autólogas. A tecnologia de seu isolamento, cultivo, reprodução ex vivo e diferenciação direcionada exigiu, em primeiro lugar, o estudo do espectro do marcador molecular dos MSCs. Sua análise mostrou que, nas culturas primárias do tecido ósseo humano, existem vários tipos de células progenitoras mesenquimatosas multipotentes. O fenótipo pro-osteoblástico foi encontrado em células que expressam um marcador de células precursoras de estroma STRO-1, mas não portadoras de marcador de osteoblasto - fosfatase alcalina. Tais células são caracterizadas por uma baixa habilidade para formar uma matriz óssea mineralizada, bem como a ausência de expressão da osteopontina e do receptor da hormona paratireóide. Derivados de células STRO-1-positivas que não expressam fosfatase alcalina são representados por osteoblastos intermediários e completamente diferenciados. Está estabelecido que os elementos celulares de linhas clonadas de células STRO-1-positivas de ossos trabeculares humanos são capazes de se diferenciar em osteócitos maduros e adipócitos. A direção da diferenciação dessas células depende do efeito de ácidos graxos poliinsaturados, citocinas pró-inflamatórias - IL-1b e factor de necrose tumoral a (TNF-a), bem como o TGF-b anti-inflamatório e imunossupressor.

Mais tarde verificou-se que as células precursoras mesenquimais multipotentes falta específica apenas a eles fenótipo inerente, mas expressam marcadores complexos, característicos para mesenquimais, células endoteliais, epiteliais e musculares na ausência de expressão de antigénios de células hematopoiéticas imunofenoticas - CD45, CD34 e CD14. Além disso, as células estaminais mesenquimais e constitutivamente indutivelmente produzir hematopoiético e factores de crescimento não-hematopoiéticos, interleucinas, e quimiocinas, e em células precursoras mesenquimais multipotentes receptores expressos por alguns factores de crescimento e citocinas. Entre as células do estroma básico do corpo humano encontrado dormantnye ou descansam células com imunofenotipagem, quase idênticos ao perfil antigénico das células progenitoras mesenquimais multipotentes 5-fluorouracil matérias - aquelas e outras células expressam CD117, marcação "adulto" células estaminais.

Assim, um marcador celular exclusivo para células estaminais mesenquimais ainda não foi estabelecido. Supõe-se que as células em repouso representam uma população de células progenitoras mesenquimatosas multipotentes não comprometidas, uma vez que não expressam marcadores de células comprometidas com osteó (Cbfa-1) ou adipogênese (PPAR-y-2). A exposição prolongada de células de repouso que proliferam lentamente ao soro de vitelo fetal conduz à formação de precursores terminalmente diferenciados, caracterizados por crescimento rápido. O crescimento clonal de tais células mesenquimais da haste é suportado pelo FGF2. Parece que o genoma das células-tronco estromáticas está suficientemente fechado. Há relatos de ausência de diferenciação espontânea no MSK - sem condições especiais para se comprometer a não serem transformadas mesmo em células da série mesenquimatosa.

Para estudar a estrutura da população derivada proteínas marcadoras diferenciação de células estaminais mesenquimais são pesquisados nas linhas de células do estroma e as culturas primárias. Nas células da medula óssea de ensaio de colónias clonais in vitro descobriu que, quando submetidos a culturas primárias de EGF aumenta o tamanho médio das colónias e reduz a expressão clonal de fosfatase alcalina, enquanto que a adição da hidrocortisona activa a expressão de fosfatase alcalina, que é um marcador de diferenciação osteogénica de orientação MSCs. Os anticorpos monoclonais contra a STRO-1, foi possível separar e populações de estudo de células aderentes STRO-1-positivos em um sistema heterogéneo culturas de Dexter. O espectro de citocinas não regulam apenas a proliferação e diferenciação de células hematopoiéticas e linfóides, mas também participar na formação, a formação e a reabsorção de tecido ósseo por para-, auto- e mecanismos do sistema endócrino. Libertação mediada pelo receptor de mensageiros secundários, tais como cAMP, diacilglicerol, trifosfato de inositol, e Ca2 + também são utilizadas para análise de marcadores de diferentes categorias de tecidos estromais de células que expressam os receptores relevantes. O uso de anticorpos monoclonais como marcadores permitiram estabelecer órgãos linfóides do estroma pertencentes células reticulares de zonas B-dependentes e T.

Durante algum tempo, as disputas científicas continuaram em torno da questão da possibilidade da origem do MSC a partir das células estaminais hematopoiéticas. De fato, com a explicação da suspensão de células da medula óssea em culturas monocamadas, as colônias discretas de fibroblastos crescem nelas. No entanto, demonstrou-se que a presença de precursores de colônias de fibroblastos e vários germes de diferenciação de tecido hematopoiético na medula óssea não é uma prova de sua origem comum a partir da célula-tronco. Usando a análise discriminante de células estaminais da medula óssea descobriram que o microambiente no transplante heterotópico, células hematopoiéticas da medula óssea é transferida, o que prova a existência, na medula óssea, independentemente da população MSC histogenética de células hematopoiéticas.

Além disso, o método de clonagem seletiva possibilitou revelar uma nova categoria de células progenitoras estromáticas em culturas monocamadas de células da medula óssea, para determinar seu número, para estudar suas propriedades, potências proliferativas e diferenciadoras. Descobriu-se que as células do tipo fibroblasto estromal in vitro proliferam e formam colônias diploides, que, com o retorno do transplante para o corpo, proporcionam a formação de novos órgãos hematopoiéticos. Os resultados do estudo de clones individuais indicam que, entre as células progenitoras do estroma, existe uma população de células, em seu potencial proliferativo e diferenciador, capaz de reivindicar o papel das células-tronco do tecido estromático de forma histogeneticamente independente das células hematopoiéticas do caule. As células desta população são caracterizadas por crescimento auto-sustentável e diferenciam-se em células progenitoras de osso, cartilagem e tecido reticular da medula óssea.

De grande interesse são os resultados dos estudos de R. Chailakhian e co-autores (1997-2001) que cultivaram células progenitoras de estroma de medula óssea de coelhos, cobaias e camundongos em meio nutriente a-MEM suplementado com soro bovino fetal. Os autores realizaram a explicação com uma densidade inicial de 2-4 x 103 células da medula óssea por 1 cm2. Como alimentador, células de medula óssea inactivadas por radiação homóloga ou heteróloga foram utilizadas em uma dose que retém a ação do alimentador, mas bloqueando completamente sua proliferação. As colônias primárias discretas de dois semanas de fibroblastos foram tripsinizadas para produzir cepas monoclonais. A evidência da origem clonal das colônias foi obtida usando um marcador cromossômico em culturas mestiças de medula óssea de cobaias macho e feminino, uma fotografia de lapso de tempo de culturas vivas, bem como em culturas misturadas de medula ósea singeneica de camundongos CBA e CBAT6T6. O transplante de uma suspensão de células de medula óssea recentemente isoladas ou fibroblastos de estroma cultivados in vitro sob a cápsula do rim foi realizado em andaimes porosos isovais ou gelatinosos, bem como em uma matriz de matriz de osso de coelho inativada. Para o transplante de clones na cobertura óssea, o fêmur da cobaia foi limpo de tecidos moles e perioste, as epífises foram cortadas e a medula óssea foi completamente lavada. O osso foi cortado em fragmentos (3-5 mm), seco e irradiado a uma dose de 60 Gy. Nas coberturas ósseas, as colônias de fibroblastos individuais foram colocadas e implantadas por via intramuscular. Para o transplante intraperitoneal de fibroblastos estromais cultivados in vitro, utilizaram-se câmaras de difusão dos tipos A (V = 0,015 cm3, h = 0, l mm) e O (V = 0,15 cm3, h = 2 mm).

Ao estudar a dinâmica de crescimento das cepas clonais, R. Chailakhian e co-autores (2001) estabeleceram que as células individuais que formam colônias de fibroblastos, bem como seus descendentes, têm um enorme potencial de proliferação. Na 10ª passagem, o número de fibroblastos em algumas cepas foi de 1,2-7,2 x 10 ⁹ células. No processo de desenvolvimento, realizaram até 31-34 duplicações de células. Assim transplante heterotópico de estirpes de osso derivadas de medula formados por precursores estromais várias dezenas de clones levaram à transferência do microambiente da medula óssea e formação no novo transplante de órgãos zona hematopoiéticas. Os autores levantaram a questão de saber se os clones individuais são capazes de transferir o microambiente da medula óssea de células estromadas ou requer a cooperação de vários progenitores estromais derivados de clones? E se os clones individuais são capazes de transferir o microambiente, será completo para os três germes, ou os diferentes clones proporcionam um microambiente para diferentes brotos hematopoiéticos? Para abordar essas questões, desenvolveu-se uma tecnologia para cultivar células progenitoras estromáticas em um gel de colágeno, permitindo remover das colônias cultivadas em superfície de fibroblastos para posterior transplante heterotópico. Os clones individuais fibroblastos do estroma de medula óssea, células cultivadas a partir de ratinhos CBA e porquinhos da índia, cortados em conjunto com um fragmento da camada de gel e heterotópicos transplantados - sob a cápsula do rim de ratinhos singénicos ou cobaias ventre muscular autólogas. Quando o transplante no músculo, as colônias no gel foram colocadas nas capas ósseas.

Os autores descobriram que em 50-90 dias após o transplante de colônias de fibroblastos da medula óssea, o desenvolvimento de osso ou osso e tecido hemopoiético foi observado na zona de transplante em 20% dos casos. Em 5% dos animais receptores, os focos de tecido ósseo formados continham uma cavidade cheia de medula óssea. Dentro dos cilindros óseos, esses focos tinham uma forma arredondada e uma cápsula, construída a partir de tecido ósseo com osteócitos e uma camada osteoblástica bem desenvolvida. A cavidade óssea continha um tecido reticular com células mieloides e eritróides, cuja relação proporcional não diferia daquela na medula óssea usual. No rim, o enxerto era um órgão típico da medula óssea que se formou quando um transplante nativo da medula óssea e a cápsula óssea cobriu a cavidade medular apenas do lado da cápsula renal. O tecido com capuz inclui elementos mieloides, eritróides e megacariocíticos. O estroma da cavidade medular teve um sistema de seno bem desenvolvido e continha células de gordura típicas. Ao mesmo tempo, o tecido ósseo sem sinais de hematopoiese foi encontrado na zona de transplante de algumas colônias sob a cápsula renal. Estudo da potência proliferativa e de diferenciação de clones individuais foram continuadas em estirpes de medula óssea de coelho monoclonais, as células são ressuspensas em meio de cultura e em uma esponja ivalonovoy separados pesando 1-2 mg dobrada sob a cápsula do rim do dador de medula óssea de coelho. Esse autotransplante foi submetido às células de 21 cepas monoclonais. Os resultados foram levados em consideração em 2-3 meses. Os autores descobriram que em 14% dos casos as cepas monoclonais transplantadas formaram um órgão da medula óssea constituído por tecido ósseo e uma cavidade da medula óssea preenchida com células hematopoiéticas. Em 33% dos casos, as cepas transplantadas formaram um osso compacto de diferentes tamanhos com osteócitos imersos nas cavidades e desenvolveram a camada osteoblástica. Em alguns casos, nas esponjas com clones transplantados, o tecido reticular desenvolveu-se sem elementos ósseos ou hemopoiéticos. Ocasionalmente, um estroma reticular foi formado com uma rede bem desenvolvida de sinusoides, mas não povoada com células hematopoiéticas. Assim, os resultados obtidos foram semelhantes aos obtidos no transplante de clones em um gel de colágeno. No entanto, se o transplante de clones cultivados sobre o substrato resultou na formação de tecido de medula é 5% do osso - 15% e o tecido reticular - em 80% dos casos, o anticorpo monoclonal de transplante estirpes formação de células de medula óssea foi observada em 14% dos casos de osso - em 53% e reticular - em 53% dos casos. De acordo com os autores, esta indica que as condições para a implementação de potenciais proliferativas e de diferenciação de fibroblastos do estroma, quando transplantadas para matrizes porosas foram mais do que óptimo com os seus transplantes no osso e cobre o substrato de colagénio. É possível que o uso de métodos mais avançados de cultivo e transplante reverso de clones possa melhorar as condições para que os clones realizem suas potências diferenciadoras e alterem essas relações. De uma maneira ou de outra, mas o valor principal da pesquisa reside no facto de alguns dos clones de células estromais capazes de formar tecido ósseo, assegurando microambiente hematopoiético estromal imediatamente para três rebentos de sangue de medula óssea: eritróide, mielóide e megacariocítica, criando um grande o suficiente footholds tecido hematopoiético e alguma massa óssea.

Além disso, os autores resolveram o problema da capacidade para esses tipos de diferenciação celular de células progenitoras clômicas clonais individuais em condições de um sistema fechado de câmaras de difusão. Além disso, era necessário descobrir se os clones individuais possuem polipotência ou para a manifestação de um potencial de diferenciação, é necessário interação cooperativa de vários clones com uma característica fixa da citocentralização, cuja proporção diferente determina a formação preferencial do tecido ósseo, reticular ou cartilaginoso. Combinando duas abordagens metodológicas - obtenção de linhagens monoclonais de células progenitoras de estroma de medula óssea e transplantação para câmaras de difusão, R. Chaylakhyan e co-autores (2001) obtiveram resultados que possibilitaram abordar a compreensão da organização estrutural do estroma da medula. O transplante de cepas monoclonais de células progenitoras estromáticas em câmaras de tipo O resultou na formação de tecido ósseo e cartilaginoso, o que indica a habilidade dos descendentes de uma única célula formadora de colônia estromal de formar simultaneamente osso e tecido cartilaginoso. A suposição de que o tecido ósseo e cartilaginoso se origina a partir da célula progenitora estromal comum tem sido repetidamente expressa repetidamente. No entanto, esta hipótese não teve uma confirmação experimental correta. A formação de osso e cartilagem em câmaras de difusão foi uma prova necessária da existência de células-tronco do estroma da medula óssea de uma célula precursora comum para esses dois tipos de tecido.

Em seguida, 29 cepas clonais da segunda e terceira passagens obtidas das culturas primárias da medula do coelho foram colocadas em câmaras de difusão e implantadas intraperitonealmente com animais homólogos. Estudos mostraram que 45% das cepas monoclonais da medula óssea possuem potências osteogênicas. Excepcionalmente, o tecido reticular continha 9 câmaras, mas, juntamente com tecido ósseo e cartilaginoso, estava presente em 13 câmaras mais, que representavam 76% de todas as cepas. Em câmaras de tipo O, onde a diferenciação foi possível para o tecido ósseo e cartilaginoso, foram estudadas 16 cepas. Em quatro câmaras (25%), formaram-se tecido ósseo e cartilaginoso. Deve notar-se novamente que, nos estudos de R. Chailakhian e co-autores (2001), as células progenitoras individuais foram submetidas a dobras de 31 a 34 na estirpe celular e sua progênie foi de 0,9-2,0 x 10 ⁹ células. O número de mitoses a que as células precursoras das estirpes policlonais foram expostas era praticamente o mesmo que o das células das cepas monoclonais. Ao mesmo tempo, a taxa de desenvolvimento das cepas policlonais, especialmente na primeira fase de sua formação, dependia, em grande medida, do número de colônias utilizadas para o início das cepas. As estirpes diploides de fibroblastos embrionários humanos (WI-38) quando re-formadas a 12-15 níveis de duplicação também formaram colônias que diferem em diâmetro e no conteúdo das células nelas. As grandes colônias contendo mais de 103 células foram apenas 5-10%. Com o aumento do número de divisões, a porcentagem de colônias grandes diminuiu. As cepas monoclonais e policlonais dos fibroblastos da medula óssea do estromal mantêm um conjunto diploide de cromossomos após 20 ou mais duplicações, e a tendência de seu desenvolvimento foi comparável à dinâmica de desenvolvimento de estirpes diplóides de fibroblastos embrionários. A análise do potencial de diferenciação de células progenitoras de estroma de medula óssea individual, realizada por transplante de cepas monoclonais para câmaras de difusão, mostrou que a metade deles é osteogênica. As grandes colônias representaram 10% do seu número total. Conseqüentemente, o número de células formadoras de colônias osteogênicas correspondeu a aproximadamente 5% de sua população total. Na massa total de células progenitoras osteogênicas identificadas pelos autores, houve células capazes de formar tecido ósseo e cartilaginoso simultaneamente. Primeiro estabeleceu-se que, para esses dois tipos de tecido no corpo adulto, existe uma célula precursora comum: 25% dos clones testados foram criados por células semelhantes e seu número entre a população geral de células progenitoras foi de pelo menos 2,5%.

Assim, o transplante heterotópico de clones individuais de fibroblastos da medula óssea abriu novos aspectos da organização estrutural da população de células progenitoras mesenquimatosas. As células progenitoras de Stromal foram encontradas capazes de transferir um microambiente específico imediatamente para todos os germes hematopoiéticos, cujo número entre os grandes clones estudados em diferentes modelos é de 5-15% (0,5-1,5% do número total de células precursoras detectadas). Juntamente com os clones que carregam o microambiente completo da medula óssea, existem células progenitoras que são determinadas apenas para a osteogênese, formando tecido ósseo no sistema aberto que não suporta o desenvolvimento da hemopoiese. O número do número total de células progenitoras é de 1,5-3%. Algumas dessas células podem formar tecido ósseo com um período limitado de auto-manutenção. Conseqüentemente, a população de células progenitoras estromáticas é heterogênea em seu potencial de diferenciação. Entre eles, há uma categoria de células que reivindicam o papel das células do estroma do caule que podem se diferenciar nas três direções peculiares ao tecido estromal da medula óssea, formando tecido ósseo, cartilaginoso e reticular. Esses dados nos permitem esperar que, com a ajuda de vários marcadores celulares, seja possível determinar a contribuição de cada tipo de células estromais para a organização de um microambiente específico e o suporte da hematopoiese em culturas dexterianas.

Características de células estaminais mesenquimais

Em anos recentes, verificou-se que, em culturas estacionárias de medula óssea as células progenitoras multipotentes mesenquimais apresentada uma população limitada de pequenas células agranulares células (RS-1), caracterizado por uma baixa capacidade de colonização e ausência de Ki-67 de expressão de antigénio específico para células em proliferação. Os parâmetros antigênicos das células RS-1 dormentes diferem do espectro de antígenos de células progenitoras estromadas comprometidas rapidamente. Verificou-se que uma alta taxa de proliferação de células progenitoras comprometidas foi observada apenas na presença de células RS-1. Por sua vez, as células RS-1 aumentam a taxa de crescimento sob a influência de fatores secretados pelos derivados mais maduros de células progenitoras mesenquimatosas multipotentes. Parece que as células RS-1 são uma subclasse de MSCs não comprometidos que são capazes de reciclagem. Em resistente a 5-fluorouracil células progenitoras do estroma da medula óssea caracterizado por um teor de ARN de baixo e elevados níveis de expressão do gene da ornitina descarboxilase in vitro - marcador de células não proliferantes.

A reprodução intensiva das células progenitoras do estroma começa após a fixação no substrato. Quando o perfil é expressa marcador de células fracamente diferenciadas: SH2 (TGF-receptor (3), SH3 (proteína de sinalização de domínio), colagénio dos tipos I e III, fibronectina, VCAM-1 do receptor de adesão (CD106) e IÇAM (CD54), caderina-11 , CD44, CD71 (receptor de transferrina), CD90, CD120a e CD124, mas sem expressão dos marcadores característicos de células estaminais hematopoiéticas (CD34, CD14, CD45). Crescimento clonal permite repetidamente subcultivadas células estaminais mesenquimais para produzir uma cultura de muitos geneticamente homogénea pluripotentes estromal progenitoras células. 2-3 a passagem do seu número atinge 50-300.000.000. Na cultura de densidade suficiente depois de parar a proliferação de células do estroma progenitoras, ao contrário de fibroblastos de tecidos hematopoiéticos diferenciam-se em adipitos, miitos, culas de cartilagem e tecido ósseo. A combinação dos sinais reguladores de três diferenciação compreendendo 1-metil-izobutilksantin (indutor da formação de AMPc intracelular), dexametasona (um inibidor de fosfolipase a e C) e indometacina (um inibidor de ciclo-oxigenase, actividade de diminuição do tromboxano e) se transforma em adipócitos até 95% das células mesenquimais progenitoras. Formação dos adipócitos a partir de células do estroma imaturos confirmou a expressão do gene da lipoproteína lipase, a identificação histoquímica das apolipoproteínas e receptores peroxysomal. As células do mesmo clone sob a influência de TGF-b em um meio isento de soro criam uma população homogênea de condrócitos. A cultura de células multicamadas deste tecido cartilaginoso é caracterizada por uma matriz intercellular desenvolvida constituída por colágeno de proteoglicano e tipo II. O meio nutriente complexo com 10% de soro fetal de sinais de efeito de diferenciação que consiste em b-glicerofosfato (doador de fosfato inorgânico), ácido ascórbico e dexametasona, nas mesmas células progenitoras progenitoras do estroma cultura leva à formação de agregados de células. Em tais células, existe um aumento progressivo na actividade de fosfatase alcalina e osteopontina, indicando a formação de mineralização óssea que células confirmou um aumento progressivo no cálcio intracelular.

Segundo alguns, a capacidade das células estaminais mesenquimais a dividir-se indefinidamente e reprodução de vários tipos de células de linhagem mesenquimal combinados com um elevado grau de plasticidade. Quando administrado para os ventrículos, ou substância branca células estaminais mesenquimais migrar para dentro do parênquima do tecido nervoso e diferenciam-se em neuronal ou glial derivada da linha celular. Além disso, há evidências de transdiferenciação de MSC em células hemopoiéticas de tronco tanto in vitro como in vivo. Uma análise mais aprofundada em alguns estudos determinaram excepcionalmente elevada ductilidade do MSC, que se manifesta na sua capacidade para se diferenciarem em astrócitos, oligodendrócitos, neurónios, cardiomiócitos, células de músculo liso e células musculares esqueléticas. Numa série de estudos transdifferentsirovochnogo potencial das MSCs in vitro e in vivo constatou que células percursoras mesenquimais multipotentes de origem na medula óssea diferenciar terminalmente em linhas de células que formam osso, cartilagem, músculo, nervos e tecido adiposo, bem como tendões e do estroma que suporta hematopoiese .

No entanto, em outros estudos, não há sinais de restrição de pluripotência genoma de células estaminais mesenquimais e não pôde ser detectado populações de células progenitoras do estroma, mas a verificação de possíveis células estromais pluripotentes foi investigada mais de 200 clones de MSC isolados a partir de uma cultura primária. A grande maioria dos clones in vitro manteve a capacidade de se diferenciar nas direções osteogênica, condrogênica e adipogênica. Quando se exclui a probabilidade de migração das células receptoras através de transplante de células estaminais mesenquimais sob a cápsula renal ou em câmaras de difusão verificou-se que as células do estroma progenitoras in situ reter fenótipo heterogénea, o que indica quer a ausência de uma factores de restrição do transplante zona ou a ausência de MSCs pluripotentes sozinho. Ao mesmo tempo, é permitida a existência de um tipo raro de células estaminais pluripotentes somáticas, que são precursores comuns de todas as células estaminais adultas.

Sobre as células estaminais mesenquimais pluripotentes multi-, mas não é verdade constituem uma pequena fracção das células de medula óssea e são capazes, em certas circunstâncias, quando cultivadas in vitro a proliferar sem entrarem em diferenciação, como evidenciado pela sua compromisso linhagem induzida de células de osso, cartilagem, gordura, tecido muscular , bem como nos tenócitos e elementos estromais que suportam a hematopoiese. Em regra geral, a exposição prolongada em meio de cultura com soro de vitelo fetal provoca a saída de MSCs nas células progenitoras estromadas comprometidas, cuja prole sofre uma diferenciação final espontânea. In vitro possível para conseguir a formação de osteoblastos direccional por adição de ácido para o meio condicionante dexametasona, beta-glicerofosfato e ascórbico, enquanto a combinação de dexametasona e diferenciação sinaliza a insulina induz a formação de adipócitos.

Estabelecido que, antes de entrar na fase de diferenciação terminal de MSC de medula óssea para criar determinadas condições de cultura inicialmente diferenciar-se em células estaminais mesenquimais de tipo fibroblasto. Derivados destas células in vivo, estão envolvidos na formação de osso, cartilagem, tendão, gordura e tecido muscular, assim como a hematopoiese suporte estromal. Muitos autores entendem o termo "células progenitoras mesenquimais multipotentes", como realmente MSCs, e as células do estroma progenitoras comprometidas e tecidos mesenquimais da medula óssea. Análise clonal de células progenitoras mesenquimais multipotentes de origem medula óssea mostrou que um pouco mais do que um terço dos clones diferenciadas na osteoartrite, hondro- e adipócitos, enquanto que as células de outros clones têm potencial osteogénico e uma forma única hondro- e osteócitos. Este clone de células percursoras mesenquimais multipotentes como DIU-9, sob condições adequadas microambiente diferenciadas em células com um fenótipo e funcionais características não só de osteoblastos, condrócitos e potsitov ADIC mas as células estromais que suportam a hematopoiese. Isolado da medula óssea fetal de rato, o clone de células RCJ3.1 diferencia-se em células mesenquimais de vários fenótipos. Pela acção combinada do ácido ascórbico, b-glicerofosfato, e dexametasona a partir de elementos celulares deste clone é primeiro formada miócitos multinucleadas e, em seguida, sucessivamente, adipócitos, condrócitos e ilhotas osso mineralizado. A população de células granulares do periósteo de fetos de ratos corresponde a células progenitoras mesenquimais multipotentes não consolidadas, como caracterizado por uma baixa taxa de proliferação, não expressa marcadores de diferenciação, e diferenciado em condições de cultura para formar hondro-, osteoartrite e adipócitos e células musculares lisas.

Assim, deve reconhecer-se que a questão da pluripotência ou multipotencialidade do genoma das células estaminais mesenquimais permanece aberta, o que, consequentemente, afeta o conceito do potencial de diferenciação das células progenitoras estromáticas, que também não está definitivamente estabelecida.

A característica experimentalmente comprovada e importante das células estaminais mesenquimais é sua capacidade de deixar o nicho do tecido e circular na corrente sanguínea geral. Para ativar o programa genético de diferenciação, tais células estaminais circulantes devem cair no microambiente apropriado. Mostra-se que, quando administrados por via sistémica para a corrente sanguínea animais receptores MSCs células implantadas em diferentes órgãos e tecidos imaturo, em seguida, diferenciaram-se em células sanguíneas, miócitos, adipócitos, condrócitos e fibroblastos. Conseqüentemente, nas zonas de tecido locais, há uma interação sinal-reguladora entre células progenitoras estromáticas não creditadas e comprometidas, e também entre elas e células maduras adjacentes. Supõe-se que a indução de diferenciação é efectuada factores parácrinos reguladoras de origem mesenquimal e nemezenhimalnogo (factores de crescimento, os eicosanóides, moléculas da matriz extracelular) que fornecem as relações espaciais e temporais no microambiente das células progenitoras mesenquimais multipotenciais. Portanto, dano local de tecido mesenquimal deverá levar à formação de um microambiente zonas células precursoras mesenquimais multipotentes diferem qualitativamente a partir dos sinais de regulação complexos tecidos intactos, no qual os processos fisiológicos ocorrem em vez de regeneração reparadora. Esta diferença é extremamente importante em termos de especialização do fenótipo celular em um ambiente normal e induzido por danos ambientais.

De acordo com as idéias, é aqui que os mecanismos da diferença fundamental de dois processos conhecidos - regeneração fisiológica e proliferação inflamatória - são colocados. O primeiro deles termina com a restauração da composição do tecido celular especializado e sua função, enquanto o resultado do processo de proliferação é a formação de elementos do tecido conjuntivo maduro e a perda de função da zona do tecido danificado. Assim, para o desenvolvimento de programas ótimos para o uso de células progenitoras mesenquimatosas multipotentes na medicina plasmática regenerativa, é necessário um estudo cuidadoso das características da influência de fatores de microambutância na diferenciação de MSCs.

Dependência da estrutura do compartimento de células estaminais em reguladores para-e autocrinos celulares, cuja expressão é modulada por sinais externos, ninguém duvida. Entre as funções dos fatores reguladores, os mais importantes são o controle da divisão assimétrica dos MSCs e a expressão de genes que determinam os estágios de comissão e o número de divisões celulares. Os sinais externos, nos quais o desenvolvimento posterior do MSC depende, são providos pelo seu microambiente. No estado imaturo, os MSCs proliferam por um longo tempo, mantendo a capacidade de se diferenciar na linha de adipócitos, miofibroblastos, estroma hematogênico, cartilagem e células ósseas. Foi estabelecido que uma população limitada de elementos de células estromais SB34-negativas que circulam no sangue do fluxo sanguíneo total retorna ao estroma do tecido da medula óssea, onde é transformado na linha de células-tronco hematopoiéticas CD34-positivas. Essas observações sugerem que a recirculação de células mesenquimais progenitoras na corrente sanguínea fornece suporte para o equilíbrio tecidual de células estaminais estromáticas em diferentes órgãos, mobilizando um conjunto comum de elementos estromados da medula óssea imatura. A diferenciação de MSCs em células com múltiplos fenótipos mesenquimatosos e seu envolvimento na regeneração ou reparação de tecido ósseo, cartilaginoso, adiposo e tendões in vivo foi demonstrada com a ajuda de modelos de transferência adotiva em animais experimentais. De acordo com outros autores, a migração distante de MSK ao longo do leito vascular é combinada com deslocamento de curta distância ou local de células progenitoras mesenquimatosas multipotentes dentro do tecido durante o reparo da cartilagem, regeneração muscular e outros processos restauradores.

As reservas de haste locais da base de tecido estromal desempenham o papel de fonte de células nos processos de regeneração de tecido fisiológico e são reabastecidas pelo transporte distante de MSCs à medida que os recursos estaminais do tecido estromal são utilizados. No entanto, no contexto da necessidade de mobilização de emergência do potencial celular reparador, por exemplo, em politraumatismo, todo o escalão do MSC participa nos processos de regeneração reparadora e os precursores da medula óssea mesenquimatosa são recrutados para a periferia através da corrente sanguínea geral.

Transplante de células estaminais mesenquimais

Existem certos paralelos entre os processos de regeneração fisiológica dos tecidos e sua formação durante o período de desenvolvimento intra-uterino. Na embriogênese de humanos e mamíferos, a formação de vários tipos de células especializadas ocorre a partir do conjunto ecto-, meso e endodermal de folhas embrionárias, mas com a participação obrigatória do mesênquima. A rede celular solta do tecido embrionário mesenquimal desempenha numerosas funções reguladoras, metabólicas, esqueléticas e morfogenéticas. A tabulação de órgãos provisórios é realizada somente após a condensação do mesênquima devido ao crescimento clonogênico das células progenitoras, que geram os sinais morfogenéticos primários da organogênese. Os derivados do estromal do mesênquima embrionário criam uma estrutura celular de órgãos provisórios e constituem a base do seu futuro fornecimento de energia através do crescimento do sangue primário e dos vasos linfáticos. Em outras palavras, os elementos estromais da unidade microcirculatória dos órgãos fetais aparecem antes da formação de suas unidades estrutural-funcionais. Além disso, a migração ativa de células mesenquimais durante a organogênese fornece orientação espacial dos órgãos em desenvolvimento devido à marcação de seus limites de volume por restrição de noch-Teps homeotic. No andaime estromal há também uma montagem de unidades estruturais e funcionais de órgãos parenquimatosos, que muitas vezes contêm células morfogenéticas e funcionalmente completamente diferentes. Conseqüentemente, na embriogênese, as funções do mesenquim são primárias e são realizadas gerando sinais regulatórios que ativam a proliferação regional e a diferenciação das células epiteliais progenitoriais. As células embrionárias do mesênquima produzem fatores de crescimento como LEG, HGF-b, CSF, para os quais células progenitoras parenquimatosas têm receptores correspondentes. No tecido maduro diferenciado de um organismo adulto, a rede celular estromal também gera sinais para manter a viabilidade e a proliferação de células progenitoras de origem não mesenquimatosa. No entanto, o espectro dos sinais reguladores do estroma na ontogênese pós-natal é diferente (SCF, HGF, IL-6, IL-1, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, GM-CSF, flt-3, LIF, etc.) e visa proporcionar regeneração fisiológica ou reparação de zonas de tecido danificado. Além disso, as características espectrais dos fatores reguladores do estroma em cada tipo de tecido e mesmo dentro do mesmo órgão são diferentes. Em particular, a hematopoiese e a linfopoiese para a multiplicação e diferenciação de células hematopoiéticas e células imunocompetentes ocorre apenas em certos órgãos, dentro do qual actua microambiente estromal proporcionar condições para a maturação de células hematopoiéticas e linfóides. É dos fatores reguladores do microambismo que depende a capacidade das células hematopoiéticas e linfóides para repovoar este órgão, proliferar e amadurecer em seus nichos microestruturais.

Entre os componentes da matriz extracelular, que produzem células percursoras mesenquimais multipotentes, deve notar-se a fibronectina, a laminina, colagénio e proteoglicanos, assim como CD44 (hialuronano e receptor de osteopontina) que recebe a parte principal na organização da interacção intercelular e a formação da matriz extracelular na medula óssea e osso . Está provado que mesenquimais da medula óssea, células multipotentes criar microambiente estromal redshestvenniki, fornecendo os sinais indutores e reguladoras não só o MSC, mas também precursores hematopoiéticos e células estaminais de medula óssea nemezenhimalnye. Sabe-se que as MSCs envolvidas na hematopoiese medida pela sua capacidade de se diferenciar em células do estroma que suportam a hematopoiese, em que o sinal de orientação MSK activo obtidos directamente a partir de células-tronco hematopoiéticas. É por isso que, em cultura, a rede de células progenitoras estromáticas serve como base de alimentação para o desenvolvimento de todos os clones de células hematopoiéticas.

Em uma intensidade organismo maduro de hemodiálise e linfopoiese num estado de equilíbrio dinâmico com o "gasto" de células sanguíneas maduras e células do sistema imunitário na periferia. Uma vez que as células do estroma da medula óssea e os órgãos linfóides são atualizados extremamente raramente, não ocorre um rearranjo significativo das estruturas estromais neles. Traga o sistema de equilíbrio dinâmico é possível com a ajuda de danos mecânicos para quaisquer órgãos hemo ou linfopoiese, que conduz ao mesmo tipo de alterações sequenciais que afectam não só e não tanto de células hematopoiéticas ou linfóides, como as estruturas do estroma danificado órgão. No processo de regeneração reparadora, a base estromal é formada pela primeira vez, que é então repoblada por células hematopoiéticas ou imunocompetentes. Esse fato há muito conhecido faz da regeneração pós-traumática um modelo conveniente para estudar o microambiente estromal dos órgãos hematopoiéticos. Em particular, para a investigação de regeneração reparadora de medula óssea é utilizada mecânica esvaziamento cavidade medular dos ossos longos - curetagem, permitindo a trazer rapidamente e de forma eficaz o tecido hematopoiético de um estado de equilíbrio dinâmico. Ao estudar o processo de regeneração de reparação de componentes hematopoiéticas e células da medula do estroma ósseo após esvaziamento mecânico da cavidade medular das cobaias tíbia descobriram que entre os indicadores de regeneração de células hematopoiéticas e estromais (o número de células hematopoiéticas, a concentração e quantidade de células do estroma progenitoras) não existe uma correlação directa. Além disso, verificou-se que o aumento na população de células progenitoras do estroma ocorre em uma data anterior após curetagem, e os próprios fibroblastos estromais são fosfatazopolozhitelnymi, que é característica do tecido osteogénico. Foi igualmente estabelecido que os curetagem 3-5 ossos longos leva ao crescimento da população de células na medula óssea e osso não operado mesmo no baço, que em cobaias é único corpo linfopoiética.

Processos imagem reparadoras morfológicas na medula óssea kyuretirovannyh tibiais cobaias geralmente corresponde aos dados da literatura obtidos em experiências em animais de outras espécies, a dinâmica das alterações que ocorrem após a remoção do tecido hematopoiético é a mesma para todas as espécies e a diferença diz respeito apenas aos parâmetros de tempo . Morfologicamente procedimento fase para restaurar a hematopoiese na cavidade medular é esvaziada nos processos sucessivos organizando a formação de coágulos de sangue fibra grosseira do osso, a sua reabsorção, de sinusóides e estroma formação reticular, que repovoamento mais elementos hematopoiéticos. Ao mesmo tempo, o número de células hematopoiéticas progenitoras no processo de regeneração do tecido da medula óssea aumenta em paralelo com o aumento do conteúdo das células hematopoiéticas do caule.

Y. Gerasimov e co-autores (2001) compararam as mudanças no número de células hematopoiéticas e o número de células progenitoras estromáticas em fases individuais do processo de regeneração. Verificou-se que as mudanças quantitativas nas células da medula óssea no osso curado correspondem à dinâmica das características morfológicas da regeneração. Redução durante os três primeiros dias do conteúdo da célula em autores regenerados atribuem a perda de células hematopoiéticas devido aos efeitos adversos do microambiente, que cria o tecido reticular cresce na medula óssea remanescente na epífise e no último para formar osteóide focos e dano vascular com curetagem. No dia 7 a 12, o aumento do nível de células nucleadas coincide com o aparecimento de focos separados de hematopoiese mieloide nas zonas de proliferação de elementos estromais. No vigésimo dia, há áreas significativas de medula óssea regenerada e seios bem desenvolvidos, que é acompanhado por um aumento significativo no número total de células. No entanto, o número de elementos hematopoiéticos neste período é de 68% do nível de controle. Isso é consistente com dados publicados anteriormente que o número de células hematopoiéticas após a curetagem atinge a norma apenas no 35-40º dia após a operação.

No período pós-traumático inicial, a principal fonte celular para a restauração da hemopoiese é os elementos celulares preservados na curetagem. Em termos posteriores, a principal fonte de regeneração do tecido hematopoiético da medula óssea são células estaminais, repovoando as zonas estromas livres. Quanto a certas categorias de células estomatais (endoteliais, reticulares e osteogênicas), as fontes que fornecem a formação durante a reconstrução da cavidade medular permanecem inexplicadas. Os resultados de Yu.V. Gerasimov e co-autores (2001) testemunham que na medula óssea preservada após curetagem, a concentração de células que formam colônias de fibroblastos é significativamente maior do que na medula óssea normal. Os autores acreditam que com a curetagem há uma lixiviação seletiva mais intensiva das células hematopoiéticas em comparação com as células estromáticas formadoras de colônias que participam da formação do estroma e estão mais fortemente associadas à sua substância básica do que as células hematopoiéticas.

A dinâmica do número de células que formam a colônia de fibroblastos correlaciona-se com a intensidade dos processos de osteogênese, reabsorção subsequente das trabéculas ósseas e a formação do estroma reticular, que é preenchido pelas células hematopoiéticas. A maioria das células progenitoras do estroma formam um tecido ósseo fibroso grosso e um estroma reticular nos tempos de regeneração indicados. Nas fraturas dos fêmures nas condições de osteossíntese prolongada no 5º dia na zona de regeneração, a concentração eo número de células que formam a colônia de fibroblastos aumentam e, no período de formação óssea intensiva, o número aumenta 6 vezes. Sabe-se que as células da medula óssea que formam colônias de fibroblastos possuem propriedades osteogênicas. O número de células progenitoras estromáticas aumenta antes da colonização da área da medula óssea cortexada por células hematopoiéticas. Isto está de acordo com a evidência de que as células do estroma fornecem a formação de um microambiente hematopoiético. Obviamente, a criação de um microambiente hematopoiético corresponde a um certo nível de regeneração do tecido estromal e o número de células hematopoiéticas aumenta com a expansão da cabeça de stromal adequada para hematopoiese.

De grande interesse são os dados dos autores que, imediatamente após o curetagem, o número de células progenitoras estromadas nas partes remotas do esqueleto aumenta. A partir da sexta hora até o vigésimo dia inclusive, na tíbia contralateral há mais do que um aumento duplo na concentração e no número de células que formam a colônia de fibroblastos. O mecanismo deste fenómeno é provavelmente relacionado com o facto de uma lesão maciça de medula óssea resultando na formação de um grande número de coágulos de sangue ao destruir, simultaneamente, um número significativo de plaquetas e a libertação para o factor derivado de plaquetas de sangue de crescimento (RBSK), que é conhecido por causar a proliferação de células que formam colónias fibroblastos localizados no corpo fora do grupo proliferativo. Em experimentos com coelhos, a administração local de MSC promove a restauração do tecido cartilaginoso de um joelho danificado cirurgicamente, que pode estar relacionado à formação de condrócitos originários de MSCs injetados. No entanto, a regeneração reparadora de defeitos ósseos em ratos de laboratório é grandemente reforçada pelo uso de células-tronco mesenquimais envolvidas em uma estrutura cerâmica. Portanto, podemos supor que, se você não RBOK, então qualquer outro fator, derivada das células estromais danificadas, tem um efeito estimulante distante sobre a proliferação de células progenitoras mesenquimais nas áreas intactas da medula óssea e estimula a sua migração para a área do tecido da medula defeito ósseo. Por sua vez, isso contradiz os dados da literatura dos últimos anos, indicando que as células do estroma responsáveis pelo microambiente, ao contrário das células hematopoiéticas, não são capazes de migrar e provêm de fontes locais.

No entanto, os resultados do estudo Gerasimov Yu et al (2001) sugerem que a aplicação de trauma mecânico provoca não só uma reestruturação acentuada de tecido do estroma em ossos kyuretirovannoy, mas também alterações significativas nos ossos remotos estroma intacta, isto é, existe uma resposta sistémica tecido estromal para trauma local. E quando se aplica politrauma - curetagem múltipla - esta reação é amplificada e observada não apenas no osso operado e nas partes remotas do esqueleto, mas também nos órgãos linfóides, em particular no baço. O mecanismo de uma resposta sistêmica do tecido estromal da medula óssea e do baço ao trauma local e ao politraumatismo permanece desconhecido. Assume-se que este processo está associado ao efeito do fator humoral liberado pelo estroma mesenquimatoso da cavidade medular da medula óssea. A possibilidade de produzir medula óssea e baço pelas células estromais de um fator humoral não específico de órgão responsável pela proliferação de células que formam colônias de fibroblastos é evidenciada por dados sobre sua atividade estimulante de colônias em culturas monocamadas de medula óssea.

A este respeito, deve notar-se que, quando a introdução sistêmica de células progenitoras mesenquimatosas multipotentes, seus derivados são repoblados não apenas pela medula óssea, mas também por outros tecidos, que é usado, em particular, para terapia genética. Mostra-se que após a administração intravenosa de grandes quantidades de MSCs com o genoma de ratinhos de tipo selvagem com células de colagénio mutante do gene I doadores substituir até 30% das células de osso e cartilagem tecido do receptor, e as células de rato estaminais mesenquimais transfectadas que segregam IL-3 humano, durante 9 meses efetivamente apoiam hematopoiese em caso de administração simultânea com células-tronco hematopoiéticas humanas para camundongos imunodeficientes.

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Modificação genética de células estaminais mesenquimais

Entre os sucessos da modificação genética experimental do MSC é a transfecção do gene do factor IX no MSC humano com a subsequente transferência de células transfectantes para ratinhos imunodeficientes, o que leva ao aparecimento do fator antihemofílico B no sangue durante 8 semanas após o transplante. Neste experimento, a modificação póstranslacional do fator IX com γ-glutamil carboxilase foi realizada em células transfectadas. A transdução de MSC por um vetor retroviral que codifica o factor IX humano foi menos bem sucedida - a administração subsequente destas células a um cão com hemofilia B proporcionou um nível terapêutico do factor IX, que mantém a intensidade normal da hemostasia da coagulação, por apenas 12 dias.

O transplante de células-tronco mesenquimais para o parênquima cerebral dos animais mostrou que as células imatadas do doador são transformadas na população de neurônios e glia. O enxerto de derivados neuronais do tecido mesenquimatoso doador saudável teoricamente permite corrigir anormalidades genéticas do metabolismo cerebral em pacientes com doença de Gaucher e outros distúrbios do metabolismo lipídico, gangliósidos ou carboidratos.

A pesquisa experimental de condições de transdiferenciação de células-tronco do estroma da medula óssea nas células progenitoras dos tecidos nervoso e hepático continua. A atenção dos pesquisadores é focada em combinações de indutores de diferenciação e meios de condicionamento especiais. Em particular, para o isolamento da cultura primária das células do estroma, as células da medula óssea lavadas e ressuspensas em meio de cultura DMEM / F12 (1/1) com soro fetal de vitelo a 10% são semeadas a uma densidade de 200.000 / cm2. Após 24 horas, as células não aderentes são removidas, e células do tipo fibroblasto ligadas ao plástico são cultivadas durante uma semana. Para a diferenciação das células do estroma da medula óssea para neuroblastos utilizados meio condicionado obtido por cultura de cultura de três dias de rato primária fibroblastos embrionários, bem como entre DMEM / F12 (1/1) com 2% de soro fetal de vitelo e suplementadas com 20 ng / ml ou 10-6 M LiF ácido retinoico (neuroinductores, que são utilizados para a diferenciação neural de células-tronco embrionárias de ratos e humanos). A diferenciação das células do estroma da medula óssea em células progenitoras em hepatócitos foi induzida ambiente condicionado criado como um resultado de três dias de cultura de uma cultura primária de células de fígado de rato embrionários em DMEM / F12 (1/1) meio suplementado com 10% de soro fetal de vitelo.

Aqui, deve notar-se novamente que as células formadoras de colônias do estroma da medula óssea são heteromórficas e podem ser divididas em dois tipos. O primeiro tipo inclui células tipo fibroblastos que formam células filopodias com núcleos grandes e um ou dois nucleolos. O segundo tipo é representado por células pequenas de uma forma em forma de fuso. No cultivo de células de ambos os tipos no meio condicionado obtido na camada de alimentação de fibroblastos embrionários de ratos primários, células semelhantes aos neuroblastos aparecem no terceiro e quarto dias em cultura. Nesta fase, muitas vezes têm uma forma em forma de fuso com um ou dois processos longos que terminam com filopodia. As células piramidais ou estelares com dendritas curtas são menos comuns. Os dendritos de alguns neuroblastos têm extensões características (brotos de crescimento) e ramificação em sua parte distal, outros - cones de crescimento distintos com filopodas, com os quais ocorre o crescimento de dendritas. Sinais morfológicos semelhantes (rins e cones de crescimento com filopodia), inerentes aos neuroblastos, diferenciando em neurônios, são descritos em detalhes em trabalhos sobre neurogênese. Nesta base, alguns autores concluem que as células que eles detectam em cultura são neuroblastos. Em particular, Schegelskaya E. Et al (2002), após uma cultura primária de células do estroma cultivadas durante duas semanas em um substituível em cada meio condicionado Z-e-4 dias descobriram que parte das células em proliferação, mantendo o estado não diferenciado. Externamente, essas células pareciam fibroblastos e foram identificadas em cultura, juntamente com neuroblastos diferenciadores. A maioria das células (cerca de 80%) estava em diferentes estádios de diferenciação em células do tecido nervoso, principalmente nos neurônios. Os processos dendríticos dessas células foram intimamente contatados, de modo que, gradualmente, as células se formaram nas seções de substrato da rede nervosa na forma de cadeias multicelulares longas. Os processos dendríticos dos neuroblastos cresceram muito mais, alguns deles 8 a 10 vezes maiores do que o comprimento do próprio neurônio. Gradualmente, a proporção de células piramidais e estelares aumentou. Dendritas de células estreladas ramificadas. De acordo com os autores, a posterior diferenciação de células piramidais e estelares em comparação com os de forma de fuso corresponde à sequência de estágios de neurogênese normal em animais. Como resultado, os autores concluem que as células-tronco do estroma da medula óssea sofrem neurogênese induzida, durante a qual, in vitro, de neuroblastos, formam-se os três principais tipos de neurônios. Os predecessores das células nervosas também foram detectados durante o cultivo de células do estroma da medula óssea por 3-4 dias em meio com 2% de soro fetal e LIF de 20 ng / ml. Mas, neste caso, as células-tronco foram divididas muito lentamente, a diferenciação dos neuroblastos ocorreu somente em 30% dos casos e não formaram redes neurais. Usando como indutor a diferenciação das células nervosas do ácido retinoico, os autores obtiveram em cultura até 25-30% das células nervosas com predominância de elementos gliais - astrócitos e oligodendrócitos. Os neurônios representavam apenas um terço de todas as células nervosas, embora fossem representados por todos os três tipos: células fusiformes, piramidais e estelares. No dia 6 de cultura de células do estroma em células nervosas meio ácido retinóico tornou-se mais diferenciado, enquanto os axônios individuais de neurónios piramidais foram encontrados no neuroontogenesis normal, aparecem formação posterior dos processos dendríticos. De acordo com os autores, apesar do baixo rendimento de células nervosas, o método de indução do ácido retinóico tem vantagens: astrócitos e oligodendrócitos e myelinating operar funções de avanço durante o crescimento de axónios e dendritos e que são necessárias para a formação normal do tecido nervoso. Portanto, para reparar seus sites danificados in vivo, é melhor usar uma suspensão de neurônios enriquecidos com células gliais.

Na segunda série de experiências, os autores tentaram induzir a diferenciação das células do estroma da medula óssea em células do fígado. Depois de três dias de cultura de células-tronco do estroma da medula óssea no meio condicionado obtido através da incubação de hepatócitos de rato embrionários, células grandes, com a forma esférica têm sido encontrados, muitas vezes de dois nucleares, inclusões citoplasmáticas com tamanhos diferentes. Essas células estavam em diferentes estágios de diferenciação e diferiam em tamanho, número de núcleos e inclusões no citoplasma. Na maioria dessas células, o glicogênio foi detectado, com base no qual os autores identificaram-nas como células progenitoras de hepatócitos. Uma vez que a cultura sem células foram detectados Semelhante a neuroblastos, seguido por uma conclusão de que no meio condicionado obtido através da cultura de hepatócitos embrionárias, não há factores de diferenciação das células nervosas e, por outro lado, existem factores que induzem a diferenciação das células do estroma da medula óssea em células progenitoras de hepatócitos . Em conclusão, os autores sugerem a presença de pluripotência nas células estromadas da medula óssea, uma vez que se diferenciam in vitro em células do tecido nervoso ou hepático, dependendo da mídia específica e dos indutores utilizados.

Em alguns trabalhos, a diferenciação das células do estroma da medula óssea em células de cardiomiócitos, cartilagens, tecidos ósseos e nervosos está corretamente mostrada. Há informações de que, entre as células da medula óssea, existem populações de células-tronco que podem se diferenciar em hepatócitos. À luz desses dados, os resultados das experiências acima em camundongos ainda podem ser considerados como outra confirmação da presença na medula óssea de células estaminais mesenquimais pluripotentes que têm a capacidade de se diferenciar em células de diferentes tecidos de um organismo adulto.

Transplante de células estaminais mesenquimais

Em transplantologia clínica, as células estaminais mesenquimais humanas podem ser utilizadas para apoiar a expansão de células estaminais hematopoiéticas, bem como a prole pré-mata precoce. Em particular, a introdução de células-tronco hematopoiéticas autólogas e MSC para pacientes oncológicos após alta dose de quimioterapia acelera a recuperação do número de neutrófilos e plaquetas no sangue periférico. Os transplantes alogênicos e autólogos de células estaminais mesenquimais são utilizados para tratar mieloma múltiplo, anemia aplástica e trombocitopenia espontânea, doenças associadas ao defeito estromal primário do tecido hematopoiético. A eficiência da terapia celular em patologias hematolicas em muitos casos acima, enquanto que a introdução de estroma e células estaminais hemopoiéticas, que manifesta uma redução do período de recuperação pós-operatório, o sangue, a diminuição do número de mortes devido a células cancerosas regionais e circulam de destruição de não-selectivos na qual a suas células doentes hematopoiéticas próprio progenitoras morrem e. A aplicação prospectiva de MSC e outras células progenitoras mesenquimatosas multipotentes na prática clínica deve-se à facilidade relativa de obtenção de aspiradores de medula óssea, expansão em cultura e transfecção de genes terapêuticos. Neste caso, a implantação local de células progenitoras mesenquimatosas multipotentes pode ser usada para reabastecer os defeitos do tecido local e, no caso de disfunções sistêmicas do tecido mesenquimatoso, a sua introdução no fluxo sanguíneo total não está excluída.

Mais cautelosos em seus raciocínios são os autores de obras nas quais as perspectivas de utilização do MSC para transplante local, sistêmico e terapia genética são analisadas do ponto de vista da biologia das células estromais. A medula óssea pós-natal é tradicionalmente considerada como um órgão constituído por dois sistemas principais de linhas celulares claramente expressas - o tecido hematopoiético real e o estroma de apoio associado. Portanto, as células estaminais mesenquimais da medula óssea foram inicialmente consideradas apenas como uma fonte de base estromal para a produção de fatores reguladores no microambiente hemopoiético. Em seguida, a atenção dos pesquisadores mudou para estudar o papel do MSC como fonte de tecido esquelético. Os dados mais recentes indicam um potencial inesperado de diferenciação das células do estroma da medula óssea com a formação de tecido neural ou muscular. Em outras palavras, as células estaminais mesenquimais apresentam plasticidade transgermal - a capacidade de se diferenciar em tipos celulares que são fenotípicamente não relacionados às células do tecido original. No entanto, alguns aspectos da biologia das células estromais de medula óssea permanecem obscuros e não resolvida no plano biológico geral, e em algum detalhe, incluindo a identificação, natureza, origem e desenvolvimento e função em células do estroma da medula óssea vivo, bem como a diferenciação potencial permitido ex vivo ea possibilidade uso terapêutico in vivo. Os dados obtidos sobre as capacidades potenciais dos MSC, bem como os resultados da pesquisa sobre o potencial regenerativo de outras células estaminais, estão em forte contradição com os dogmas estabelecidos na biologia.

Quando cultivados em condições de baixa densidade, as células do estroma do tronco da medula óssea formam colônias distintas, cada uma das quais é um derivado de uma única célula precursora. A porcentagem de células progenitoras estromáticas em células de medula óssea nucleadas, determinada pela capacidade de formar colônias, depende significativamente das condições de cultivo e das espécies pertencentes ao MSC. Por exemplo, no roedor para obter a quantidade máxima de células progenitoras do estroma é absolutamente necessário, na presença de cultura alimentador irradiada de células de medula óssea e de soro, enquanto que a formação de colónias a eficiência de células estaminais mesenquimais humanas é independente do alimentador, ou a partir do meio de cultura. O número de fatores mitogênicos conhecidos que estimulam a proliferação de células progenitoras estromáticas é limitado. Estes incluem PDGF, EGF, FGF, TGF-b, e também IGF1. Sob melhores condições de cultura, as linhas policlonais do MSC sobrevivem in vitro mais de 50 divisões celulares, o que possibilita a obtenção de bilhões de células de estroma da medula óssea a partir de 1 ml de seu aspirado.

No entanto, a população de células do estroma da medula óssea é heterogênea, o que se manifesta como uma variabilidade no tamanho das colônias, diferentes taxas de sua formação e uma variedade de morfologia celular que engloba uma gama de células fusiformes tipo fibroblastos para grandes células planas. Com o desenvolvimento dessas culturas após 20 dias, também se observa heterogeneidade fenotípica. Algumas colônias são altamente expressas por fosfatase alcalina, outras não a expressam, e o terceiro tipo de colônias é positivo à fosfatase na região central e a fosfatase é negativa na periferia. Colônias separadas formam nódulos de tecido ósseo (o início da mineralização da matriz é marcado quando corado com vermelho de alizarina ou em cálcio por Van-Koss). Em outras colônias, ocorre acumulação de gordura, identificada por manchas de G com óleo vermelho. Menos frequentemente, as colônias das células estaminais mesenquimais formam cartilagens coloridas com azul de alciano.

Após o transplante ectópico para animais experimentais, as linhas policlonais MGK formam um osso ectópico com estroma reticular associado a mielopoiese e adipócitos, e também, com menor freqüência, com tecido cartilaginoso. No transplante de linhas monoclonal de células estromais de medula óssea, em alguns casos, há quimerismo, em que o de novo tecido ósseo formado é composto de células ósseas, os adipócitos compreende origem estroma e dador, ao passo que linhas de células hematopoiéticas e do sistema vascular são derivados a partir do receptor.

Os resultados desses estudos confirmam a natureza do caule do precursor da medula óssea estromal, a partir do qual a linha clonal foi obtida. Eles também mostram simultaneamente que nem todas as clonagens em células de cultura são células-tronco multipotentes. Alguns pesquisadores acreditam e compartilhamos sua opinião de que as informações mais confiáveis sobre o potencial real de diferenciação de clones individuais podem ser obtidas apenas in vivo após o transplante e não determinando o fenótipo de seus derivados in vitro. A expressão na cultura de marcadores fenotípicos de osteó, chondro ou adipogênese (determinada por mRNA ou por técnica histoquímica) e até mesmo a produção de uma matriz mineralizada não reflete o grau de pluripotência de um clone individual in vivo. Portanto, a identificação de células estaminais no grupo da célula estromal é possivelmente apenas posteriori, nas condições apropriadas de um teste de transplante biológico. Em particular, a condrogénese muito raramente observada nos sistemas abertos de transplante, ao passo que a formação de cartilagem não é pouco comum em sistemas fechados, tais como câmaras de difusão ou em culturas mikromassnyh de células estromais in vitro, em que atingido localmente de baixa tensão de oxigénio, contribuem para a formação de cartilagem. Portanto, mesmo a técnica de transplante, bem como as condições de cultivo in vitro inespecíficas, afetam significativamente o intervalo de diferenciação MSC.

O transplante experimental com observância de determinadas condições experimentais é o padrão de ouro para determinar o potencial de diferenciação das células estromais da medula óssea e o elemento-chave da sua identificação adequada. Historicamente, estudos de transplante de medula óssea de medula óssea estão associados a um problema comum de transplante de medula óssea. Foi estabelecido que o microenvironmento hemopoiético é criado por transplante de células estromadas da medula óssea e fornece desenvolvimento ectópico de tecido hematopoiético na zona de transplante. A origem do microambiente do doador e do tecido hematopoiético - do hospedeiro nos permite tratar o osso ectópico como um verdadeiro transplante de medula óssea "invertida". O transplante local de células do estroma da medula óssea promove correção efetiva de defeitos ósseos, mais pronunciada do que na regeneração reparadora espontânea. Vários estudos pré-clínicos em modelos experimentais demonstraram convincentemente a possibilidade de usar transplantes de medula óssea de medula óssea em ortopedia, embora o trabalho e a análise mais aprofundados sejam necessários para otimizar essas técnicas, mesmo nos casos mais simples. Em particular, as condições óptimas para a expansão das células estromais osteogénicas ex vivo ainda não foram estabelecidas, a estrutura e a composição do veículo ideal permanecem não utilizadas, bem como o número de células necessárias para a regeneração óssea em massa.

Além da utilização de células de estroma de medula óssea reproduzidas ex vivo para fins de regeneração de tecido de origem mesenquimatosa, a plasticidade pouco ortodoxa do MSC abre o potencial para a sua utilização na regeneração de células neurais ou na entrega de produtos genéticos para o sistema nervoso central. Em princípio, isso simplifica a terapia celular na derrota do sistema nervoso, uma vez que não há necessidade de obter células-tronco neurais autólogas de seres humanos. É relatado sobre as possibilidades de usar células de medula óssea para a geração de cardiomiócitos e células precursoras miogênicas como uma origem verdadeiramente estromal e extrínseca.

Experiências estão em curso no transplante sistêmico de células estromadas da medula óssea para o tratamento de doenças esqueléticas comuns. Não há dúvida de que as células estromadas da medula óssea representam uma população responsável por distúrbios genéticos em doenças do esqueleto, o que é bem ilustrado pela transferência vetorial dessas informações genéticas através dessas células, o que leva à formação de tecido ósseo patológico em animais experimentais. No entanto, a capacidade das células do estroma de se implantar, crescer, multiplicar e se diferenciar nos ossos do esqueleto após a introdução na corrente sanguínea geral ainda não foi comprovada.

Isso se deve em parte ao fato de que, no procedimento padrão do transplante de medula óssea, o estroma não é transplantado juntamente com o tecido hematopoiético, portanto, critérios rigorosos para avaliar o enxerto bem sucedido de células estromais administradas sistematicamente ainda não foram desenvolvidos. Deve-se lembrar que a presença de genes marcantes em extratos de tecido ou o isolamento na cultura de células de origem do doador não indica o enxerto de células, mas apenas a sua sobrevivência. Mesmo a injeção intra-arterial de células estromal da medula óssea no membro do mouse pode levar a um resultado praticamente zero do enxerto, apesar de as células de origem do doador serem encontradas em grande número dentro da rede microvascular da medula óssea. Infelizmente, tais células são geralmente descritas como "enxertadas" apenas com base nos resultados da determinação de genes dadores de marcadores em condições de cultura ex vivo. Além disso, é necessário fornecer evidências convincentes de integração a longo prazo nos tecidos de células diferenciadas e funcionalmente ativas da origem do doador. Em muitos trabalhos publicados, onde é relatado sobre o enxerto de células do estroma da medula óssea no esqueleto, a falta de dados claros desse tipo é impressionante. No entanto, deve-se notar que, em algumas experimentações corretas em animais, no entanto, foi estabelecido um enxerto limitado, mas real, de células progenitoras estromáticas após a administração sistêmica.

Esses dados são consistentes com os resultados do estudo da possibilidade de fornecer células precursoras de medula óssea miogênica aos músculos através do sistema vascular. No entanto, não se deve esquecer que os tecidos esqueléticos e musculares são formados durante o desenvolvimento e o crescimento com base em movimentos de células extravasculares que utilizam processos de migração que não envolvem circulação no sangue. Se existe realmente uma via circulatória independente para a entrega de células precursoras para tecidos em fase sólida, é possível permitir a existência de células progenitoras mesenquimatosas fisiologicamente circulantes? Qual é a origem dessas células no organismo em desenvolvimento e pós-natal, e como elas penetram na parede vascular? A solução dessas questões é absolutamente necessária e requer a análise pré-clínica mais completa. Mesmo após as respostas a essas questões serem encontradas, os aspectos cinéticos problemáticos associados ao crescimento esquelético e à remodelação do tecido conjuntivo permanecem sem solução. Ao mesmo tempo, o tratamento de distúrbios da osteogênese através da substituição de toda a população de células progenitoras esqueléticas mutadas com células estromal saudáveis parece ser uma perspectiva clínica real. Neste caso, as zonas locais de fratura ou deformação devido à osteogênese patológica, bem como mudanças destrutivas no tecido ósseo, podem ser corrigidas por células estaminais do estômago in vitro cultivadas. Portanto, a direção da pesquisa futura deve ser focada nos problemas de transformação ou correção genética de células progenitoras osteogênicas mutantes autólogas ex vivo.

A engenharia genética das células, a curto prazo ou permanente, tornou-se a base da biologia celular e molecular, fonte de muitas descobertas científicas sobre o papel das proteínas individuais no metabolismo celular in vitro e in vivo. O uso de tecnologias moleculares para corrigir a patologia hereditária e as doenças humanas é muito promissor para a medicina prática, uma vez que as propriedades das células estaminais do estroma da medula óssea permitem o desenvolvimento de esquemas de transplantes únicos para a correção de doenças genéticas do esqueleto. Nesse caso, as células progenitoras mesenquimatosas podem ser facilmente obtidas do destinatário futuro, elas são passíveis de manipulação genética e podem se multiplicar em grande número em um curto período de tempo. O uso de células-tronco mesenquimais evita as limitações e os riscos associados à entrega de material de informação genética diretamente ao paciente através de estruturas vívidas de vetores. Essa estratégia é aplicável a células estaminais embrionárias, no entanto, as células estromáticas pós-natais autólogas da medula óssea são o material mais preferido, pois sua administração exclui possíveis complicações imunológicas pós-transplante. Para alcançar um efeito de curto prazo, por exemplo, para acelerar a regeneração óssea, o método mais ideal é a modificação genética de células estaminais mesenquimais por meio de eletroposadores, fusão química, lipofecção, plasmídeos e construções adenovirais. Em particular, a transfecção viral nas células BMP-2 estromáticas da medula óssea foi eficaz na aceleração da regeneração dos ossos no politraumatismo experimental. A criação de estruturas vetoriais adenovirais é preferível devido à ausência de toxicidade. No entanto, a modificação genética das células estromais da medula óssea neste caso é caracterizada por uma estabilidade extremamente baixa. Além disso, as células de estroma de medula óssea transformadas normalmente requerem o uso de vetores portadores de informação genética 10 vezes mais infecciosa que outros tipos de células, o que aumenta significativamente a porcentagem de morte de células transfectadas.

Para o tratamento de doenças recessivas causadas por baixa ou zero atividade biológica de certos genes, é necessária uma modificação prolongada ou permanente de células estaminais mesenquimais, o que requer o uso de vírus adeno-associados, retrovírus, lentivírus ou quimeras adeno-retrovirais. Os locais de transporte desses vírus são capazes de transportar grandes transfetos de DNA (até 8 kb). A literatura científica já apareceu informação sobre a actividade biológica de células exógenas de medula óssea estromais transfectadas com construções retrovirais que codifica a síntese de moléculas reguladoras, e marcadores - IL-3, o CD2, o factor VIII, e as enzimas envolvidas na síntese de L-DOPA. Mas nestes trabalhos os autores apontam uma série de limitações que devem ser superadas antes da aplicação prática desta tecnologia. O primeiro problema é otimizar o processo de modificação MCK ex vivo. Sabe-se que uma proliferação prolongada (3-4 semanas) de células estromais da medula óssea in vitro reduz a sua transfecção. Ao mesmo tempo, vários ciclos de transfusão são necessários para alcançar um alto nível de modificação genética de MSCs. O segundo problema está relacionado à duração da expressão do gene terapêutico, que ainda não ultrapassa quatro meses. Uma diminuição natural da expressão genética efetiva deve-se à inativação de promotores e à morte de células modificadas. Na perspectiva geral de transferência de informação genética utilizando células estaminais mesenquimais resultados de estudos preliminares indicam a necessidade de optimização adicional de métodos de transfecção ex vivo, seleccionar um promotor adequado que regula a actividade biológica na direcção certa, e aumentar a capacidade das células do estroma da medula óssea modificados de auto-renovação in vivo após o transplante. Deve-se notar que o uso de projetos retrovirais para modificar as células estromais da medula óssea na direção certa nem sempre exige seu injerto obrigatório. As células estaminais mesenquimais transfectadas podem desempenhar uma função corretiva em um contexto de residência estável e sem incorporação física ativa obrigatória e funcionando no tecido conjuntivo. Neste caso, eles devem ser considerados como uma mini-bomba biológica, produzindo fator in vivo, cujo déficit determina a manifestação da patologia genética.

O uso de células de estroma de medula óssea transformadas para tratar uma patologia genética dominante caracterizada pela expressão de um gene com atividade biológica patológica ou anormal é muito mais problemático, pois, neste caso, é necessário bloquear a transmissão ou implementação de informações genéticas distorcidas. Um dos métodos de engenharia genética é a recombinação homóloga de células estaminais embrionárias para criar animais transgênicos. Contudo, é improvável que um grau extremamente baixo de recombinação homóloga combinado com problemas de identificação, separação e expansão de tais recombinantes promova a ampla aplicação deste método no futuro próximo, mesmo que novos métodos tecnológicos sejam desenvolvidos. A segunda abordagem para a terapia genética baseia-se na patologia de correcção automática dominante do ADN danificado como mutações genéticas pode ser corrigido por introdução do ADN exógeno com a sequência desejada (oligonucleótidos de ADN curto, ou oligonucletidos de ARN / ADN quimicos) que se ligam a homogos no genoma danificado. A terceira opção envolve bloquear a transmissão de informações patológicas, que é conseguida através do uso de oligonucleótidos especificamente projetados que se ligam a um gene específico para formar uma estrutura espiral ternária que exclui a possibilidade de transcrição.

Apesar do fato de que a correção da doença genética no nível do genoma continua sendo o método terapêutico mais ideal e preferido, o ARNm é também um vetor promissor (talvez ainda mais acessível) para bloquear o gene negativo dominante. Com a finalidade de inibir a tradução e / ou aumentar a degradação do mRNA, as moléculas de proteína com oligonucleótido anti-sentido ou sequências completas que bloqueiam a ligação do ARNm ao aparelho biossintético da célula foram usadas há muito tempo. Além disso, o RNA de cadeia dupla induz a rápida degradação do mRNA, cujo mecanismo ainda não está claro. No entanto, é improvável que a mera eliminação de mRNA transcrito a partir de um alelo mutante com mutações curtas ou únicas facilite a expressão do mRNA do alelo normal. Uma alternativa é o uso de ribosinas de cabeça de martelo e hairpin, que são capazes de se ligar a regiões altamente específicas de mRNA, seguido de indução de sua clivagem e inativação durante a tradução. Atualmente, está sendo estudada a possibilidade de usar este método no tratamento da osteogênese patológica. Não obstante o que é exactamente o objectivo - elementos genicos ou citoplasmáticos sucesso de nova tecnologia de terapia genética vai ser determinado pela eficiência da inclusão de reagentes nas células estromais de medula ex vivo, a escolha óptima de um vector particular e capacidade estável de células estaminais mesenquimais que expressam os factores desejados in vivo.

Assim, a descoberta de células-tronco mesenquimais com suas propriedades inesperadas cria um novo esquema conceitual para o desenvolvimento de linhas celulares. Mas para entender o papel biológico de células-tronco do estroma, de sua natureza, a capacidade de transdiferenciação ou desdiferenciação, sua importância fisiológica no processo de desenvolvimento embrionário, crescimento pós-natal, maturação e envelhecimento, bem como em doenças humanas exigem mais investigação interdisciplinar.