Células estaminais neurais

Evidências experimentais da possibilidade de regeneração de células do SNC foram obtidas muito antes da descoberta das células-tronco embrionárias em estudos que mostraram a presença de células no neocórtex, hipocampo e bulbos olfatórios do cérebro de ratos adultos que capturam 3H-timidina, ou seja, são capazes de síntese e divisão de proteínas. Na década de 60 do século passado, presumia-se que essas células eram precursoras de neurônios e estavam diretamente envolvidas nos processos de aprendizagem e memória. Um pouco mais tarde, a presença de sinapses em neurônios formados de novo foi revelada e surgiram os primeiros trabalhos sobre o uso de células-tronco embrionárias com o propósito de induzir neurogênese in vitro. No final do século XX, experimentos com a diferenciação direcionada de CTEs em células progenitoras neurais, neurônios dopaminérgicos e serotoninérgicos levaram a uma revisão das ideias clássicas sobre a capacidade de regeneração das células nervosas de mamíferos. Os resultados de vários estudos comprovaram de forma convincente tanto a realidade da reestruturação das redes neurais quanto a presença da neurogênese durante todo o período da vida pós-natal do organismo mamífero.

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Fontes de células-tronco neurais

Células-tronco neurais humanas são isoladas durante cirurgias na região subventricular dos ventrículos laterais e no giro dentado do hipocampo, cujas células formam neuroesferas (esferas neurais) em cultura e, após dispersão e pré-formação destas últimas, todos os principais tipos celulares do sistema nervoso central ou, em meio especial, novas microesferas. Em culturas em suspensão de tecido dissociado isolado das regiões periventriculares do cérebro embrionário, também surgem neuroesferas.

Marcadores de células cerebrais imaturas incluem nestina, beta-tubulina III (marcador de linhagem neuronal), vimentina, GFAP e NCAM, que são identificados imunocitoquimicamente usando anticorpos monoclonais. A nestina (proteína de neurofilamento intermediário tipo IV) é expressa por células neuroectodérmicas multipotentes. Essa proteína é usada para identificar e isolar células progenitoras neuroepiteliais multipotentes do SNC usando anticorpos monoclonais Rat-401, que podem detectar até 95% das células do tubo neural em embriões de ratos no décimo primeiro dia de gestação. A nestina não é expressa em descendentes diferenciados de células-tronco neurais, mas está presente em células progenitoras neurais iniciais, neurônios pós-mitóticos e neuroblastos iniciais. Esse marcador tem sido usado para identificar células progenitoras neuroepiteliais e para provar a existência de células-tronco no SNC. A vimentina (proteína de neurofilamento intermediário tipo III) é expressa por células progenitoras neurais e gliais, bem como neurônios, fibroblastos e células musculares lisas. Portanto, ambos os marcadores imuno-histoquímicos não possuem a especificidade necessária para identificar separadamente células-tronco neurais e células progenitoras. A beta-tubulina III estabelece a direção neuronal da diferenciação das células-tronco, enquanto os astrócitos tipo I são identificados pela expressão de GFAP, e os oligodendrócitos expressam especificamente galactocerebrosídeo (Ga!C).

FGF2 e EGF atuam como mitógenos para células progenitoras neurais, auxiliando na proliferação de células progenitoras indiferenciadas em cultura, com a formação de neuroesferas. A taxa de divisão de células-tronco neurais aumenta significativamente sob a influência de FGF2, bem como com o uso de uma combinação de FGF2 + EGF. Os efeitos proliferativos de FGF2 são mediados por receptores FGF2-R1. A heparina aumenta a afinidade de ligação do receptor FGF2 e aumenta drasticamente seu efeito mitogênico em células neuroepiteliais. Nos estágios iniciais da embriogênese, os receptores FGF2 são expressos no telencéfalo do rato, enquanto em estágios posteriores sua localização é limitada à zona ventricular. O pico de expressão de FGF2-R1 por células pós-mitóticas é observado após a conclusão do período inicial de neurogênese. O período inicial de desenvolvimento do telencéfalo é caracterizado por um baixo nível de expressão do receptor EGF, principalmente nas células da região ventral. Em estágios posteriores da embriogênese, a expressão de EGF-R aumenta na direção dorsal. No cérebro de roedores, o EGF possui alta afinidade pelo receptor do fator de crescimento transformador beta (TGF-beta-R), ao qual se liga preferencialmente. Evidências indiretas do papel funcional do EGF-R são fornecidas por dados sobre disgenesia cortical do prosencéfalo que ocorre no final da embriogênese e ontogênese pós-natal, diminuição da função do prosencéfalo, morte celular cortical e ectopia hipocampal em camundongos com gene knockout do receptor de EGF. Além disso, a presença de TGF-α no meio nutriente é absolutamente necessária para a formação de neuroesferas. Após a remoção dos fatores de crescimento do meio condicionado, as células param de se dividir e sofrem diferenciação espontânea com a formação de neurônios, astrócitos e oligodendroblastos.

Levando isso em consideração, a reagregação de células-tronco dissociadas e o cultivo de neuroesferas são realizados em meio nutriente contendo EGF e FGF básico ou FGF2, mas sem adição de soro. Foi demonstrado que o EGF induz a proliferação de células-tronco da zona subependimária dos ventrículos laterais, e o FGF básico promove a proliferação de células-tronco do estriado, hipocampo, neocórtex e nervo óptico do cérebro maduro. A combinação de EGF e FGF básico é absolutamente necessária para a proliferação ativa de células-tronco isoladas do epêndima do terceiro e quarto ventrículos do prosencéfalo, bem como do canal espinhal da medula espinhal torácica e lombar.

Após a dissociação, a suspensão de células-tronco neurais é cultivada em placas plásticas ou placas multipoços sem substrato adesivo para aumentar o tamanho das novas neuroesferas formadas, o que geralmente leva cerca de 3 semanas. O método de dispersão múltipla e reprodução de neuroesferas permite a obtenção de um número suficiente de clones lineares de células-tronco multipotentes para transplante intracerebral. Este princípio também é a base para a criação de um banco de células-tronco isoladas do cérebro embrionário humano. Sua clonagem a longo prazo (vários anos) permite a obtenção de linhagens estáveis de células-tronco neurais, a partir das quais neurônios catecolaminérgicos são formados durante a diferenciação induzida.

Se as neuroesferas não forem dispersas e cultivadas em substratos adesivos em meios sem fatores de crescimento, as células-tronco em proliferação começam a se diferenciar espontaneamente para formar células precursoras neuronais e gliais que expressam marcadores de todos os tipos de células nervosas: MAP2, Tau-1, NSE, NeuN, beta-tubulina III (neurônios), GFAP (astrócitos) e CalC, O4 (oligodendrócitos). Ao contrário das células de camundongo e rato, os neurônios representam mais de 40% de todas as células diferenciadas em culturas de células-tronco neurais humanas (de 1 a 5% em roedores), mas significativamente menos oligodendrócitos são formados, o que é muito importante do ponto de vista da terapia celular de doenças desmielinizantes. O problema é resolvido pela adição de meio de cultura B104, que estimula a formação de células produtoras de mielina.

Ao cultivar células progenitoras neurais do cérebro de embriões humanos em um meio contendo EGF, FGF básico e LIF, o número de células precursoras da linhagem neural aumenta 10 milhões de vezes. As células expandidas in vitro retêm a capacidade de migrar e se diferenciar em elementos neurais e gliais após o transplante para o cérebro de ratos adultos. No entanto, in vivo, o número de divisões de células precursoras multipotentes é limitado. Tem sido repetidamente observado que o limite de Hayflick para uma célula-tronco neural "adulta" (cerca de 50 mitoses) ainda é inatingível mesmo em um experimento - células na forma de neuroesferas retêm suas propriedades por apenas 7 meses e somente após 8 passagens. Acredita-se que isso se deva às peculiaridades de seus métodos de dispersão durante a passagem (tripsinização ou ação mecânica), que reduzem drasticamente a atividade proliferativa das células devido à interrupção dos contatos intercelulares. De fato, se, em vez da dispersão, for utilizado o método de divisão das neuroesferas em 4 partes, a viabilidade das células durante a passagem aumenta significativamente. Este método permite o cultivo de células-tronco neurais humanas por 300 dias. No entanto, após esse período, as células perdem a atividade mitótica e sofrem degeneração ou entram na fase de diferenciação espontânea com a formação de neurônios e astrócitos. Com base nisso, o autor acredita que 30 mitoses seja o número máximo de divisões para células-tronco neurais cultivadas.

Quando células-tronco neurais humanas são cultivadas in vitro, formam-se predominantemente neurônios GABAérgicos. Sem condições especiais, as células progenitoras neurais dão origem a neurônios dopaminérgicos (necessários para a terapia celular da doença de Parkinson) apenas nas primeiras passagens, após as quais todos os neurônios na cultura consistem exclusivamente de células GABAérgicas. Em roedores, IL-1 e IL-11, bem como fragmentos de membranas de células nervosas, LIF e GDNF, causam a indução de neurônios dopaminérgicos in vitro. No entanto, essa abordagem metodológica se mostrou ineficaz em humanos. No entanto, quando neurônios GABAérgicos são transplantados intracerebralmente in vivo, sob a influência de fatores microambientais, surgem células nervosas com diferentes fenótipos mediadores.

A busca por combinações de fatores neurotróficos mostrou que FGF2 e IL-1 induzem a formação de neuroblastos dopaminérgicos, os quais, no entanto, não são capazes de produzir neurônios dopaminérgicos. A diferenciação de células-tronco hipocampais em neurônios glutamatérgicos excitatórios e neurônios GABAérgicos inibitórios ocorre sob a influência de neurotrofinas, e EGF e IGF1 induzem a formação de neurônios glutamatérgicos e GABAérgicos a partir de células progenitoras neurais de embriões humanos. A adição sequencial de ácido retinoico e neurotrofina 3 (NT3) à cultura aumenta significativamente a diferenciação de células-tronco hipocampais cerebrais maduras em neurônios de várias naturezas mediadoras, enquanto uma combinação de fator neurotrófico derivado do cérebro (BNDF), NT3 e GDNF pode produzir neurônios piramidais em culturas hipocampais e neocorticais.

Assim, os resultados de numerosos estudos indicam que, em primeiro lugar, células-tronco de diferentes estruturas cerebrais, sob a influência de fatores teciduais locais específicos, são capazes de se diferenciar in vivo em fenótipos neuronais inerentes a essas estruturas. Em segundo lugar, a diferenciação induzida direcionada de células-tronco neurais in vitro, por meio da clonagem de células progenitoras, possibilita a obtenção de células nervosas e gliais com características fenotípicas específicas para transplante intracerebral em diversas formas de patologia cerebral.

Não há dúvida de que células-tronco pluripotentes isoladas de embriões ou do SNC adulto podem ser consideradas uma fonte de novos neurônios e utilizadas na clínica para o tratamento de patologias neurológicas. No entanto, o principal obstáculo ao desenvolvimento do neurotransplante celular prático é o fato de que a maioria das células-tronco neurais não se diferencia em neurônios após a implantação em zonas não neurogênicas do SNC maduro. Para contornar esse obstáculo, um método inovador muito original é proposto que permite a obtenção in vitro de uma população pura de neurônios a partir de células-tronco neurais fetais humanas após o transplante para o SNC de um rato maduro. Os autores comprovam que a diferenciação de células implantadas por esse método termina com a formação de neurônios do fenótipo colinérgico, o que se deve à influência de fatores do microambiente circundante. A tecnologia proposta é interessante do ponto de vista do desenvolvimento de novos tipos de terapia baseada em células-tronco e da substituição de neurônios danificados por lesão ou doença neurodegenerativa, uma vez que os neurônios colinérgicos desempenham um papel fundamental no desenvolvimento das funções motoras, de memória e de aprendizagem. Em particular, neurônios colinérgicos isolados de células-tronco humanas podem ser usados para substituir neurônios motores perdidos na esclerose lateral amiotrófica ou em lesões da medula espinhal. Atualmente, não há informações sobre métodos para produzir um número significativo de neurônios colinérgicos a partir de uma população de células-tronco pré-formadas por mitógeno. Os autores propõem um método bastante simples, mas eficaz, para estimular células-tronco neurais embrionárias humanas primárias pré-formadas por mitógeno a se desenvolverem em neurônios virtualmente puros após implantação em zonas neurogênicas e não neurogênicas do SNC de um rato adulto. O resultado mais importante de seu trabalho é a conversão de um número suficientemente grande de células transplantadas em neurônios colinérgicos quando implantadas na membrana média e na medula espinhal.

Além disso, para a pré-formação de células-tronco neurais do córtex cerebral embrionário humano de 8 semanas em neurônios colinérgicos in vitro, propõe-se o uso de várias combinações dos seguintes fatores tróficos e elementos químicos: FGF básico recombinante, EGF, LIF, peptídeo sonoro aminoterminal de camundongo (Shh-N), ácido trans-retinóico, NGF, BDNF, NT3, NT4, laminina natural e heparina de camundongo. A linhagem original de células-tronco neurais humanas (K048) foi mantida in vitro por dois anos e resistiu a 85 passagens sem alterações nas propriedades proliferativas e de diferenciação, mantendo um cariótipo diploide normal. Neuroesferas não dispersas das passagens 19–55 (semanas 38–52) foram plaqueadas em poli-d-lisina e laminina e então tratadas com os fatores mencionados acima em diferentes concentrações, combinações e sequências. A combinação de FGF básico, heparina e laminina (abreviada como FHL) produziu um efeito único. Após um dia de cultivo de células-tronco neurais embrionárias em meio FHL com ou sem Shh-N (a combinação de Shh-N + FHL na abreviação SFHL), observou-se uma rápida proliferação de grandes células planas. Todos os outros protocolos de um dia (como FGF básico + laminina), ao contrário, levaram a uma disseminação radial limitada de células fusiformes, e essas células não deixaram o núcleo das neuroesferas. Após 6 dias de ativação e 10 dias subsequentes de diferenciação em meio contendo B27, grandes células multipolares semelhantes a neurônios foram detectadas na borda das esferas ativadas por FHL. Em outros grupos de protocolo, a maioria das células semelhantes a neurônios permaneceu pequena e bipolar ou unipolar. A análise imuno-histoquímica mostrou que células bipolares ou unipolares pequenas (< 20 μm) eram gabaérgicas ou glutamatérgicas, enquanto a maioria das células multipolares grandes localizadas na borda das neuroesferas ativadas por FHL eram colinérgicas, expressando marcadores característicos de neurônios colinérgicos (Ilhota-1 e ChAT). Alguns desses neurônios expressavam simultaneamente sinapsina 1. Como resultado de cinco séries de experimentos independentes, os autores descobriram que a população total de células nas zonas de camada única se diferenciou em neurônios TuJ1+ em 45,5%, enquanto os neurônios colinérgicos (ChAT^) constituíram apenas 27,8% das células da mesma população. Após 10 dias de diferenciação adicional in vitro, além dos neurônios colinérgicos, um número significativo de pequenos neurônios foi encontrado nas neuroesferas ativadas por FHL - glutamatérgicas (6,3%), GABAérgicas (11,3%), bem como astrócitos (35,2%) e células nestina-positivas (18,9%). Ao usar outras combinações de fatores de crescimento, os neurônios colinérgicos estavam ausentes, e as células marginais das neuroesferas formaram astrócitos ou pequenos neurônios glutamatérgicas e GABAérgicas. O monitoramento dos potenciais de reserva e ativos usando a técnica de patch clamp de célula inteira mostrou que, após sete dias de ativação do FHL, a maioria das células polipolares grandes apresentou um potencial de repouso de -29,0 ± 2,0 mV na ausência de potencial de ação. Após 2 semanas, o potencial de repouso aumentou para -63.6±3,0 mV, e potenciais de ação foram observados no momento da indução de correntes despolarizantes e foram bloqueados por 1 M de tetrodotoxina, indicando a atividade funcional de neurônios imaturos colinérgicos.

Os autores estabeleceram ainda que a ativação de FHL ou SFHL in vitro por si só não resulta na formação de neurônios maduros e tentaram estabelecer se as células-tronco pré-formadas de FHL ou SFHL são capazes de se diferenciar em neurônios colinérgicos quando transplantadas para o SNC de ratos maduros. Para esse propósito, células ativadas foram injetadas na zona neurogênica (hipocampo) e em várias zonas não neurogênicas, incluindo o córtex pré-frontal, membrana média e medula espinhal de ratos adultos. As células implantadas foram rastreadas usando o vetor CAO-^^p. OCP é conhecido por marcar tanto a ultraestrutura celular quanto os processos celulares (nível molecular) sem vazamento e pode ser visualizado diretamente. Além disso, as células-tronco neurais marcadas com OCP mantêm um perfil de diferenciação neuronal e glial idêntico ao das células-tronco não transformadas do cérebro embrionário.

Uma a duas semanas após a implantação de 5 x 10 ⁴ células-tronco neurais ativadas e marcadas, elas foram encontradas na medula espinhal ou no cérebro de ratos, com células OCD+ localizadas principalmente perto do local da injeção. Os processos de migração e integração foram observados já um mês após o transplante. Os limites de migração variaram dependendo do local da injeção: quando injetadas no córtex pré-frontal, as células OCD+ estavam localizadas a 0,4-2 mm do local da injeção, enquanto no caso de implantação na membrana média, hipocampo ou medula espinhal, as células migraram distâncias muito maiores - até 1-2 cm. As células transplantadas estavam localizadas em estruturas altamente organizadas do SNC, incluindo o córtex frontal, membrana média, hipocampo e medula espinhal. Os elementos neuronais marcados com OCD eram visíveis já na primeira semana após o transplante, com seu número aumentando significativamente um mês após a operação. A análise estereológica mostrou uma maior taxa de sobrevivência das células implantadas em várias estruturas do cérebro, em comparação com a medula espinhal.

Sabe-se que, na maioria dos tecidos do organismo de mamíferos adultos, uma população de células-tronco regionais é preservada, cuja transformação em células maduras é regulada por fatores teciduais específicos. A proliferação de células-tronco, a diferenciação de células progenitoras e a formação de fenótipos neuronais específicos para uma determinada estrutura cerebral in vivo são expressas em extensão muito maior no cérebro embrionário, o que é determinado pela presença de altas concentrações de fatores morfogenéticos do microambiente local – neurotrofinas BDNF, NGF, NT3, NT4/5 e fatores de crescimento FGF2, TGF-α, IGF1, GNDF, PDGF.

Onde estão localizadas as células-tronco neurais?

Foi estabelecido que as células-tronco neurais expressam a proteína fibrilar ácida glial, que, entre as células maduras da linhagem neural, é retida apenas nos astrócitos. Portanto, as células astrocíticas podem ser a reserva-tronco no SNC maduro. De fato, neurônios originários de precursores GFAP-positivos foram identificados nos bulbos olfatórios e no giro dentado, o que contradiz as ideias tradicionais sobre o papel progenitor da glia radial, que não expressa GFAP no giro dentado na idade adulta. É possível que existam duas populações de células-tronco no SNC.

A questão da localização das células-tronco na zona subventricular também permanece obscura. Segundo alguns autores, as células ependimárias formam clones esféricos em cultura que não são neuroesferas verdadeiras (como os clones de células subependimárias), uma vez que são capazes de se diferenciar apenas em astrócitos. Por outro lado, após a marcação fluorescente ou viral das células ependimárias, o marcador é detectado nas células da camada subependimária e dos bulbos olfatórios. Essas células marcadas in vitro formam neuroesferas e se diferenciam em neurônios, astrócitos e oligodendrócitos. Além disso, foi demonstrado que cerca de 5% das células no epêndima expressam marcadores-tronco - nestina, Notch-1 e Mussashi-1. Supõe-se que o mecanismo da mitose assimétrica esteja associado à distribuição desigual do receptor de membrana Notch-1, como resultado do qual este último permanece na membrana da célula-filha localizada na zona ependimária, enquanto a célula-mãe que migra para a camada subependimária é privada deste receptor. Desse ponto de vista, a zona subependimária pode ser considerada um coletor de precursores progenitores de neurônios e glia formados a partir de células-tronco da camada ependimária. Segundo outros autores, apenas células gliais são formadas nas partes caudais da zona subventricular, e a fonte de neurogênese são as células da parte rostro-lateral. Na terceira variante, as partes anterior e posterior da zona subventricular dos ventrículos laterais recebem potencial neurogênico equivalente.

A quarta variante da organização da reserva-tronco no sistema nervoso central parece preferível, segundo a qual três tipos principais de células progenitoras neurais são distinguidos na zona subventricular - A, B e C. As células A expressam marcadores neuronais precoces (PSA-NCAM, TuJl) e são cercadas por células B, que são identificadas como astrócitos pela expressão de antígenos. As células C, não tendo características antigênicas de neurônios ou glia, têm alta atividade proliferativa. O autor provou de forma convincente que as células B são precursoras de células A e neurônios de novo dos bulbos olfatórios. Durante a migração, as células A são cercadas por filamentos de células progenitoras neurais, o que difere significativamente do mecanismo de migração de neuroblastos pós-mitóticos ao longo da glia radial no cérebro embrionário. A migração termina nos bulbos olfatórios com a divisão mitótica de células A e B, cujos derivados são incorporados nas camadas de células granulares e na camada glomerular da zona olfatória do cérebro.

O cérebro embrionário em desenvolvimento carece de células ependimárias diferenciadas, e as paredes ventriculares contêm células-tronco proliferantes das zonas germinativa e subventricular ventricular, para onde migram neuroblastos e glioblastos primários. Com base nisso, alguns autores acreditam que a região subependimária do cérebro maduro contém tecido neural germinativo embrionário reduzido, constituído por astrócitos, neuroblastos e células não identificadas. Células-tronco neurais verdadeiras constituem menos de 1% das células na zona germinativa da parede ventricular lateral. Em parte por essa razão, e também em conexão com os dados de que astrócitos da zona subependimária são precursores de células-tronco neurais, não se exclui a possibilidade de transdiferenciação de elementos gliais astrocíticos com a aquisição de características fenotípicas neuronais.

O principal obstáculo para uma solução definitiva para o problema da localização de células-tronco neurais in vivo é a falta de marcadores específicos para essas células. No entanto, muito interessantes do ponto de vista prático são os relatos de que células-tronco neurais foram isoladas de regiões do SNC que não contêm zonas subependimárias - o terceiro e quarto ventrículos do prosencéfalo, o canal espinhal das regiões torácica e lombar da medula espinhal. De particular importância é o fato de que a lesão medular aumenta a proliferação de células-tronco ependimárias do canal central com a formação de células progenitoras que migram e se diferenciam em astrócitos da cicatriz gliomesodérmica. Além disso, células precursoras de astro e oligodendrócitos também foram encontradas na medula espinhal intacta de ratos adultos.

Assim, os dados da literatura demonstram de forma convincente a presença, no SNC de mamíferos adultos, incluindo humanos, de uma reserva-tronco regional, cuja capacidade regenerativa-plástica, infelizmente, é capaz de suprir apenas os processos de regeneração fisiológica com a formação de novas redes neuronais, mas não atende às necessidades de regeneração reparadora. Isso coloca a tarefa de buscar oportunidades para aumentar os recursos-tronco do SNC por meios exógenos, o que é insolúvel sem uma compreensão clara dos mecanismos de formação do SNC no período embrionário.

Hoje sabemos que, durante o desenvolvimento embrionário, as células-tronco do tubo neural são a fonte de três tipos celulares: neurônios, astrócitos e oligodendrócitos, ou seja, neurônios e neuroglia se originam de uma única célula precursora. A diferenciação do ectoderma em grupos de células progenitoras neurais começa sob a influência dos produtos dos genes proneurais da família bHLH e é bloqueada pela expressão de derivados de proteínas transmembrana do receptor dos genes da família Notch, que limitam a determinação e a diferenciação precoce das células precursoras neurais. Por sua vez, os ligantes dos receptores Notch são as proteínas transmembrana Delta das células vizinhas, devido ao domínio extracelular do qual são realizados os contatos intercelulares diretos com interação indutiva entre as células-tronco.

A implementação posterior do programa de neurogênese embrionária não é menos complexa e, ao que parece, deve ser específica para cada espécie. No entanto, os resultados de estudos de neuroxenotransplante indicam que as células-tronco apresentam um conservadorismo evolutivo pronunciado, o que permite que as células-tronco neurais humanas migrem e se desenvolvam quando transplantadas para o cérebro de ratos.

Sabe-se que o SNC de mamíferos tem uma capacidade extremamente baixa de regeneração reparadora, que é caracterizada pela ausência de quaisquer sinais de surgimento de novos elementos celulares no cérebro maduro para substituir neurônios que morreram como resultado de lesão. No entanto, no caso do transplante de neuroblastos, estes últimos não apenas enxertam, proliferam e se diferenciam, mas também são capazes de se integrar em estruturas cerebrais e substituir funcionalmente neurônios perdidos. Ao transplantar células progenitoras neuronais comprometidas, o efeito terapêutico foi significativamente mais fraco. Tais células demonstraram ter uma baixa capacidade de migração. Além disso, as células progenitoras neuronais não reproduzem a arquitetura das redes neurais e não são funcionalmente integradas ao cérebro do receptor. Nesse sentido, questões de regeneração plástica-reparadora durante o transplante de células-tronco neurais multipotentes não pré-formadas estão sendo ativamente estudadas.

No estudo de M. Aleksandrova et al. (2001), na primeira versão dos experimentos, os receptores eram ratos fêmeas sexualmente maduros, e os doadores eram embriões de 15 dias de idade. Uma seção do córtex occipital do cérebro foi removida dos receptores, e tecido mecanicamente suspenso do córtex embrionário presuntivo contendo células-tronco multipotentes das regiões ventricular e subventricular foi transplantado para a cavidade. Na segunda versão dos experimentos, células-tronco neurais de um embrião humano de 9 semanas foram transplantadas para o cérebro de ratos sexualmente maduros. Os autores isolaram pedaços de tecido da região periventricular do cérebro embrionário, colocaram-nos em um meio nutriente F-12 e obtiveram uma suspensão de células por pipetagem repetida, e então as cultivaram em um meio NPBM especial com a adição de fatores de crescimento - FGF, EGF e NGF. As células foram cultivadas em uma cultura em suspensão até que as neuroesferas fossem formadas, as quais foram dispersas e novamente plantadas na cultura. Após 4 passagens com um período total de cultivo de 12 a 16 dias, as células foram utilizadas para transplante. Os receptores eram filhotes de ratos com dez dias de idade e ratos Wistar sexualmente maduros com dois meses de idade, aos quais 4 μl da suspensão de células-tronco neurais humanas foram injetados no ventrículo lateral do cérebro sem imunossupressão. Os resultados do trabalho mostraram que as células dissociadas da zona ventricular e subventricular da camada embrionária do córtex cerebral do rato continuaram seu desenvolvimento durante o alotransplante para o cérebro maduro, ou seja, os fatores do microambiente do cérebro diferenciado do receptor não bloquearam o crescimento e a diferenciação das células-tronco neurais do embrião. Nos estágios iniciais após o transplante, as células multipotentes continuaram a divisão mitótica e migraram ativamente da área de transplante para o tecido cerebral do receptor. Células embrionárias transplantadas com enorme potencial de migração foram encontradas em quase todas as camadas do córtex cerebral do receptor ao longo do trajeto do transplante e na substância branca. O comprimento do trato migratório das células nervosas sempre foi significativamente menor (até 680 μm) do que o dos elementos gliais (até 3 mm). Os vasos sanguíneos e as estruturas fibrosas do cérebro serviram como vetores estruturais para a migração dos astrócitos, o que também foi observado em outros estudos.

Anteriormente, acreditava-se que o acúmulo de astrócitos marcados na área de dano ao córtex cerebral do receptor poderia estar associado à formação de uma barreira glial entre os tecidos do transplante e do receptor. No entanto, um estudo da estrutura de transplantes de células compactamente localizados mostrou que sua citoarquitetura é caracterizada pelo caos, sem qualquer distribuição em camadas das células transplantadas. O grau de ordenação dos neurônios transplantados se aproximou do das células normais do córtex cerebral apenas na ausência de uma barreira glial entre os tecidos do doador e do receptor. Caso contrário, a estrutura das células transplantadas era atípica e os próprios neurônios estavam sujeitos à hipertrofia. Usando a tipagem neuroimunoquímica de células transplantadas, neurônios GABAérgicos inibitórios foram encontrados nos transplantes e a expressão das proteínas PARV, CALB e NPY foi detectada. Consequentemente, o cérebro maduro retém fatores microambientais capazes de suportar a proliferação, migração e diferenciação específica de células neurais multipotentes.

Na cultura de células-tronco humanas isoladas da região periventricular do cérebro de embriões de 9 semanas, M. Aleksandrova et al. (2001) encontraram um grande número de células multipotentes nestina-positivas na quarta passagem, algumas das quais já haviam sofrido diferenciação in vitro e estavam se desenvolvendo de acordo com o tipo neuronal, o que correspondeu aos resultados de estudos de outros autores. Após o transplante para o cérebro de ratos adultos, as células-tronco humanas cultivadas se dividiram mitoticamente e migraram para o tecido do cérebro receptor xenogênico. Nos transplantes de células, os autores observaram duas populações de células - pequena e maior. Estas últimas migraram tanto no parênquima quanto ao longo das estruturas de fibras do cérebro receptor em distâncias insignificantes - dentro de 300 μm. A maior extensão do caminho de migração (até 3 mm) foi característica de células pequenas, algumas das quais se diferenciaram em astrócitos, o que foi estabelecido usando anticorpos monoclonais para GFAP. Ambos os tipos celulares foram encontrados na parede do ventrículo lateral, indicando que as células transplantadas entraram no trato de migração rostral. Derivados astrocíticos de células-tronco neurais de humanos e ratos migraram predominantemente através dos capilares sanguíneos e das estruturas fibrosas do cérebro receptor, o que coincide com os dados de outros autores.

A análise da diferenciação de células-tronco humanas in vivo usando anticorpos monoclonais para GFAP, CALB e VIM revelou a formação de astrócitos e neurônios. Ao contrário das células em transplantes de ratos, muitas células-tronco humanas eram positivas para vimentina. Consequentemente, algumas das células multipotentes humanas não sofreram diferenciação. Os mesmos autores demonstraram posteriormente que células-tronco neurais humanas transplantadas sem imunossupressão sobrevivem no cérebro de ratos por 20 dias após o transplante, sem sinais de agressão imunológica dos elementos gliais do cérebro maduro.

Foi estabelecido que mesmo células-tronco neurais de Drosophila enxertam e sofrem diferenciação no cérebro de um táxon tão distante dos insetos quanto o rato. A exatidão do experimento dos autores é inquestionável: linhagens transgênicas de Drosophila continham genes para os fatores neurotróficos humanos NGF, GDNF e BDNF, inseridos no vetor CaSper sob o promotor de choque térmico de Drosophila, de modo que a temperatura corporal dos mamíferos evocava automaticamente sua expressão. Os autores identificaram células de Drosophila pelo produto do gene da galactosidase bacteriana usando coloração histoquímica X-Gal. Além disso, descobriu-se que as células-tronco neurais de Drosophila respondem especificamente a fatores neurotróficos codificados por genes humanos: ao xenotransplantar células de uma linhagem transgênica de Drosophila contendo o gene gdnf, a síntese de tirosina hidroxilase em suas células-tronco neurais em diferenciação aumentou acentuadamente, e células com o gene ngf produziram ativamente acetilcolinesterase. O xenotransplante induziu reações dependentes de genes semelhantes no alotransplante de tecido neural embrionário transplantado junto com ele.

Isso significa que a diferenciação específica de células-tronco neurais é induzida por fatores neurotróficos não específicos da espécie? De acordo com os resultados dos autores, o xenoenxerto que produz fatores neurotróficos teve um efeito específico no destino dos aloenxertos, que, neste caso, se desenvolveram mais intensamente e eram 2 a 3 vezes maiores em tamanho do que os aloenxertos introduzidos no cérebro sem a adição de xenoenxertos. Consequentemente, células xenograftadas contendo genes de neurotrofina, em particular o gene que codifica o fator neurotrófico derivado de células gliais humanas (GDNF), têm um efeito não específico da espécie no desenvolvimento do aloenxerto semelhante à ação da neurotrofina correspondente. O GDNF é conhecido por aumentar a sobrevivência de neurônios dopaminérgicos no mesencéfalo embrionário de ratos e aumentar o metabolismo da dopamina por essas células, além de induzir a diferenciação de células tirosina hidroxilase positivas, aumentando o crescimento axonal e o tamanho do corpo celular neuronal. Efeitos semelhantes também são observados em neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo de ratos cultivados.

A migração ativa de células-tronco neurais humanas é observada após xenotransplante no cérebro de ratos adultos. Sabe-se que o processo de migração e diferenciação de células-tronco neurais é controlado por um conjunto de genes especiais. O sinal inicial de migração para a célula precursora para iniciar a diferenciação é dado pelo produto proteico do protooncogene c-ret juntamente com GDNF. O próximo sinal vem do gene mash-1, que controla a escolha do caminho de desenvolvimento celular. Além disso, a reação específica das células em diferenciação também depende do receptor α do fator neurotrófico ciliar. Assim, dada a constituição genética completamente diferente das células-tronco neurais humanas xenogênicas e das células cerebrais de ratos receptores, é necessário reconhecer não apenas a inespecificidade da espécie dos fatores neurotróficos, mas também o mais alto conservadorismo evolutivo dos genes responsáveis pela diferenciação específica dos elementos-tronco neurais.

O futuro mostrará se o xenotransplante de neuromaterial embrionário será possível na prática neurocirúrgica do tratamento de processos patológicos neurodegenerativos causados pela interrupção da síntese de mielina por oligodendrócitos. Enquanto isso, as questões mais intensamente abordadas no neurotransplante são aquelas relacionadas à obtenção de células-tronco neurais alogênicas do cérebro embrionário ou maduro em cultura, com sua subsequente diferenciação direcionada em neuroblastos ou neurônios especializados.

Transplante de células-tronco neurais

Para estimular a proliferação e a diferenciação de células-tronco neurais de um organismo adulto, pode-se transplantar tecido nervoso embrionário. É possível que as células-tronco do tecido nervoso embrionário, trazidas com o aloenxerto, possam, elas próprias, proliferar e se diferenciar. Sabe-se que, após uma lesão medular, a regeneração dos condutores nervosos ocorre por meio do alongamento de axônios danificados e do brotamento colateral de axônios de processos íntegros de neurônios motores. Os principais fatores que impedem a regeneração da medula espinhal são a formação de uma cicatriz de tecido conjuntivo na área danificada, alterações distróficas e degenerativas em neurônios centrais, deficiência de NGF e a presença de produtos de degradação da mielina na área danificada. Foi demonstrado que o transplante de diferentes tipos de células na medula espinhal danificada - fragmentos do nervo ciático de animais adultos, córtex occipital embrionário, hipocampo, medula espinhal, células de Schwann, astrócitos, microglia, macrófagos, fibroblastos - promove a regeneração de axônios danificados por brotamento e permite que axônios recém-formados cresçam através da zona de lesão da medula espinhal. Foi comprovado experimentalmente que o transplante de tecido nervoso embrionário na área de lesão da medula espinhal, através da ação de fatores neurotróficos, acelera o crescimento de axônios danificados, previne a formação de cicatriz glial e o desenvolvimento de processos distróficos e degenerativos em neurônios centrais, enquanto as células do tecido nervoso embrionário transplantado sobrevivem na medula espinhal, integram-se aos tecidos adjacentes e promovem o crescimento do axônio através da área de lesão com a formação de sinapses dendríticas nos neurônios espinhais.

Esta área da medicina regenerativa-plástica recebeu o maior desenvolvimento na Ucrânia graças ao trabalho da equipe científica liderada por V.I. Tsymbalyuk. Em primeiro lugar, trata-se de estudos experimentais sobre a eficácia do transplante de tecido nervoso embrionário em lesões da medula espinhal. Durante o autotransplante do nervo periférico, os autores observaram as alterações destrutivas mais pronunciadas na zona de sutura distal, onde, no 30º dia após a operação, foram combinadas com processos reparadores. Durante o alotransplante, o estado morfofuncional do nervo implantado no 30º dia foi caracterizado por destruição pronunciada com degeneração gordurosa e amiloidose, em um contexto de infiltração focal de células linfoides inflamatórias com atrofia predominante das células de Schwann. O transplante de tecido nervoso embrionário contribuiu para a restauração da condutividade da medula espinhal em maior extensão, especialmente em animais submetidos à cirurgia durante as primeiras 24 horas após a lesão: no contexto de uma diminuição na intensidade dos processos inflamatórios e destrutivos, hipertrofia e hiperplasia de elementos ultraestruturais sintetizadores de proteínas e produtores de energia dos neurônios espinhais, hipertrofia e hiperplasia de oligodendrócitos foram observadas, a amplitude do potencial de ação muscular foi restaurada em 50% e a velocidade de condução do impulso em 90%. Ao avaliar a eficácia do transplante de tecido nervoso embrionário dependendo da zona de transplante, verificou-se que os melhores resultados foram observados quando o enxerto foi introduzido diretamente na zona de lesão da medula espinhal. Com a transecção completa da medula espinhal, o transplante de tecido nervoso embrionário foi ineficaz. Estudos dinâmicos demonstraram que o momento ideal para a realização do transplante de tecido nervoso embrionário são as primeiras 24 horas após a lesão da medula espinhal, enquanto a realização da cirurgia durante o período de alterações isquêmico-inflamatórias secundárias pronunciadas que ocorrem no 2º ao 9º dia após a lesão deve ser considerada inadequada.

Sabe-se que o traumatismo cranioencefálico grave provoca ativação potente e prolongada da peroxidação lipídica nos estágios inicial e intermediário do período pós-traumático, tanto no tecido cerebral lesionado quanto no corpo como um todo, e também interrompe os processos do metabolismo energético no cérebro lesionado. Nessas condições, o transplante de tecido nervoso embrionário para a área da lesão traumática promove a estabilização dos processos de peroxidação lipídica e aumenta o potencial do sistema antioxidante do cérebro e do corpo como um todo, aumentando sua proteção antirradicalar no 35º ao 60º dia do período pós-traumático. No mesmo período após o transplante de tecido nervoso embrionário, o metabolismo energético e os processos de fosforilação oxidativa no cérebro são normalizados. Além disso, foi demonstrado que, no primeiro dia após o traumatismo cranioencefálico experimental, a impedância do tecido do hemisfério lesionado diminui em 30 a 37%, e a contralateral em 20%, o que indica o desenvolvimento de edema cerebral generalizado. Em animais submetidos a transplante de tecido nervoso embrionário, a involução do edema ocorreu significativamente mais rápido – já no sétimo dia, o valor médio da impedância dos tecidos do hemisfério lesionado atingiu 97,8% do nível de controle. Além disso, a restauração completa dos valores de impedância no 30º dia foi observada apenas em animais que receberam transplante de tecido nervoso embrionário.

A morte de alguns neurônios no cérebro após uma lesão craniocerebral grave é uma das principais causas de complicações pós-traumáticas. Neurônios dos sistemas dopaminérgicos e noradrenérgicos integradores do mesencéfalo e da medula oblonga são especialmente sensíveis à lesão. Uma diminuição nos níveis de dopamina no complexo estriopalidal e no córtex cerebral aumenta significativamente o risco de desenvolver distúrbios motores e mentais, estados epileptiformes, e uma diminuição na produção de dopamina no hipotálamo pode ser a causa de numerosos distúrbios vegetativos e somáticos observados no período pós-traumático tardio. Os resultados de estudos conduzidos em lesão craniocerebral experimental indicam que o transplante de tecido nervoso embrionário ajuda a restaurar os níveis de dopamina no hemisfério cerebral lesionado, dopamina e norepinefrina no hipotálamo e aumenta os níveis de norepinefrina e dopamina no mesencéfalo e na medula oblonga. Além disso, como resultado do transplante de tecido nervoso embrionário no hemisfério lesionado do cérebro de animais experimentais, a porcentagem de fosfolipídios é normalizada e o conteúdo de ácidos graxos aumenta (C16:0, C17:0, C17:1, C18:0, C18:1 + C18:2, C20:3 + C20:4, C20:5).

Esses dados confirmam a estimulação de processos regenerativos-plásticos pelo tecido nervoso embrionário transplantado e indicam o efeito reparador-trófico do transplante no cérebro do receptor como um todo.

A experiência clínica da equipe do Instituto de Neurocirurgia AP Romodanov da Academia de Ciências Médicas da Ucrânia em transplante de tecido nervoso embrionário em paralisia cerebral, uma patologia extremamente complexa com disfunção motora grave, merece atenção especial. As formas clínicas de paralisia cerebral dependem do nível de dano às estruturas integrais responsáveis pela regulação do tônus muscular e pela formação de estereótipos motores. Atualmente, há evidências suficientes para sustentar o fato de que alterações patológicas no sistema de controle motor estriopalidal-tálamo-cortical desempenham um papel importante nos distúrbios da função motora e do tônus muscular. A ligação estriopalidal desse sistema realiza a função de controle por meio da produção de dopamina nigroestriatal. A via direta para a implementação do controle tálamo-cortical começa nos neurônios do putâmen, é mediada pelo ácido gama-aminobutírico (GABA) e pela substância P e é projetada diretamente na zona motora do segmento interno do globo pálido e da substância negra. A via indireta, cujo efeito é realizado com a participação de GABA e encefalina, origina-se de neurônios do putâmen e afeta os núcleos dos gânglios da base por meio de uma sequência de conexões que inclui o segmento externo do globo pálido e o núcleo subtalâmico. Distúrbios na condutividade da via direta causam hipocinesia, enquanto uma diminuição na condutividade das estruturas da via indireta leva à hipercinesia com alterações correspondentes no tônus muscular. A integridade das vias de condução GABAérgicas em diferentes níveis do sistema de controle motor e a integração das conexões dopaminérgicas no nível do putâmen são essenciais para a regulação das interações tálamo-corticais. A manifestação mais comum de patologia motora em várias formas de paralisia cerebral é uma violação do tônus muscular e uma alteração intimamente relacionada na atividade muscular reflexa.

O transplante de tecido nervoso embrionário na paralisia cerebral requer uma análise completa da natureza do dano às estruturas cerebrais. Com base na determinação dos níveis de dopamina e GABA no líquido cefalorraquidiano subaracnóideo, os autores detalharam o nível de interrupção da integração das estruturas cerebrais funcionais, o que tornou possível objetivar os resultados da intervenção cirúrgica e corrigir neurotransplantes repetidos. Tecido nervoso embrionário (material de aborto de um embrião de 9 semanas) foi transplantado para o parênquima do córtex das circunvoluções pré-centrais dos hemisférios cerebrais, dependendo da gravidade das alterações atróficas. Não foram observadas complicações ou deterioração da condição dos pacientes no período pós-operatório. Dinâmica positiva foi observada em 63% dos pacientes com formas espásticas, em 82% das crianças com a forma atônico-estética e apenas em 24% dos pacientes com a forma mista da doença. Foi estabelecido um efeito negativo de um alto nível de neurossensibilização com a presença de autoanticorpos para proteínas neuroespecíficas nos resultados da operação. O transplante de tecido nervoso embrionário mostrou-se ineficaz em pacientes com idade igual ou superior a 8 a 10 anos, bem como em casos de síndrome hipercinética grave e epilepsia. Clinicamente, a eficácia do transplante de tecido nervoso embrionário em pacientes com formas espásticas de paralisia cerebral manifestou-se pela formação de novas habilidades estatomotoras e movimentos voluntários com correção do estereótipo motor patológico e diminuição do grau de espasticidade, posturas e atitudes patológicas. Os autores acreditam que o efeito positivo do transplante de tecido nervoso embrionário é resultado do efeito normalizador sobre a atividade funcional das estruturas supraespinais envolvidas na regulação do tônus postural e dos movimentos voluntários. Ao mesmo tempo, os efeitos clínicos positivos do transplante de tecido nervoso embrionário são acompanhados por uma diminuição do conteúdo de neurotransmissores no líquido cefalorraquidiano subaracnóideo, o que indica a restauração das interações integrais das estruturas cerebrais afetadas.

Existe outra forma grave de patologia neurológica - a síndrome apálica, cujo problema de tratamento, infelizmente, está longe de ser resolvido. A síndrome apálica é uma condição polietiológica subaguda ou crônica que ocorre como resultado de lesões orgânicas graves do sistema nervoso central (principalmente do córtex cerebral) e é caracterizada pelo desenvolvimento de panapraxia e panagnosia com função relativamente preservada das seções do tronco segmentar e formações do complexo límbico-reticular do cérebro. Estudos de acompanhamento (de 1 a 3 anos) mostraram que a síndrome apálica não é um diagnóstico final de dano persistente ao sistema nervoso em crianças, mas se transforma em demência orgânica ou em estado vegetativo crônico. No Departamento de Neurocirurgia Restauradora do Instituto de Neurocirurgia AP Romodanov da Academia de Ciências Médicas da Ucrânia, 21 pacientes com as consequências da síndrome apálica foram submetidos a transplante de tecido nervoso embrionário. Sob anestesia geral, uma broca de coroa foi usada para fazer um orifício de trepanação sobre a área das alterações atróficas mais pronunciadas reveladas por tomografia computadorizada ou ressonância magnética e, na presença de atrofia difusa da substância cinzenta ou branca, o transplante foi introduzido nos giros pré-central e central do cérebro. Após a abertura da dura-máter, pedaços de tecido do córtex sensório-motor de embriões de 8 a 9 semanas foram implantados intracorticalmente usando um dispositivo especial. O número de amostras de tecido implantadas variou de 4 a 10, o que foi determinado pelo tamanho do orifício de trepanação e pelo tamanho das alterações locais na substância cerebral. Ao contrário de outros tipos de patologia, na síndrome apálica os autores procuraram implantar o máximo de tecido embrionário possível nas áreas mais acessíveis do cérebro. A dura-máter foi suturada e a cirurgia plástica do defeito do crânio foi realizada. Durante a operação, todos os pacientes apresentaram alterações significativas tanto no córtex (atrofia, ausência de circunvoluções, alteração na cor e pulsação da substância encefálica) quanto nas meninges (espessamento da dura-máter, espessamento significativo da membrana aracnoide com a presença de seus próprios vasos sanguíneos, fusão das membranas com a substância encefálica subjacente). Essas alterações foram mais pronunciadas em pacientes com histórico de lesões cerebrais inflamatórias. Em pacientes submetidos à hipóxia do SNC, predominaram alterações atróficas difusas na substância encefálica, especialmente no córtex, com aumento do espaço subaracnóideo, sem alterações significativas nas meninges. Metade dos pacientes apresentou aumento do sangramento de tecidos moles, ossos e substância encefálica. Após as operações, dentro de seis meses a três anos, a condição melhorou em 16 pacientes e permaneceu inalterada em cinco pacientes. Dinâmica positiva foi observada tanto na esfera motora quanto na mental. O tônus muscular diminuiu em dez pacientes. Em 11 pacientes, a atividade motora aumentou (paresia diminuída,coordenação dos movimentos melhorada), em cinco crianças, a capacidade de manipulação dos membros superiores aumentou significativamente. Em quatro pacientes, a frequência e a gravidade das crises epilépticas diminuíram, e em uma criança não houve nenhuma convulsão durante todo o período de observação após a operação. A agressividade diminuiu em duas crianças, em dois pacientes com distúrbios bulbares graves, o ato de engolir melhorou, duas crianças conseguiram mastigar independentemente já 2 semanas após a operação. Foi observada uma diminuição na gravidade dos transtornos mentais, nove crianças ficaram mais calmas após a operação, o sono e a atenção melhoraram em sete pacientes. Três pacientes com as consequências da síndrome apálica começaram a reconhecer seus pais, um - a seguir instruções, dois - a pronunciar palavras, em três, o grau de disartria diminuiu. Os autores observam que uma melhora notável na condição dos pacientes começa 2 meses após a operação, atinge um máximo em 5-6 meses, então a taxa de melhora diminui e até o final do ano o processo se estabiliza em 50% dos pacientes. O efeito positivo do neurotransplante serviu de base para uma segunda operação em seis pacientes com as consequências da síndrome apálica, mas no outro hemisfério cerebral. A técnica e os métodos do segundo transplante foram idênticos aos da primeira operação, mas o efeito clínico da segunda operação foi menor, embora não tenham surgido complicações graves após a primeira ou a segunda intervenção cirúrgica. Segundo os autores, o mecanismo do efeito terapêutico do neurotransplante está associado ao efeito neurotrófico do tecido nervoso embrionário transplantado, que contém um grande número de substâncias de crescimento, hormonais e outras substâncias biologicamente ativas que estimulam a reparação de neurônios danificados e a reorganização plástica do tecido cerebral do receptor. Também é possível um efeito ativador na atividade de células nervosas que foram previamente preservadas morfologicamente, mas perderam sua atividade funcional devido à doença. É o rápido efeito neurotrófico que pode explicar a melhora das funções bulbares em algumas crianças já ao final da primeira ou segunda semana após a operação. Supõe-se que, além disso, por volta do terceiro ou quarto mês, sejam estabelecidas conexões morfofuncionais entre o transplante e o cérebro do hospedeiro, por meio das quais o neurotransplante substitui as funções das células cerebrais mortas, que são o substrato para a melhora das funções motoras e mentais dos pacientes. Duas crianças já conseguiam mastigar independentemente duas semanas após a operação. Observou-se uma diminuição na gravidade dos transtornos mentais; nove crianças ficaram mais calmas após a operação; o sono e a atenção melhoraram em sete pacientes. Três pacientes com as consequências da síndrome apálica começaram a reconhecer seus pais; um, a seguir instruções; dois, a pronunciar palavras.em três, o grau de disartria diminuiu. Os autores observam que uma melhora notável na condição dos pacientes começa 2 meses após a operação, atinge um máximo em 5 a 6 meses, então a taxa de melhora diminui e, ao final do ano, o processo se estabiliza em 50% dos pacientes. O efeito positivo do neurotransplante serviu de base para uma segunda operação em seis pacientes com consequências da síndrome apálica, mas no outro hemisfério do cérebro. A técnica e o método do segundo transplante foram idênticos aos da primeira operação, mas o efeito clínico da segunda operação foi menor, embora não tenha havido complicações graves após a primeira ou a segunda intervenção cirúrgica. Segundo os autores, o mecanismo do efeito terapêutico do neurotransplante está associado ao efeito neurotrófico do tecido nervoso embrionário transplantado, que contém uma grande quantidade de substâncias de crescimento, hormonais e outras substâncias biologicamente ativas que estimulam a reparação de neurônios danificados e a reorganização plástica do tecido cerebral do receptor. Também é possível um efeito ativador na atividade de células nervosas que estavam previamente preservadas morfologicamente, mas perderam sua atividade funcional devido à doença. É justamente o rápido efeito neurotrófico que pode explicar a melhora das funções bulbares em algumas crianças já ao final da primeira ou segunda semana após a cirurgia. Supõe-se que, junto com isso, por volta do terceiro ou quarto mês, sejam estabelecidas conexões morfofuncionais entre o transplante e o cérebro do hospedeiro, por meio das quais o neurotransplante substitui as funções das células cerebrais mortas, que são o substrato para a melhora das funções motoras e mentais dos pacientes. Duas crianças conseguiram mastigar independentemente já duas semanas após a operação. Observou-se uma diminuição na gravidade dos transtornos mentais, nove crianças ficaram mais calmas após a operação, e o sono e a atenção melhoraram em sete pacientes. Três pacientes com as consequências da síndrome apálica começaram a reconhecer seus pais, um a seguir instruções, dois a pronunciar palavras e, em três, o grau de disartria diminuiu. Os autores observam que uma melhora perceptível na condição dos pacientes começa 2 meses após a operação, atinge o máximo em 5 a 6 meses, depois a taxa de melhora diminui e, ao final do ano, o processo se estabiliza em 50% dos pacientes. O efeito positivo do neurotransplante serviu de base para uma segunda operação em seis pacientes com consequências da síndrome apálica, mas no outro hemisfério cerebral. A técnica e o método do segundo transplante foram idênticos aos da primeira operação, mas o efeito clínico da segunda operação foi menor, embora não tenha havido complicações graves após a primeira ou a segunda intervenção cirúrgica. Segundo os autores,O mecanismo do efeito terapêutico do neurotransplante está associado ao efeito neurotrófico do tecido nervoso embrionário transplantado, que contém um grande número de substâncias de crescimento, hormonais e outras substâncias biologicamente ativas que estimulam a reparação de neurônios danificados e a reorganização plástica do tecido cerebral do receptor. Um efeito ativador na atividade de células nervosas que foram previamente preservadas morfologicamente, mas perderam sua atividade funcional devido à doença, também é possível. É precisamente o rápido efeito neurotrófico que pode explicar a melhora das funções bulbares em algumas crianças já ao final da primeira ou segunda semana após a cirurgia. Supõe-se que, juntamente com isso, por volta do terceiro ou quarto mês, conexões morfofuncionais sejam estabelecidas entre o transplante e o cérebro do hospedeiro, por meio das quais o neurotransplante substitui as funções das células cerebrais mortas, que são o substrato para a melhora das funções motoras e mentais dos pacientes, embora nenhuma complicação grave tenha surgido após a primeira ou a segunda intervenção cirúrgica. Segundo os autores, o mecanismo do efeito terapêutico do neurotransplante está associado ao efeito neurotrófico do tecido nervoso embrionário transplantado, que contém um grande número de substâncias de crescimento, hormonais e outras substâncias biologicamente ativas que estimulam a reparação de neurônios danificados e a reorganização plástica do tecido cerebral do receptor. Também é possível um efeito ativador na atividade de células nervosas que foram previamente preservadas morfologicamente, mas perderam sua atividade funcional devido à doença. É justamente o rápido efeito neurotrófico que pode explicar a melhora das funções bulbares em algumas crianças já ao final da primeira ou segunda semana após a cirurgia. Supõe-se que, juntamente com isso, por volta do terceiro ou quarto mês, conexões morfofuncionais sejam estabelecidas entre o transplante e o cérebro do hospedeiro, por meio das quais o neurotransplante substitui as funções das células cerebrais mortas, que são o substrato para a melhora das funções motoras e mentais dos pacientes, embora nenhuma complicação grave tenha surgido após a primeira ou a segunda intervenção cirúrgica. Segundo os autores, o mecanismo do efeito terapêutico do neurotransplante está associado ao efeito neurotrófico do tecido nervoso embrionário transplantado, que contém uma grande quantidade de substâncias de crescimento, hormonais e outras substâncias biologicamente ativas que estimulam a reparação de neurônios danificados e a reorganização plástica do tecido cerebral do receptor. Também é possível um efeito ativador na atividade de células nervosas que estavam previamente preservadas morfologicamente, mas perderam sua atividade funcional devido à doença.É justamente o rápido efeito neurotrófico que pode explicar a melhora das funções bulbares em algumas crianças já ao final da primeira ou segunda semana após a cirurgia. Supõe-se que, paralelamente a isso, por volta do terceiro ou quarto mês, sejam estabelecidas conexões morfofuncionais entre o transplante e o cérebro do hospedeiro, por meio das quais o neurotransplante substitui as funções das células cerebrais mortas, que são o substrato para a melhora das funções motoras e mentais dos pacientes.

O efeito do transplante de tecido nervoso embrionário na reorganização das interconexões interneuronais foi estudado experimentalmente. Os autores estudaram os padrões de restauração das conexões axonais intermodulares na área de dano mecânico ao córtex cerebral em ratos brancos com e sem transplante de tecido nervoso embrionário usando o marcador lipofílico fluorescente DIL (perclorato de 1,1-dioctadecil-3,3,33'-tetrametilindocarbocianina) e varredura a laser confocal. Foi descoberto que a introdução de tecido nervoso embrionário na área de dano garante o crescimento de axônios, que após passarem pelo transplante se conectam com o tecido cerebral adjacente, enquanto sem o transplante de tecido nervoso embrionário a área de dano é um obstáculo intransponível para o crescimento de axônios. Neste trabalho, foi realizado o transplante de neocórtex embrionário (15-17º dia de gestação). Os resultados obtidos pelos autores constituem mais uma evidência a favor da influência ativa do transplante de tecido nervoso embrionário na reorganização pós-traumática das relações interneuronais dos módulos estruturais e funcionais vizinhos do córtex cerebral. O transplante de tecido nervoso embrionário proporciona a restauração parcial das conexões entre áreas danificadas do córtex cerebral, criando condições favoráveis ao crescimento axonal na zona de ação dos fatores neurotróficos do transplante. A existência de tal efeito foi comprovada experimentalmente e é discutida na literatura como evidência da alta capacidade plástica do cérebro danificado de animais sexualmente maduros. Nesse sentido, o transplante de células é atualmente considerado uma estratégia terapêutica ideal para restaurar a função do SNC humano danificado.

Os dados obtidos pelos autores sobre a eficiência do uso de tecido nervoso embrionário do cérebro como meio de transplante exógeno para crescimento de axônios confirmam as perspectivas de criação direcionada de elos de comunicação entre áreas adjacentes intactas do cérebro. O trabalho sobre o estudo do efeito do transplante de tecido nervoso na dinâmica dos parâmetros funcionais do sistema nervoso central parece relevante. A tarefa do trabalho foi investigar o efeito do transplante do locus coeruleus (LC) embrionário nos índices morfofuncionais dos neurônios do LC e na atividade locomotora dos receptores. Os receptores eram ratas Wistar fêmeas, e os doadores eram embriões de 18 dias de idade de ratos da mesma linhagem. O transplante de LC embrionário foi realizado na cavidade do terceiro ventrículo do cérebro. Histologicamente, o enxerto do enxerto foi detectado em 75% dos animais receptores. Nos casos de enxerto, o enxerto estava adjacente à parede ventricular, preenchendo 1/5-2/5 de seu lúmen, e era viável. Aos 1 e 6 meses após a operação, o tecido nervoso transplantado, de acordo com suas características morfológicas, representava estruturas que teriam surgido durante seu desenvolvimento ontogenético normal, ou seja, estruturas de LC. Os dados obtidos pelos autores indicam que, em animais aos quais a anlage de LC embrionária foi transplantada, a atividade dinâmica muda e a atividade da matriz da cromatina dos núcleos das células de LC aumenta. Consequentemente, a atividade dos neurônios de seu próprio LC se intensifica, mas o transplante enxertado também é funcionalmente ativo. Sabe-se que a chamada região locomotora do mesencéfalo praticamente coincide com a localização do LC. Os autores acreditam que a base para a mudança na atividade motora de ratos receptores é a ativação das células de LC, tanto as suas quanto as do transplante, com a liberação de grande quantidade de norepinefrina, inclusive nos segmentos da medula espinhal. Assim, supõe-se que o aumento da atividade motora em condições de transplante de LC no cérebro intacto de animais seja devido à presença de um transplante funcionalmente ativo integrado ao cérebro do receptor e contribuindo para a ativação da atividade locomotora em ratos.

Além disso, foi demonstrado que células neuroepiteliais transplantadas dos rudimentos embrionários do neocórtex e da medula espinhal sobrevivem e se diferenciam em neuroblastos, neurônios jovens e maduros dentro de 1-2 meses após seu transplante no nervo ciático danificado de ratos adultos. Ao estudar a dinâmica do desenvolvimento de neurônios NADPH-positivos dos rudimentos embrionários do neocórtex e da medula espinhal de ratos em aloenxertos heterotópicos (embrião de rato de 15 dias), o enxerto de 70 a 80% dos neuroenxertos foi revelado em cortes longitudinais através dos nervos ciáticos de ratos receptores, o que dependeu do período de observação. Neuroblastos uni e bipolares com núcleos leves arredondados e um ou dois nucléolos começaram a se formar nos enxertos uma semana após a cirurgia, o que foi acompanhado pela formação de aglomerados. Os autores não conseguiram detectar células contendo NADPH diaforase (NADPH-d) entre os neuroblastos. Após 7 dias, apenas os elementos celulares dos vasos sanguíneos eram NADPH-positivos - células endoteliais capilares na espessura do transplante, bem como células musculares endoteliais e lisas dos vasos do nervo ciático do receptor. Como nas células musculares lisas vasculares a indução da NO sintase (NOS) ocorre sob a influência da IL-1, os autores associam o aparecimento de células musculares lisas NADPH-positivas nos vasos sanguíneos do nervo ciático com a presença de IL-1 sintetizada em troncos nervosos danificados. Sabe-se que a neurogênese sob condições de transplante de rudimentos cerebrais embrionários ocorre sincronicamente com o desenvolvimento de neurônios in situ. Os resultados de estudos morfológicos indicam que a diferenciação de alguns elementos neurais dos transplantes sete dias após o transplante corresponde à diferenciação de células em partes semelhantes do cérebro de ratos recém-nascidos. Assim, sob condições de transplante heterotópico no nervo periférico, as células nervosas embrionárias transplantadas exibem a capacidade de sintetizar NADPH-d. Neste caso, mais neurônios contendo NADPH-d são encontrados em transplantes de medula espinhal do que em transplantes de neocórtex, mas a síntese de óxido nítrico começa nos neurônios transplantados mais tarde do que durante o desenvolvimento in situ. No SNC de vertebrados, células NOS-positivas aparecem já no período pré-natal. Acredita-se que o NO promova a formação de conexões sinápticas no cérebro em desenvolvimento, e a presença de fibras aferentes nervosas NOS-positivas que fornecem síntese de NO em neuroblastos cerebelares estimula a migração e diferenciação de neurônios, devido às quais a citoarquitetura cerebral normal é formada. Um papel importante do NO na sinapsogênese foi estabelecido no teto - apenas os neurônios que tinham conexões sinápticas com células da retina acabaram sendo NOS-positivos.

Sabe-se que o óxido nítrico é um dos reguladores da atividade cerebral, onde é formado a partir da arginina sob a influência da NO sintase, que possui atividade diaforásica. No sistema nervoso central, o NO é sintetizado em células endoteliais de vasos sanguíneos, microglia, astrócitos e neurônios de várias partes do cérebro. Após lesão cerebral traumática, bem como durante hipóxia e isquemia, observa-se um aumento no número de neurônios contendo NO, que é um dos reguladores do fluxo sanguíneo cerebral. Dada a capacidade do NO de induzir sinapsogênese, o estudo da formação de células contendo NO em condições de neurotransplante no contexto de dano traumático ao tecido nervoso do receptor é de particular interesse.

Não menos importante é o estudo do efeito do neurotransplante no estereótipo reflexo condicionado do comportamento. Em experimentos que estudaram o efeito do transplante intracerebral e à distância (entre CII e CIII) de tecido do locus coeruleus embrionário (17-19 dias de gestação) nos processos de memória e no conteúdo de catecolaminas em ratos com destruição do neocórtex frontotemporal, foi demonstrado que o dano eletrolítico ao córtex frontotemporal do cérebro interrompe o estereótipo da reação emocional reflexa condicionada de evitação (memória), enfraquece a atividade fisiológica, reduz o conteúdo de norepinefrina na zona do neocórtex coagulado, mas aumenta seu nível no hipotálamo, onde se observa uma diminuição na concentração de adrenalina, embora sua quantidade no sangue e nas glândulas suprarrenais aumente.

Como resultado do transplante intracerebral de tecido do locus coeruleus embrionário, o estereótipo da reação de evitação emocional reflexa condicionada, interrompido por danos eletrolíticos nas regiões frontotemporais do córtex cerebral, é restaurado em 81,4% dos animais, o conteúdo de adrenalina na formação reticular do mesencéfalo, hipotálamo e neocórtex é normalizado, e seu nível no hipocampo até aumenta, o que é combinado com uma diminuição na concentração de adrenalina no sangue.

O transplante remoto de tecido do locus coeruleus embrionário não apenas restaura o estereótipo rompido da reação de esquiva emocional reflexa condicionada em ratos com dano eletrolítico no córtex frontotemporal, mas também aumenta o conteúdo de norepinefrina e adrenalina, principalmente no hipotálamo, sangue, glândulas suprarrenais e coração. Supõe-se que isso se deva à vascularização do transplante, à penetração de neurotransmissores na corrente sanguínea, à sua passagem pela barreira hematoencefálica e à ativação dos mecanismos de recaptação de adrenalina e norepinefrina pelos tipos de captação 1, 2 e 3. Os autores acreditam que a estabilização a longo prazo do nível de norepinefrina sob condições de enxerto e funcionamento do transplante pode ser considerada um fenômeno de sua liberação progressiva em doses mínimas pelos neurônios do locus coeruleus.

Os efeitos clínicos positivos do transplante de tecido nervoso embrionário também podem ser devidos à capacidade deste último de influenciar os processos de neoplasia vascular, na regulação dos quais fatores de crescimento e citocinas participam diretamente. A vasculogênese é ativada por fatores de crescimento angiogênicos - fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), FGF, PDGF e TGF, que são sintetizados durante a isquemia, que atua como o momento inicial da angiogênese. Foi comprovado que a depleção do potencial de crescimento vascular ocorre durante o processo de envelhecimento do corpo, o que desempenha um papel significativo na patogênese de doenças como doença coronariana e aterosclerose obliterante das extremidades inferiores. A isquemia tecidual também se desenvolve em muitas outras doenças. A introdução de fatores angiogênicos em zonas isquêmicas (angiogênese terapêutica) estimula o crescimento de vasos sanguíneos em tecidos isquêmicos e melhora a microcirculação devido ao desenvolvimento de circulação colateral, que, por sua vez, aumenta a atividade funcional do órgão afetado.

VEGF e FGF são considerados os mais promissores para uso clínico. Os resultados dos primeiros estudos randomizados foram encorajadores, especialmente se as dosagens e os métodos de administração ideais dos fatores angiogênicos fossem escolhidos corretamente. Nesse sentido, foi realizada uma avaliação experimental da atividade angiogênica de um extrato isolado de tecido cerebral embrionário humano. O trabalho utilizou material abortado obtido na vigésima semana de gestação e processado de acordo com o método de I. Maciog et al. (1979), modificado pelo IC ANRF. Este fármaco é um análogo do "suplemento para crescimento de células endoteliais" ("Sigma") e é uma mistura natural de fatores angiogênicos humanos, que inclui VEGF e FGF. Os experimentos foram realizados em ratos com modelos de isquemia dos membros posteriores e do tecido miocárdico. Com base no estudo da atividade da fosfatase alcalina em animais experimentais que receberam o extrato de tecido nervoso embrionário, foi encontrado um aumento no número de capilares por unidade de área do miocárdio - tanto em cortes longitudinais quanto transversais do coração. A atividade angiogênica da preparação foi manifestada pela administração direta na zona isquêmica, bem como no caso de administração sistêmica (intramuscular), o que levou à diminuição da área média da cicatriz pós-infarto.

Em qualquer variante de transplante de tecido nervoso embrionário, é extremamente importante selecionar corretamente a idade gestacional do material embrionário transplantado. A análise comparativa da eficiência de preparações celulares do mesencéfalo ventral embrionário de embriões de ratos com 8, 14 e 16-17 dias, três meses após o neurotransplante intraestriatal para ratos maduros com parkinsonismo, no teste automatizado de assimetria motora induzida por apomorfina, revelou uma eficiência significativamente maior das preparações de células do SNC de embriões de 8 dias e a menor eficiência de tecido nervoso embrionário de 16-17 dias. Os dados obtidos correlacionaram-se com os resultados da análise histomorfológica, em particular, com o tamanho dos transplantes, a gravidade da reação glial e o número de neurônios dopaminérgicos neles presentes.

Diferenças no efeito terapêutico de células do tecido nervoso embrionário podem estar associadas tanto ao grau de imaturidade e comprometimento das próprias células quanto às suas diferentes respostas a fatores de crescimento liberados na área de dano induzido aos neurônios dopaminérgicos. Em particular, o efeito de EGF e FGF2 no desenvolvimento de células-tronco neurais telencefálicas in vivo ocorre em diferentes estágios da embriogênese. Células neuroepiteliais de embriões de camundongos com 8,5 dias de idade, quando cultivadas in vitro em meio isento de soro, proliferam na presença de FGF2, mas não de EGF, ao qual apenas populações de células-tronco isoladas do cérebro de embriões em estágios posteriores de desenvolvimento respondem. Ao mesmo tempo, as células-tronco neurais proliferam em resposta a cada um desses mitógenos e aumentam aditivamente o crescimento no caso da adição de EGF e FGF2 a uma cultura com baixa densidade de semeadura celular. Células-tronco neurais reativas a EGF das zonas germinativas de embriões de camundongos com 14,5 dias de idade são consideradas descendentes lineares de células-tronco neurais reativas a FGF que aparecem pela primeira vez após 8,5 dias de gestação. O fenótipo potencial das células-tronco neurais e progenitoras depende do efeito complexo de seu microambiente. A imunofenotipagem de células neurais das zonas periventricular e hipocampal de embriões humanos de 8 a 12 e 17 a 20 semanas de idade por citofluorometria de fluxo revelou variabilidade significativa associada tanto à idade gestacional quanto às características constitucionais individuais do biomaterial doador. Quando essas células progenitoras neurais são cultivadas em um meio seletivo sem soro com EGF, FGF2 e NGF, as neuroesferas são formadas a uma taxa que depende significativamente da idade gestacional. Células de diferentes partes do cérebro de embriões humanos de 5 a 13 semanas de idade, quando brevemente cultivadas com FGF2 em monocamada sobre substrato de laminina na presença de traços de fatores de crescimento, mantêm a proliferação por 6 semanas com alta porcentagem de células nestina-positivas em um contexto de formação espontânea de células com marcadores de todas as três linhas de diferenciação neural. Células isoladas do mesencéfalo de um embrião humano em um período de gestação superior a 13 semanas proliferam sob a influência de EGF e também formam neuroesferas. Um efeito sinérgico foi alcançado usando uma combinação de EGF e FGF2. A proliferação mais intensa de células-tronco neurais com a formação de neuroesferas é observada durante o cultivo do tecido do córtex cerebral de embriões humanos de 6 a 8 semanas de idade na presença de EGF2, IGF1 e 5% de soro de cavalo em um substrato com fibronectina.

Deve-se notar que as questões relativas à idade gestacional e à seção do SNC embrionário cujo tecido é preferível para uso em neurotransplante permanecem em aberto. As respostas a elas devem ser buscadas na neurogênese do cérebro em desenvolvimento, que continua durante todo o período pré-natal – momento em que o epitélio do tubo neural forma uma estrutura multicamadas. Acredita-se que a fonte de células-tronco e novos neurônios seja a glia radial, constituída por células alongadas com longos processos direcionados radialmente em relação à parede das vesículas cerebrais e em contato com a superfície interna dos ventrículos e a superfície pial externa da parede cerebral. Anteriormente, a glia radial era dotada apenas da função de trato neuronal ao longo do qual os neuroblastos migram da região ventral para as seções superficiais, e também lhe era atribuído um papel esquelético no processo de formação da organização laminar correta do córtex. Hoje, está estabelecido que, à medida que o desenvolvimento prossegue, a glia radial se transdiferencia em astrócitos. Uma parte significativa dela em mamíferos é reduzida imediatamente após o nascimento, entretanto, nas espécies animais em que a glia radial é preservada até a idade adulta, a neurogênese ocorre ativamente no período pós-natal.

Em cultura, células gliais radiais do neocórtex embrionário de roedores formaram neurônios e células gliais, com os neurônios sendo predominantemente formados na idade gestacional de 14 a 16 dias do desenvolvimento embrionário (o período de intensidade máxima da neurogênese no córtex cerebral de camundongos e ratos). No 18º dia de embriogênese, a diferenciação mudou para a formação de astrócitos com uma diminuição significativa no número de neurônios recém-formados. A marcação in situ de células gliais radiais com GFP tornou possível detectar a divisão assimétrica de células marcadas na cavidade das vesículas cerebrais de embriões de ratos de 15 a 16 dias de idade com o aparecimento de células-filhas com características imunológicas e eletrofisiológicas de neuroblastos. É digno de nota que, de acordo com os resultados de observações dinâmicas, os neuroblastos emergentes usam a célula-mãe das células gliais radiais para migração para a superfície pial.

O marcador endógeno da glia radial é a proteína do filamento intermediário nestina. Utilizando o método de triagem por fluxo fluorescente de células marcadas com um retrovírus associado à GFP e expressas sob o controle da nestina, foi demonstrado que células-tronco do giro dentado e do hilo do hipocampo humano (o material foi obtido durante cirurgias para epilepsia) expressam nestina. Portanto, pertencem à glia radial, que em humanos, como em outros mamíferos, é preservada apenas no giro dentado.

Ao mesmo tempo, a eficiência do transplante celular é determinada não apenas pela alta viabilidade das células do doador, seu potencial de diferenciação e capacidade de substituir células defeituosas, mas, principalmente, por sua migração direcionada. A integração funcional completa das células transplantadas depende de sua capacidade de migração – sem perturbar a citoarquitetura do cérebro do receptor. Como a glia radial sofre redução quase completa no período pós-natal, era necessário descobrir como as células do doador podem se mover da zona de transplante para o local da lesão cerebral em receptores adultos. Existem duas variantes de migração celular para o SNC que não dependem da glia radial: o fenômeno da migração tangencial ou o movimento dos neuroblastos durante o desenvolvimento do córtex cerebral perpendicular à rede da glia radial, bem como a migração "em linha" ou "ao longo de uma cadeia". Em particular, a migração de células progenitoras neurais da zona subventricular rostral para o bulbo olfatório ocorre como uma sequência de células firmemente adjacentes circundadas por células gliais. Acredita-se que essas células utilizem células parceiras como substrato de migração, e o principal regulador dessas interações intercelulares é a PSA-NCAM (molécula de adesão de células neurais polissialiladas). Portanto, a migração neuronal não requer necessariamente a participação da glia radial ou de conexões axonais preexistentes. A forma extraradial de movimento celular em "cordão" ao longo do trato de migração rostral é mantida ao longo da vida, o que indica uma possibilidade real de entrega direcionada de células progenitoras neurais transplantadas ao sistema nervoso maduro.

Existe uma hipótese sobre a presença de uma linhagem de células-tronco na ontogênese cerebral, segundo a qual, nos estágios iniciais do desenvolvimento cerebral, a célula-tronco é uma célula neuroepitelial que, à medida que amadurece, se transdiferencia em glia radial. Na idade adulta, o papel das células-tronco é desempenhado por células com características de astrócitos. Apesar de uma série de pontos controversos (contradições em relação às células-tronco do hipocampo, bem como em partes profundas do cérebro que não possuem um córtex em camadas e se desenvolvem a partir dos tubérculos talâmicos, onde a glia radial está ausente), um conceito claro e simples de uma mudança consistente no fenótipo das células-tronco ao longo da ontogênese parece muito atraente.

A influência de fatores microambientais na determinação e subsequente diferenciação de células neurodiferenciadas foi claramente demonstrada pelo transplante de células-tronco maduras da medula espinhal de ratos em diferentes regiões do sistema nervoso maduro. Quando as células-tronco foram transplantadas para o giro dentado ou para a região de migração neuronal nos bulbos olfatórios, observou-se migração ativa das células transplantadas, com a formação de numerosos neurônios. O transplante de células-tronco para a medula espinhal e para a região do corno de Amon resultou na formação de astrócitos e oligodendrócitos, enquanto o transplante para o giro dentado resultou na formação não apenas de células gliais, mas também de neurônios.

Em um rato adulto, o número de células em divisão no giro dentado pode chegar a vários milhares por dia – menos de 1% do número total de células granulares. Os neurônios representam de 50 a 90% das células, enquanto os astócitos e outros elementos gliais representam cerca de 15%. As células restantes não apresentam características antigênicas de neurônios e glia, mas contêm antígenos de células endoteliais, o que indica uma estreita relação entre neurogênese e angiogênese no giro dentado. Os defensores da possibilidade de diferenciação de células endoteliais em células precursoras neuronais referem-se à capacidade das células endoteliais de sintetizar BDNF in vitro.

A velocidade de automontagem dos circuitos neurais é impressionante: durante a diferenciação, as células precursoras das células granulares migram para o giro dentado e formam processos que crescem em direção à zona SAZ do corno de Ammon, formando sinapses com neurônios glutamatérgicos piramidais e neurônios inibitórios intercalares. As células granulares recém-criadas são integradas aos circuitos neurais existentes em até 2 semanas, e as primeiras sinapses aparecem de 4 a 6 dias após o surgimento das novas células. A administração frequente de BrdU ou 3H-timidina (um dos métodos para identificar células-tronco adultas) em animais maduros revelou um grande número de neurônios e astrócitos marcados no corno de Ammon, o que indica a possibilidade de formação de novos neurônios não apenas no giro dentado, mas também em outras partes do hipocampo. O interesse pelos processos de divisão, diferenciação e morte celular no giro dentado do hipocampo do cérebro maduro também se deve ao fato de que os neurônios formados aqui estão localizados em uma das principais áreas do hipocampo, responsável pelos processos de aprendizagem e memória.

Assim, foi estabelecido hoje que as células progenitoras neurais se originam das células da zona subependimária do ventrículo lateral de roedores maduros. Elas migram ao longo do trato de migração rostral formado por células astrogliais orientadas longitudinalmente para o bulbo olfatório, onde são incorporadas na camada de células granulares e se diferenciam em neurônios dessa estrutura. A migração de células neurais progenitoras foi detectada no trato de migração rostral de macacos adultos, o que indica a possibilidade de formação de novos neurônios no bulbo olfatório de primatas. Células-tronco neurais foram isoladas do bulbo olfatório de um humano adulto e transferidas para linhagens, cujas células clonadas se diferenciam em neurônios, astrócitos e oligodendrócitos. Células-tronco foram encontradas no hipocampo do cérebro maduro de ratos, camundongos, macacos e humanos. As células-tronco neurais da zona subgranular da fáscia dentada são uma fonte de células progenitoras que migram para os membros medial e lateral do hipocampo, onde se diferenciam em células granulares maduras e elementos gliais. Axônios de neurônios formados de novo da fáscia dentada são rastreados até o campo CA3, o que indica a participação de neurônios recém-formados na implementação de funções hipocampais. Nas áreas de associação do neocórtex de macacos adultos, foram encontradas células progenitoras neuronais migrando da zona subventricular. Na camada VI do neocórtex do cérebro do camundongo, novos neurônios piramidais são detectados de 2 a 28 semanas após dano induzido e morte de neurônios nativos dessa camada devido à migração de células progenitoras previamente dormentes da zona subventricular. Finalmente, a realidade da neurogênese pós-natal no cérebro humano é evidenciada por um aumento duplo no número de neurônios corticais, que continua durante os primeiros 6 anos após o nascimento.

De grande importância para a prática do transplante celular é a questão da regulação dos processos de reprodução e diferenciação das células-tronco e progenitoras neurais. Os fatores mais importantes que suprimem a proliferação das células progenitoras neurais são os glicocorticoides, que reduzem drasticamente o número de divisões, enquanto a remoção das glândulas suprarrenais, ao contrário, aumenta significativamente o número de mitoses (Gould, 1996). Vale ressaltar que a morfogênese do giro dentado em roedores é mais intensa durante as duas primeiras semanas de desenvolvimento pós-natal, durante o período de ausência de reação ao estresse, em um contexto de queda acentuada na produção e secreção de hormônios esteroides pelo córtex adrenal. Os corticosteroides inibem a migração das células granulares – novos neurônios não são incorporados à camada granular do giro dentado, mas permanecem no hilo. Supõe-se que os processos de formação de conexões sinápticas sejam interrompidos simultaneamente. A proteção das células contra essa "agressão esteroide" é realizada pela expressão mínima de receptores mineralocorticoides e glicocorticoides nas células granulares em proliferação, não apenas durante o desenvolvimento do giro dentado, mas também em animais adultos. No entanto, de todos os neurônios do cérebro, são os neurônios do hipocampo que se caracterizam pelo maior conteúdo de receptores glicocorticoides, o que causa o efeito do estresse no hipocampo. O estresse psicoemocional e as situações estressantes inibem a neurogênese, e o estresse crônico reduz drasticamente a capacidade dos animais de adquirir novas habilidades e aprender. Um efeito negativo mais pronunciado do estresse crônico na neurogênese é bastante compreensível se levarmos em consideração o estado predominantemente dormente das células-tronco neurais. Ao imobilizar ratas prenhes (para roedores - um fator de estresse extremamente forte), verificou-se que o estresse pré-natal também causa uma diminuição no número de células no giro dentado e inibe significativamente a neurogênese. Sabe-se que os glicocorticoides participam da patogênese dos estados depressivos, cujo equivalente morfológico é a inibição da neurogênese, a reorganização patológica dos neurônios e conexões interneuronais e a morte das células nervosas. Por outro lado, os agentes quimioterápicos antidepressivos ativam a formação de neurônios de novo, o que confirma a conexão entre os processos de formação de novos neurônios no hipocampo e o desenvolvimento da depressão. Os estrogênios têm um efeito significativo na neurogênese, cujos efeitos são opostos à ação dos glicocorticosteroides e consistem em apoiar a proliferação e a viabilidade das células progenitoras neurais. Deve-se notar que os estrogênios aumentam significativamente a capacidade de aprendizagem dos animais. Alguns autores associam alterações cíclicas no número de células granulares e seu excesso em fêmeas com a influência dos estrogênios.

Sabe-se que a neurogênese é controlada por EGF, FGF e BDNF, no entanto, os mecanismos do efeito de sinais externos sobre células-tronco de mitógenos e fatores de crescimento não foram suficientemente estudados. Foi estabelecido que o PDGF in vitro mantém a direção neuronal de diferenciação de células progenitoras, e o fator neurotrófico ciliar (CNTF), como a triiodotironina, estimula a formação de elementos predominantemente gliais - astrócitos e oligodendrócitos. A proteína ativadora da adenilato ciclase hipofisária (PACAP) e o peptídeo intestinal vasoativo (VIP) ativam a proliferação de células progenitoras neurais, mas ao mesmo tempo inibem os processos de diferenciação de células-filhas. Os opioides, especialmente no caso de sua exposição a longo prazo, inibem significativamente a neurogênese. No entanto, os receptores opioides não foram identificados em células-tronco e células progenitoras neurais do giro dentado (eles estão presentes em neurônios em diferenciação do período embrionário), o que não nos permite avaliar os efeitos diretos dos opioides.

As necessidades da medicina regenerativa-plástica prática forçaram os pesquisadores a dedicar atenção especial ao estudo da pluripotência e multipotência das células-tronco. A implementação dessas propriedades no nível de células-tronco regionais de um organismo adulto poderia, no futuro, garantir a produção do material de transplante necessário. Foi demonstrado acima que a estimulação epigenética de células-tronco neurais permite a obtenção de células proliferantes já pré-formadas de acordo com os fenótipos neurais, o que limita seu número. No caso do uso das propriedades totipotentes de uma célula-tronco embrionária, a proliferação até a obtenção de um número suficiente de células ocorre antes da diferenciação neural, e as células multiplicadas são facilmente convertidas em um fenótipo neural. Para obter células-tronco neurais, as CTEs são isoladas da massa celular interna do blastocisto e cultivadas na presença obrigatória de LIF, o que preserva sua totipotência e a capacidade de divisão ilimitada. Depois disso, a diferenciação neural das CTEs é induzida usando ácido retinoico. O transplante das células-tronco neurais resultantes para o estriado danificado pela quinolina e 6-hidroxidopamina é acompanhado por sua diferenciação em neurônios dopaminérgicos e serotoninérgicos. Após a injeção nos ventrículos do cérebro embrionário de rato, as células progenitoras neurais derivadas de CTE migram para várias regiões do cérebro receptor, incluindo o córtex, o estriado, o septo, o tálamo, o hipotálamo e o cerebelo. As células que permanecem na cavidade ventricular formam estruturas epiteliais semelhantes a um tubo neural, bem como ilhas individuais de tecido não neural. No parênquima cerebral do embrião receptor, as células transplantadas produzem os três principais tipos de células do sistema nervoso. Algumas delas apresentam dendritos apicais alongados, corpos celulares piramidais e axônios basais que se projetam para o corpo caloso. Astrócitos de origem do doador estendem processos para capilares próximos, e oligodendrócitos entram em contato próximo com as membranas de mielina, participando da formação da mielina. Assim, células progenitoras neurais obtidas de CCEs in vitro são capazes de migração direcionada e diferenciação regional adequada aos sinais microambientais, fornecendo neurônios e glia a muitas áreas do cérebro em desenvolvimento.

Alguns autores consideram a possibilidade de desdiferenciação e transdiferenciação de células-tronco regionais de um organismo adulto. A confirmação indireta da desdiferenciação celular em cultura com expansão de seus potenciais é fornecida por dados sobre o enxerto de células-tronco neurais de camundongo na medula óssea vermelha com subsequente desenvolvimento de linhagens celulares a partir delas, produzindo células funcionalmente ativas do sangue periférico. Além disso, o transplante de células da neuroesfera geneticamente marcadas (LacZ) obtidas do cérebro maduro ou embrionário para o cérebro de camundongos irradiados com hematopoiese suprimida levou à formação não apenas de derivados neurais de células-tronco, mas também causou a geração de células sanguíneas, o que indica a pluripotência das células-tronco neurais, realizada fora do cérebro. Assim, uma célula-tronco neural é capaz de se diferenciar em células sanguíneas sob a influência de sinais do microambiente da medula óssea com transformação preliminar em uma célula-tronco hematopoiética. Por outro lado, ao transplantar células-tronco hematopoiéticas da medula óssea para o cérebro, sua diferenciação sob a influência do microambiente do tecido cerebral em células gliais e neurais foi estabelecida. Consequentemente, o potencial de diferenciação das células-tronco neurais e hematopoiéticas não é limitado pela especificidade do tecido. Em outras palavras, fatores do microambiente local, diferentes daqueles característicos dos tecidos cerebral e da medula óssea, são capazes de alterar a direção da diferenciação dessas células. Foi demonstrado que células-tronco neurais introduzidas no sistema venoso de camundongos irradiados criam populações de células hematopoiéticas mieloides, linfoides e imaturas no baço e na medula óssea. In vitro, o efeito das proteínas morfogenéticas da medula óssea (BMPs) na sobrevivência e diferenciação de células-tronco neurais foi estabelecido, determinando, como nos estágios iniciais da embriogênese, seu desenvolvimento nas direções neural ou glial. Em culturas de células-tronco neurais de embriões de ratos com 16 dias de idade, as BMPs induzem a formação de neurônios e astróglia, enquanto em culturas de células-tronco derivadas de cérebro perinatal, apenas astrócitos são formados. Além disso, as BMPs suprimem a geração de oligodendrócitos, que aparecem in vitro apenas com a adição do antagonista de BMP, noggin.

Os processos de transdiferenciação são inespecíficos para cada espécie: células-tronco hematopoiéticas da medula óssea humana transplantadas para o estriado de ratos adultos migram para a substância branca da cápsula externa e para o neocórtex ipsilateral e contralateral, onde formam elementos celulares semelhantes a astrócitos (Azizi et al., 1998). Quando células-tronco da medula óssea são alotransplantadas para o ventrículo lateral de camundongos recém-nascidos, a migração de células-tronco hematopoiéticas pode ser rastreada até as estruturas do prosencéfalo e do cerebelo. No estriado e na camada molecular do hipocampo, as células migradas são transformadas em astrócitos e, no bulbo olfatório, na camada de células granulares internas do cerebelo e na formação reticular do tronco encefálico, formam células semelhantes a neurônios com reação positiva aos neurofilamentos. Após administração intravenosa de células hematopoiéticas em camundongos adultos, micro e astrócitos marcados com GFP foram detectados no neocórtex, tálamo, tronco cerebral e cerebelo.

Além disso, as células-tronco mesenquimais da medula óssea, que dão origem a todos os tipos de células do tecido conjuntivo, também podem sofrer transdiferenciação neural sob certas condições (lembre-se de que a fonte embrionária do mesênquima são as células da crista neural). Foi demonstrado que células estromais da medula óssea humana e de camundongo cultivadas in vitro na presença de EGF ou BDNF expressam o marcador de células progenitoras neurais nestina, e a adição de várias combinações de fatores de crescimento leva à formação de células com marcadores da glia (GFAP) e neurônios (proteína nuclear, NeuN). Células-tronco mesenquimais singênicas marcadas, transplantadas para o ventrículo lateral do cérebro de camundongos recém-nascidos, migram e se localizam no prosencéfalo e no cerebelo sem perturbar a citoarquitetura do cérebro receptor. As células-tronco mesenquimais da medula óssea diferenciam-se em astrócitos maduros no estriado e na camada molecular do hipocampo e povoam o bulbo olfatório, as camadas granulares do cerebelo e a formação reticular, onde se transformam em neurônios. As células-tronco mesenquimais da medula óssea humana são capazes de se diferenciar em macróglia in vitro e integrar-se às estruturas cerebrais de ratos após o transplante. O transplante direto de células-tronco mesenquimais da medula óssea para o hipocampo de ratos adultos também é acompanhado por sua migração para o parênquima cerebral e diferenciação neuroglial.

Supõe-se que o transplante de células-tronco da medula óssea possa expandir as possibilidades da terapia celular para doenças do SNC caracterizadas pela morte patológica excessiva de neurônios. Deve-se notar, no entanto, que nem todos os pesquisadores reconhecem a transformação mútua de células-tronco neurais e hematopoiéticas, especialmente in vivo, o que se deve, mais uma vez, à falta de um marcador confiável para avaliar sua transdiferenciação e desenvolvimento posterior.

O transplante de células-tronco abre novos horizontes para a terapia gênica celular de patologias neurológicas hereditárias. A modificação genética de células-tronco neurais envolve a inserção de construções regulatórias genéticas, cujos produtos interagem com proteínas do ciclo celular no modo de regulação automática. A transdução desses genes em células progenitoras embrionárias é usada para multiplicar células-tronco neurais. A maioria dos clones de células geneticamente modificadas se comporta como linhagens celulares estáveis, não apresentando sinais de transformação in vivo ou in vitro, mas possuindo uma capacidade pronunciada de inibição da proliferação por contato. Quando transplantadas, as células transfectadas multiplicadas são integradas ao tecido receptor sem romper a citoarquitetura e sem sofrer transformação tumoral. As células-tronco neurais do doador não deformam a zona de integração e competem igualmente por espaço com as células progenitoras do hospedeiro. No entanto, no 2º-3º dia, a intensidade da divisão das células transfectadas diminui acentuadamente, o que corresponde à inibição da proliferação por contato in vitro. Embriões receptores de células-tronco neurais transfectadas não apresentam anormalidades no desenvolvimento do sistema nervoso central; todas as áreas do cérebro em contato com o transplante se desenvolvem normalmente. Após o transplante, clones de células-tronco neurais migram rapidamente da zona de injeção e frequentemente ultrapassam as zonas embrionárias correspondentes ao longo do trato rostral, integrando-se adequadamente a outras áreas do cérebro. A integração de clones geneticamente modificados e linhagens celulares transfectadas de células-tronco neurais no cérebro do organismo hospedeiro é característica não apenas do período embrionário: essas células são implantadas em inúmeras áreas do sistema nervoso central do feto, recém-nascido, adulto e até mesmo do organismo receptor em envelhecimento, e demonstram a capacidade de integração e diferenciação adequadas. Em particular, após o transplante para a cavidade ventricular do cérebro, as células transfectadas migram sem danificar a barreira hematoencefálica e tornam-se componentes celulares funcionais integrais do tecido cerebral. Os neurônios do doador formam sinapses apropriadas e expressam canais iônicos específicos. Com a integridade da barreira hematoencefálica preservada, a astróglia, um derivado de células-tronco neurais transfectadas, estende processos aos vasos cerebrais, e os oligodendrócitos derivados de doadores expressam a proteína básica da mielina e mielinizam os processos neuronais.

Além disso, células-tronco neurais são transfectadas para uso como vetores celulares. Tais construções genéticas de vetores proporcionam a expressão estável in vivo de genes estranhos envolvidos no desenvolvimento do sistema nervoso, ou são usadas para corrigir defeitos genéticos existentes, uma vez que os produtos desses genes são capazes de compensar diversas anormalidades bioquímicas do sistema nervoso central. A alta atividade migratória das células-tronco transfectadas e a implantação adequada nas zonas germinativas de várias áreas do cérebro em desenvolvimento nos permitem esperar a restauração completa da deficiência hereditária de enzimas celulares. Na modelagem da síndrome de ataxia-telangiectasia (linhagens de camundongos mutantes pg e pcd), as células de Purkinje desaparecem do cerebelo de animais experimentais durante as primeiras semanas de desenvolvimento pós-natal. Foi demonstrado que a introdução de células-tronco neurais no cérebro desses animais é acompanhada por sua diferenciação em células de Purkinje e neurônios granulares. Em mutantes pcd, os distúrbios de coordenação do movimento são parcialmente corrigidos e a intensidade do tremor é reduzida. Resultados semelhantes foram obtidos com o transplante de células-tronco neurais humanas clonadas em primatas, nos quais a degeneração das células de Purkinje foi induzida com onconase. Após o transplante, as células-tronco neurais do doador foram encontradas nas camadas granular, molecular e de células de Purkinje do parênquima cerebelar. Portanto, a modificação genética de células progenitoras neurais pode proporcionar uma modificação estável e comprometida do fenótipo, resistente a influências externas. Isso é especialmente importante em processos patológicos associados ao desenvolvimento de fatores no receptor que impedem a sobrevivência e a diferenciação das células do doador (por exemplo, durante agressões imunológicas).

A mucopolissacaridose tipo VII em humanos é caracterizada por neurodegeneração e deficiência intelectual progressiva, modelada em camundongos por uma mutação de deleção no gene da beta-glicuronidase. Após o transplante de células-tronco neurais transfectadas, secretoras de beta-glicuronidase, para os ventrículos cerebrais de camundongos receptores recém-nascidos com deficiência, as células do doador são encontradas primeiro na zona terminal e, em seguida, espalhadas por todo o parênquima cerebral, corrigindo de forma estável a integridade dos lisossomos no cérebro de camundongos mutantes. Em um modelo de doença de Tay-Sachs, células-tronco neurais transduzidas por retrovírus, quando administradas in utero a fetos de camundongos e transplantadas em camundongos recém-nascidos, proporcionam expressão eficiente da subunidade beta da beta-hexosaminidase em receptores com uma mutação que leva ao acúmulo patológico de beta2-gangliosídeo.

Outra direção da medicina regenerativa é a estimulação do potencial proliferativo e de diferenciação das células-tronco neurais do próprio paciente. Em particular, as células-tronco neurais secretam NT-3 durante a hemissecção da medula espinhal e asfixia cerebral em ratos, expressam NGF e BDNF no septo e nos gânglios da base, tirosina hidroxilases no estriado, bem como reelina no cerebelo e proteína básica da mielina no cérebro.

No entanto, as questões de estimulação da neurogênese claramente não recebem atenção suficiente. Alguns estudos sugerem que a carga funcional sobre os centros nervosos responsáveis pela distinção de odores se reflete na formação de novos neurônios. Em camundongos transgênicos com déficit de moléculas de adesão neuronal, uma diminuição na intensidade da neurogênese e uma diminuição no número de neurônios migrando para os bulbos olfatórios foi combinada com um comprometimento da capacidade de distinguir odores, embora o limiar de percepção de odores e a memória olfativa de curto prazo não tenham sido prejudicados. O estado funcional das células do giro dentado desempenha um papel importante na regulação da neurogênese: um enfraquecimento do efeito do glutamato nas células granulares após a destruição do córtex entorrinal promove a proliferação e a diferenciação de neurônios, e a estimulação das fibras da via perfurante (a principal entrada aferente para o hipocampo) causa inibição da neurogênese. Os antagonistas do receptor NMDA ativam os processos de formação de novos neurônios, enquanto os agonistas, ao contrário, reduzem a intensidade da neurogênese, que, na verdade, se assemelha à ação dos glicocorticosteroides. Resultados de pesquisas contraditórios são encontrados na literatura: informações sobre o efeito inibitório experimentalmente comprovado do neurotransmissor excitatório glutamato na neurogênese são inconsistentes com dados sobre a estimulação da proliferação de células progenitoras e o surgimento de novos neurônios com aumento da atividade convulsiva no hipocampo de animais com modelos experimentais de epilepsia com caína e pilocarpina. Ao mesmo tempo, no modelo tradicional de epilepsia causada por estimulação subliminar múltipla de uma determinada área do cérebro (kindling) e caracterizada por morte neuronal menos pronunciada, a intensidade da neurogênese aumenta apenas na fase tardia do kindling, quando danos e morte de neurônios são observados no hipocampo. Foi demonstrado que, na epilepsia, a atividade convulsiva estimula a neurogênese com localização anormal de novos neurônios granulares, muitos dos quais surgem não apenas no giro dentado, mas também no hilo. Esses neurônios são de grande importância no desenvolvimento do brotamento de fibras musgosas, uma vez que seus axônios formam colaterais reversas normalmente ausentes, que formam inúmeras sinapses com células granulares vizinhas.

O uso de células-tronco neurais regionais abre novas perspectivas para a aplicação do transplante celular no tratamento de doenças neurodegenerativas metabólicas e genéticas, doenças desmielinizantes e distúrbios pós-traumáticos do sistema nervoso central. Antes de realizar o transplante de células de reposição por um dos métodos, a seleção e a expansão do tipo necessário de células progenitoras neurais ex vivo são realizadas com o objetivo de sua subsequente introdução diretamente na área lesada do cérebro. O efeito terapêutico, neste caso, se deve à substituição das células danificadas ou à liberação local de fatores de crescimento e citocinas. Este método de terapia regenerativa-plástica requer o transplante de um número suficientemente grande de células com características funcionais predeterminadas.

Estudos adicionais sobre as características moleculares e o potencial regenerativo-plástico de células-tronco cerebrais maduras, bem como a capacidade de transdiferenciação de células-tronco regionais de diferentes origens teciduais, também devem ser considerados apropriados. Atualmente, a triagem de antígenos de células-tronco hematopoiéticas da medula óssea já foi realizada, com a determinação de uma combinação de marcadores celulares capazes de transdiferenciar-se em células-tronco progenitoras neurais (CD 133+, 5E12+, CD34-, CD45-, CD24). Foram obtidas células que formam neuroesferas in vitro e formam neurônios quando transplantadas para o cérebro de camundongos imunodeficientes recém-nascidos. De interesse para a xenotransplantologia celular são os resultados de estudos sobre a possibilidade de transplante cruzado de células-tronco em indivíduos de táxons evolutivamente distantes. Os resultados da implantação de células-tronco neurais na área do tumor cerebral permanecem sem interpretação adequada: as células transplantadas migram ativamente por todo o volume do tumor sem ultrapassar seus limites e, quando as células são introduzidas na parte intacta do cérebro, observa-se sua migração ativa em direção ao tumor. A questão do significado biológico dessa migração permanece em aberto.

Deve-se notar que o transplante bem-sucedido de células-tronco neurais, bem como de outras células progenitoras neurais obtidas de CTEs, só é possível quando se utilizam células progenitoras neurais altamente purificadas, uma vez que células-tronco embrionárias indiferenciadas são inevitavelmente transformadas em teratomas e teratocarcinomas quando transplantadas para um receptor adulto imunocompetente. Mesmo uma quantidade mínima de células pouco diferenciadas na suspensão de células do doador aumenta drasticamente a tumorigenicidade do transplante e aumenta inaceitavelmente o risco de desenvolvimento de tumor ou de formação de tecido não neural. A obtenção de populações homogêneas de células progenitoras neurais é possível quando se utilizam células que surgem em certos estágios da embriogênese normal como fonte alternativa de tecido do doador. Outra abordagem envolve a eliminação cuidadosa de populações celulares indesejadas por seleção específica de linhagem. O uso de CTEs para neurotransplante após sua exposição insuficiente in vitro a fatores de crescimento também é perigoso. Nesse caso, não se pode descartar uma falha do programa de diferenciação neural com a formação de estruturas inerentes ao tubo neural.

Hoje, é bastante óbvio que as células-tronco neurais exibem tropismo por áreas patologicamente alteradas do sistema nervoso central e têm um efeito regenerativo-plástico pronunciado. O microambiente no local da morte celular do tecido nervoso modela a direção da diferenciação das células transplantadas, repondo assim a deficiência de elementos neurais específicos dentro da zona de dano do SNC. Em alguns processos neurodegenerativos, surgem sinais neurogênicos para a recapitulação da neurogênese, e as células-tronco neurais do cérebro maduro são capazes de responder a essa informação instrutiva. Numerosos dados experimentais servem como uma ilustração clara do potencial terapêutico das células-tronco neurais. A administração intracisternal de um clone de células-tronco neurais em animais com ligadura da artéria cerebral média (um modelo de acidente vascular cerebral isquêmico) ajuda a reduzir a área e o volume da área destrutivamente alterada do cérebro, especialmente no caso de transplante de células-tronco neurais juntamente com FGF2. Imunocitoquimicamente, observa-se a migração de células do doador para a zona isquêmica com sua subsequente integração com células cerebrais intactas do receptor. O transplante de células imaturas da linha neuroepitelial de camundongo MHP36 no cérebro de ratos com acidente vascular cerebral experimental melhora a função sensório-motora, e a introdução dessas células nos ventrículos cerebrais melhora a função cognitiva. O transplante de células hematopoiéticas pré-formadas neuralmente da medula óssea humana para ratos elimina a disfunção do córtex cerebral causada por dano isquêmico. Nesse caso, células progenitoras neurais xenogênicas migram do local da injeção para a zona de alterações destrutivas no tecido cerebral. O transplante intracraniano de células homólogas da medula óssea em danos traumáticos ao córtex cerebral em ratos leva à restauração parcial da função motora. As células do doador enxertam, proliferam, sofrem diferenciação neural em neurônios e astrócitos e migram em direção à lesão. Quando injetadas no estriado de ratos adultos com acidente vascular cerebral experimental, células-tronco neurais humanas clonadas substituem células danificadas do SNC e restauram parcialmente a função cerebral comprometida.

As células-tronco neurais humanas são isoladas principalmente do telencéfalo embrionário, que se desenvolve muito mais tarde do que as partes mais caudais do tronco nervoso. Foi demonstrada a possibilidade de isolar células-tronco neurais da medula espinhal de um feto humano de 43 a 137 dias de idade, uma vez que, na presença de EGF e FGF2, essas células formam neuroesferas e exibem multipotência nas passagens iniciais, diferenciando-se em neurônios e astrócitos. No entanto, o cultivo de longo prazo de células progenitoras neurais (mais de 1 ano) as priva de multipotência – tais células são capazes de se diferenciar apenas em astrócitos, ou seja, tornam-se unipotentes. Células-tronco neurais regionais podem ser obtidas como resultado de bulbectomia parcial e, após reprodução em cultura na presença de LIF, transplantadas para o mesmo paciente com alterações neurodegenerativas em outras partes do sistema nervoso central. Na clínica, a terapia de substituição celular com células-tronco neurais foi realizada pela primeira vez para tratar pacientes com acidente vascular cerebral acompanhado de danos aos gânglios da base do cérebro. Como resultado do transplante de células do doador, observou-se uma melhora no estado clínico da maioria dos pacientes.

Alguns autores acreditam que a capacidade das células-tronco neurais de enxertar, migrar e integrar-se em várias áreas do tecido nervoso em caso de dano ao SNC abre possibilidades ilimitadas para a terapia celular de processos patológicos não apenas locais, mas também extensos (acidente vascular cerebral ou asfixia), multifocais (esclerose múltipla) e até globais (a maioria dos distúrbios metabólicos hereditários ou demências neurodegenerativas). De fato, quando células-tronco neurais clonadas de camundongos e humanos são transplantadas em animais receptores (camundongos e primatas, respectivamente) com degeneração de neurônios dopaminérgicos no sistema mesoestriatal induzida pela introdução de metil-fenil-tetrapiridina (modelo da doença de Parkinson) 8 meses antes do transplante, as células-tronco neurais do doador integram-se ao SNC do receptor. Um mês depois, as células transplantadas são localizadas bilateralmente ao longo do mesencéfalo. Alguns dos neurônios resultantes de origem do doador expressam tirosina hidrolase na ausência de sinais de uma reação imunológica ao transplante. Em ratos administrados com 6-hidroxidopamina (outro modelo experimental da doença de Parkinson), a adaptação das células transplantadas ao microambiente cerebral do hospedeiro foi determinada pelas condições de cultivo das células-tronco neurais antes do transplante. As células-tronco neurais, proliferando rapidamente in vitro sob a influência do EGF, compensaram a deficiência de neurônios dopaminérgicos no estriado danificado de forma mais eficaz do que as células de culturas de 28 dias. Os autores acreditam que isso se deve à perda da capacidade de perceber os sinais de diferenciação correspondentes durante o processo de divisão celular das células progenitoras neurais in vitro.

Em alguns estudos, buscou-se aumentar a eficácia do impacto nos processos de reinervação do estriado danificado, transplantando células embrionárias do estriado para essa área como fonte de fatores neurotróficos, com transplante simultâneo de neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo ventral. Verificou-se que a eficácia do neurotransplante depende em grande parte do método de introdução do tecido nervoso embrionário. Como resultado de estudos sobre o transplante de preparações de tecido nervoso embrionário no sistema ventricular cerebral (a fim de evitar lesão do parênquima estriado), obtiveram-se informações sobre seu efeito positivo no defeito motor do parkinsonismo.

No entanto, em outros estudos, observações experimentais mostraram que o transplante de preparações de tecido nervoso embrionário do mesencéfalo ventral contendo neurônios dopaminérgicos para o ventrículo cerebral, bem como o transplante de elementos neurais embrionários GABAérgicos para o estriado de ratos com hemiparkinsonismo, não promovem a restauração das funções prejudicadas do sistema dopaminérgico. Ao contrário, a análise imunocitoquímica confirmou os dados sobre a baixa taxa de sobrevivência de neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo ventral transplantados para o estriado de ratos. O efeito terapêutico do transplante intraventricular de tecido nervoso embrionário do mesencéfalo ventral foi realizado apenas sob a condição de implantação simultânea de uma preparação de células estriatais embrionárias no estriado desnervado. Os autores acreditam que o mecanismo desse efeito está associado ao efeito trófico positivo dos elementos GABAérgicos do estriado embrionário sobre a atividade dopaminérgica específica dos transplantes de mesencéfalo ventral intraventricular. Uma reação glial pronunciada nos transplantes foi acompanhada por uma ligeira regressão dos parâmetros do teste de apomorfina. Estes, por sua vez, correlacionaram-se com o conteúdo de GFAP no soro sanguíneo, o que indicou diretamente uma violação da permeabilidade da barreira hematoencefálica. Com base nesses dados, os autores concluíram que o nível de GFAP no soro sanguíneo pode ser usado como um critério adequado para avaliar o estado funcional do transplante, e o aumento da permeabilidade da barreira hematoencefálica para antígenos neuroespecíficos, como GFAP, é um elo patogênico no desenvolvimento de falha do transplante devido a dano autoimune ao tecido nervoso do receptor.

Do ponto de vista de outros pesquisadores, o enxerto e a integração de células-tronco neurais após o transplante são estáveis e duradouros, uma vez que as células do doador são encontradas nos receptores por pelo menos dois anos após o transplante e sem uma diminuição significativa em seu número. Tentativas de explicar isso pelo fato de que, em um estado indiferenciado, as células-tronco neurais não expressam moléculas de MHC de classe I e II em um nível suficiente para induzir uma reação de rejeição imunológica podem ser consideradas verdadeiras apenas em relação aos precursores neurais pouco diferenciados. No entanto, nem todas as células-tronco neurais no cérebro do receptor são preservadas em um estado dormente imaturo. A maioria delas passa por diferenciação, durante a qual as moléculas de MHC são expressas integralmente.

Em particular, a eficiência insuficiente do transplante intraestriatal de preparações embrionárias de mesencéfalo ventral contendo neurônios dopaminérgicos para o tratamento do parkinsonismo experimental está associada à baixa taxa de sobrevivência dos neurônios dopaminérgicos transplantados (apenas 5-20%), causada pela gliose reativa que acompanha o trauma local do parênquima cerebral durante o transplante. Sabe-se que o trauma local do parênquima cerebral e a gliose concomitante levam à ruptura da integridade da barreira hematoencefálica com a liberação de antígenos do tecido nervoso, em particular, OCAR e antígeno específico do neurônio, no sangue periférico. A presença desses antígenos no sangue pode causar a produção de anticorpos citotóxicos específicos contra eles e o desenvolvimento de agressão autoimune.

V. Tsymbalyuk e coautores (2001) relatam que o ponto de vista tradicional ainda se mantém, segundo o qual o sistema nervoso central é uma zona imunologicamente privilegiada, isolada do sistema imunológico pela barreira hematoencefálica. Em sua revisão da literatura, os autores citam uma série de trabalhos que indicam que esse ponto de vista não corresponde totalmente à essência dos processos imunológicos no cérebro de mamíferos. Foi estabelecido que substâncias marcadas introduzidas no parênquima cerebral podem atingir os linfonodos cervicais profundos e, após a injeção intracerebral de antígenos, anticorpos específicos são formados no corpo. As células dos linfonodos cervicais respondem a esses antígenos por proliferação, começando no 5º dia após a injeção. A formação de anticorpos específicos também foi revelada durante o transplante de pele para o parênquima cerebral. Os autores da revisão fornecem várias vias hipotéticas para o transporte de antígenos do cérebro para o sistema linfático. Uma delas é a transição de antígenos dos espaços perivasculares para o espaço subaracnóideo. Supõe-se que os espaços perivasculares localizados ao longo dos grandes vasos cerebrais sejam o equivalente ao sistema linfático cerebral. O segundo caminho se estende ao longo das fibras brancas – através do osso etmoide até os vasos linfáticos da mucosa nasal. Além disso, existe uma extensa rede de vasos linfáticos na dura-máter. A impermeabilidade da barreira hematoencefálica aos linfócitos também é bastante relativa. Foi comprovado que os linfócitos ativados são capazes de produzir enzimas que afetam a permeabilidade das estruturas do "filtro imunológico" cerebral. Ao nível das vênulas pós-capilares, as células T auxiliares ativadas penetram a barreira hematoencefálica intacta. A tese sobre a ausência de células no cérebro que representem antígenos não resiste a críticas. Atualmente, a possibilidade de representar antígenos no SNC por pelo menos três tipos de células foi comprovada de forma convincente. Primeiramente, trata-se de células dendríticas derivadas da medula óssea, localizadas no cérebro ao longo dos grandes vasos sanguíneos e na substância branca. Em segundo lugar, os antígenos são capazes de apresentar células endoteliais dos vasos sanguíneos cerebrais e, em associação com antígenos do MHC, o que favorece o crescimento clonal de células T específicas para esses antígenos. Em terceiro lugar, as células da microglia e da astróglia atuam como agentes apresentadores de antígenos. Participando da formação da resposta imune no sistema nervoso central, os astrócitos adquirem as propriedades de uma célula efetora imune e expressam diversos antígenos, citocinas e imunomoduladores. Quando incubadas com interferon-y (y-INF), as células astróglias expressam antígenos do MHC de classe I e II in vitro, e os astrócitos estimulados são capazes de apresentar antígenos e manter a proliferação clonal de linfócitos.

Traumatismo do tecido cerebral, inflamação pós-operatória, edema e depósitos de fibrina associados ao transplante de tecido nervoso embrionário criam condições para o aumento da permeabilidade da barreira hematoencefálica, com comprometimento da autotolerância, sensibilização e ativação de linfócitos CD3+CD4+. A apresentação de autoantígenos e aloantígenos é realizada por astrócitos e células microgliais que respondem ao y-INF expressando moléculas de MHC, ICAM-1, LFA-I, LFA-3, moléculas coestimulatórias B7-1 (CD80) e B7-2 (CD86), bem como secreção de IL-1a, IL-ip e y-INF.

Consequentemente, a maior sobrevida do tecido nervoso embrionário após o transplante intracerebral do que após sua administração periférica dificilmente pode ser associada à ausência de início da imunidade ao transplante. Além disso, monócitos, linfócitos ativados (células CD3+CD8+ citotóxicas e células T auxiliares) e as citocinas que eles produzem, bem como anticorpos contra antígenos do transplante periférico de tecido nervoso embrionário, desempenham um papel importante no processo de rejeição. Um baixo nível de expressão de moléculas do MHC no tecido nervoso embrionário é de certa importância na criação de condições para uma maior resistência dos neurotransplantes aos processos imunológicos das células T. É por isso que, no experimento, a inflamação imunológica após o transplante de tecido nervoso embrionário para o cérebro se desenvolve mais lentamente do que após o enxerto de pele. No entanto, a destruição completa de transplantes individuais de tecido nervoso é observada após 6 meses. Nesse caso, os linfócitos T restritos por antígenos do MHC de classe II estão predominantemente localizados na zona de transplante (Nicholas et al., 1988). Foi estabelecido experimentalmente que, durante o neurotransplante xenológico, a depleção de células T auxiliares (L3T4+), mas não de linfócitos T citotóxicos (Lyt-2), prolonga a sobrevivência do tecido nervoso de ratos no cérebro de camundongos receptores. A rejeição do neurotransplante é acompanhada por sua infiltração por macrófagos e linfócitos T do hospedeiro. Consequentemente, os macrófagos do hospedeiro e as células microgliais ativadas atuam in situ como células imunoestimuladoras apresentadoras de antígenos, e o aumento da expressão de antígenos do MHC de classe I do doador aumenta a atividade destruidora dos linfócitos T citotóxicos do receptor.

Não faz sentido analisar as inúmeras tentativas especulativas de explicar a rejeição de neurotransplantes pela reação do sistema imunológico do receptor às células endoteliais ou elementos gliais do doador, visto que mesmo linhagens puras de células progenitoras neurais estão sujeitas a ataque imunológico. É importante ressaltar que a expressão de ligantes Fas por células cerebrais que se ligam a receptores de apoptose (moléculas Fas) em linfócitos T que se infiltram no cérebro e induzem sua apoptose desempenha um papel importante nos mecanismos de maior sobrevida do transplante no SNC, um mecanismo de proteção típico de tecidos autoimunogênicos trans-barreira.

Como V. Tsymbalyuk e coautores (2001) corretamente observam, o transplante de tecido nervoso embrionário é caracterizado pelo desenvolvimento de inflamação com a participação de células sensibilizadas a antígenos cerebrais e células ativadas, anticorpos e também como resultado da produção local de citocinas. Um papel importante nisso é desempenhado pela sensibilização preexistente do corpo a antígenos cerebrais, que ocorre durante o desenvolvimento de doenças do SNC e pode ser direcionada aos antígenos do transplante. É por isso que a sobrevivência a longo prazo de neurotransplantes histoincompatíveis é alcançada apenas pela supressão do sistema imunológico com ciclosporina A ou pela introdução de anticorpos monoclonais nos linfócitos CD4+ do receptor.

Assim, muitos problemas do neurotransplante permanecem sem solução, incluindo aqueles relacionados à compatibilidade imunológica dos tecidos, que só podem ser resolvidos após pesquisa fundamental e clínica direcionada.