Células estaminais embrionárias

A descoberta de células estaminais embrionárias - não surgiu acidentalmente, mas apareceu no solo preparado da pesquisa científica no campo da biologia do desenvolvimento. O termo "célula-tronco" foi introduzido em medicina até 1908 no congresso da sociedade hematológica em Berlim por Alexander Maksimov em conexão com células hematopoiéticas. Muito antes de isolar e obter linhas estáveis de células estaminais embrionárias pluripotentes, as células de carrapato de terato e embrião foram usadas em estudos de processos de desenvolvimento precoce para estudar mecanismos desconhecidos de embriogênese, incluindo a sequência de expressão de genes iniciais e produtos protéicos de sua atividade.

Mas a totipotência do genoma humano está irremediavelmente perdida no processo de evolução? Não, e a embriogênese é prova. Se assim for, então, quando, em princípio, o segundo caminho do desenvolvimento evolutivo será realizado? Provavelmente, quando uma pessoa sai do Cosmos, onde as condições ambientais serão relativamente constantes há bastante tempo. A perda de tecido ósseo (desmineralização de ossos em estado de ingravidez), que é muito lento para ser remodelada e regenerada, pode ser considerada como o primeiro passo para o processo de adaptação humana, como espécie, para a existência nas condições do Cosmos. No entanto, o pagamento para o segundo caminho do desenvolvimento evolutivo será diferente - a esterilidade será o preço a pagar de volta a todas as células de totipotência e absoluta plasticidade. Então multiplique neste mundo de "camaleões evolutivos", não haverá meiose, otpochkovaniem. Mas viveremos por muito tempo. A imortalidade da telomerase é a imortalidade da ameba. Em um organismo multicelular, as células-tronco são o substrato da longevidade quantitativa e qualitativa.

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Fontes de células estaminais embrionárias

Fontes hoje de células estaminais embrionárias para os testes de laboratório são Linha murino teratocarcinoma (129 / SV, F19, F8, Zin 40, CGR 86, RL, CCE, JM-1, E14TG2a, CGRSb) e teratocarcinoma humano (NTERA-2, TERA-2 , Clone H-9), bem como as linhas de ESC Trauneone. No entanto, a presença detalhado passaporte celular indicando fenótipo imune, os resultados da análise cromossoma de perfis de expressão de ARNm expostas não receptores e sinalização intracelular proteína não compensar as desvantagens significativas teratokartsinomnyh linhas CES - rápida perda de totipotência e impossibilidade de aplicação nos ensaios clínicos, e diferenciação misturado em cultura é muito difícil de isolar pura linha especializada de uma população heterogênea de células. Portanto, geralmente, uma fonte linhas ESC produzido para fins clínicos, serve como a massa celular interna do blastocisto, os embriões individuais blastómeros da fase de 8 células de desenvolvimento, as células mórula fases posteriores, e as células germinativas primário.

Deve notar-se que as células de teratocarcinoma, apesar de possuírem propriedade de pluripotência, apresentam um potencial pluripotente significativamente menor do que o ESC. A sua integração com células embrionárias raramente leva à formação de quimeras, nas quais, além disso, nunca se formam gametas com um genótipo de células de teratocarcinoma. Acredita-se que isso se deve ao aparecimento freqüente de anormalidades cromossômicas no cultivo de células de teratocarcinas: perda do cromossomo Y, uma variedade de trissomias, deleções ou translocações.

As tentativas de distinguir a linha ESC humana foram realizadas muitas vezes, mas essa tarefa não pôde ser resolvida, já que os blastocistos humanos normais são difíceis de acessar objetos. Além disso, em humanos, a freqüência de anormalidades cromossômicas é maior do que na embriogênese de animais. A maioria predominante de embriões humanos precoce obtidos após a adubação in vitro apresentam mosaico cromossômico caótico e, muitas vezes, há aberrações numéricas e estruturais. Mesmo mais tarde, no estágio do blastocisto, apenas 20-25% dos embriões humanos consistem em células com cariotipo normal. Era quase impossível usar tais embriões para criar um ESC, uma vez que os zigotos eram geralmente cultivados nos estágios de dois ou quatro blastômeros e depois transplantados para o útero. Apenas relativamente recentemente foi uma técnica confiável desenvolvida para o cultivo de óvulos humanos fertilizados para o estágio de blastocisto. A introdução desta técnica na prática da adubação in vitro não só aumentou a freqüência de sucesso do implante, mas também tornou os blastocistos normais um objeto mais acessível.

Outra fonte de células estaminais pluripotentes são células germinativas primárias que, ao contrário das populações progenitoras mais avançadas do epitélio hermético, não possuem integrina beta em sua superfície, mas expressam alta atividade da fosfatase alcalina. Deve-se notar que, no experimento, a população de células-tronco, que foram formadas a partir de células sexuais primárias, tem sido estudada desde os anos 80 do século passado. Ao mesmo tempo, desenvolveu-se uma técnica para isolar células germinais primárias do rudimento da gonad de embrião de rato. Os primeiros resultados infrutíferos do cultivo de células germinativas primárias in vitro sugeriram a desesperança dessas tentativas, uma vez que as células, embora sobreviveram, não proliferaram e morreram nas primeiras 24 horas. Mais tarde, descobriu-se que as células germinativas primárias de ratinho se reproduzem in vitro somente na presença de fatores de crescimento de polipéptidos específicos solúveis e ligados à membrana no meio de cultura. Os resultados de numerosos estudos indicaram que a sobrevivência e a proliferação de células germinais primárias requerem a presença no meio de cultura não só de LIF, mas também de ligamentos à membrana, bem como de fatores de aço solúveis (SIF). Estes péptidos são produzidos por células somáticas de embriões homozigéticas para a mutação de aço, e uma delas é um ligando do proto-oncogene cKit.

As células germinais primárias de mamíferos e humanos são de origem extragonadal e são a fonte do desenvolvimento clonal da linha celular do sexo. O início da linha primária de células germinativas, bem como para todos os tecidos do embrião, bem como o mesoderma extraembrionário, dá o epiblasto (ectodermo primário) dos embriões iniciais, que possui uma organização estrutural em mosaico. A remoção microcirúrgica de várias partes do embrião inicial estabeleceu uma zona de localização no epíclito de um clone de precursores comprometidos de células germinais primárias. Com a ajuda do roxina dextrano, que foi utilizado como marcador celular, estabeleceu-se que os precursores das células primárias sexuais estão localizados na região proximal do epiblasto, ao lado do ectoderma extra-embrionário. A linha celular primária sexual emerge do clone de 45 células, cuja alocação ocorre no início da gastrulação. Em seguida, ocorre a segregação do clone e, durante a gastrulação, as células do sexo primário entram no mesoderma extraembrionário e são encontradas na base do botão dos alantoides, atrás da banda primária. A partir daí, as células germinativas primárias migram para a extremidade ventral do endoderme endocervix e depois se movem ativamente pelo mesentério, preenchendo os rolos genitais no final da migração. No processo de migração, bem como nos primeiros 2-3 dias de localização no rudimento das gônadas, as células sexuais primárias proliferam ativamente e passam por oito ciclos replicativos. Se no início da migração existem cerca de 50 células germinais primárias, então, nos cistos reprodutivos de embriões de ratos de desenvolvimento de doze dias, o número de células sexuais primárias ultrapassa 25.000.

A similaridade funcional dos CES e as células germinativas primordiais demonstra a integração completa deste último na massa celular interior de blastocistos de substituição e subsequente desenvolvimento completo do embrião, o tecido que consistem apenas de descendentes de células germinativas primordiais. De acordo com outras características de murino células germinais primárias PGCs também foram idênticos, demonstrando a capacidade de se diferenciarem em diferentes direcções, de modo a formar corpos embrióides in vitro, uma forma in vivo teratomas quando injectadas subcutaneamente em ratinhos imunodeficientes que se assemelham teratomas espontâneas ratinhos testis linha 129 / ter.

Verificou-se que quando LIF, SIF solúvel em membrana e solúvel são adicionados às células germinativas primárias isoladas, embriões de ratos de 8 dias de idade sobrevivem e se reproduzem em cultura por 4 dias, mas depois morrem. E o período em que a morte de células sexuais primárias é observada em cultura coincide com o estágio de desenvolvimento de embriões de camundongo (12,5-13,5 dias), quando nos rudimentos da gônada as células do sexo feminino primário entram na meiose e nas células sexuais primárias masculinas a mitótica divisão. No entanto, se adicionamos ao meio ambiente não apenas os fatores de crescimento de LIF e SIF, mas também FGF2, as células sexuais primárias continuam a proliferar, e nas subculturas, são formadas colônias de células que podem se reproduzir mesmo depois que os fatores de crescimento (SIF e FGF) são removidos do meio. Tais células podem ser cultivadas por um longo tempo sobre o substrato de fibroblasto embrionário sem a adição do LIF de fator de crescimento solúvel. São estas linhas celulares estáveis derivadas de células germinativas primárias que foram sugeridas como células germinativas embrionárias. Este termo não pode ser considerado bem sucedido, uma vez que é impossível produzir células germinativas embrionárias quando as células EG são cultivadas, o que pode levar a cabo fases subsequentes de oogênese ou espermatogênese. Isto é devido ao fato de que as linhas de células EG, embora originárias de células germinais primárias, mas adquiram as propriedades de células-tronco embrionárias pluripotentes em cultura, perdem a capacidade de se comprometerem com linhas herméticas. Em outras palavras, as células do sexo primário perdem as propriedades dos precursores de gametas após o cultivo e são transformadas em células pluripotentes de tipo ESC.

Observa-se que quando são administrados ratos EG imunodeficientes, não surgem teratomas. Supõe-se que a perda da capacidade das células EG humanas para iniciar os teratomas deve-se ao fato de que essas linhas não foram criadas diretamente a partir de células germinais primárias cultivadas, mas foram obtidas a partir de células isoladas de corpos embrióides. Portanto, é possível que sejam descendentes de células pluripotentes, mas já comprometidas.

Deve-se notar que existem diferenças fundamentais entre células EG e células germinais primárias. Estes últimos não permitem a obtenção de embriões de camundongos quiméricos, o que indica a falta de capacidade das células germinativas primárias para se integrarem na massa celular interna ou no trophectoderme. As características da população de células sexuais primárias são mais semelhantes às linhas comprometidas de células somáticas de embriões posteriores, cuja introdução no blastocisto também não conduz à formação de embriões quiméricos.

A modificação da técnica de cultivo de corpos embrióides obtidos por agregação de células EG permitiu selecionar outra população de células pluripotentes, denominadas "células derivadas do corpo embrionóide (células EBD)", por seleção em meios seletivos. A capacidade das células EBD para se multiplicarem durante muito tempo na cultura permitiu criar linhas celulares estáveis de células comprometidas. Foram obtidos clones de células que expressam um amplo espectro de mRNA e marcadores de proteínas de células especializadas. Esta abordagem, como resultado, provou que as células germinais humanas primárias são pluripotentes e diferenciam in vitro em diferentes tipos de células: neurônios, neuroglia, endotélio vascular, células hematopoiéticas, células musculares e endodermais.

Fontes alternativas de células estaminais embrionárias

A fonte alternativa de linhas ESC humanas pode ser células híbridas. Implantação no útero de estrutura vacas pseudográvidas geterogenomnoy obtido quando a fusão através de electroporação fetusa células somáticas humanas com as vacas de ovo, que tinha sido previamente removido do pronleo, torna possível receber a massa celular interna da pré-implantação dos embriões estágios de desenvolvimento artificiais. Para isso, o blastocisto do ovo da vaca com o núcleo transplantado da célula humana é obtido na primeira etapa.

Na segunda etapa, o embrião é extraído do blastocisto, e dele - o ESC de acordo com o método de Thomson. Vale ressaltar que os melhores resultados no isolamento de linhas ESC usando esse método foram obtidos usando núcleos de células foliculares ou células germinativas primárias que persistem no corpo humano em estado de hibernação. Isto é devido ao facto de que um ovo de vaca transplantadas células humanas neukorochennye núcleo deve ter elevada actividade e telomeazy dos telómeros que evita ESC clones envelhecimento prematuro derivadas de ovo híbrido (Repin, 2001). Sabe-se que as proteínas EGF de marcador intracelular mais importantes são Oct3, Oct4, Tcf, Groucho, que pertencem às chamadas proteínas do silenciador de cromatina. Os silenciadores fornecem uma embalagem particularmente compacta de heterocromatina, o que impede a formação de loops de euchromatin. O pacote de cromatina mediado por essas proteínas correlaciona-se com a totipotência do genoma ESC. Até o momento, foi estabelecido que os óvulos maduros de bovinos e humanos são o único tipo de células especializadas que contêm altas concentrações de proteínas silenciadoras no citoplasma. Nesta base, foi desenvolvido um método para a produção de ESCs híbridos, transferindo núcleos de células somáticas para óvulos não-nucleares de vacas. Estudos preliminares preliminares mostraram que o citoplasma dos óvulos das vacas restaura a toxidade do genoma do núcleo das células somáticas humanas em 12-24 horas de cultivo.

De particular interesse são os dados sobre as características do desenvolvimento de pré-implantação de embriões humanos, que indicam uma substituição posterior de células totipotentes por uma população de células pluripotentes do que em camundongos. O estudo das transformações celulares mostrou que células da massa celular interna do blastocisto humano, além de ESCs, também geram células trofoblastas, o que indica sua potência total.

Sabe-se que, no estágio do blastocisto, existem duas populações de células comprometidas de forma diferente. Um deles é a camada externa do blastocisto, trofectoderm, derivado de células trofoblastras e outros componentes da placenta embrionária. A segunda população de células é agrupada em uma massa densa, que entra em contato com a superfície interna do trophectoderme. A população celular da massa celular interna é derivada de todos os tecidos e germes dos órgãos embrionários. No estágio do blastocisto tardio, um endoderma extra-embrionário é formado a partir da massa celular interna e um epiblasto é formado (o ectodermo primário). Ao mesmo tempo, as células epiblast mantêm a pluripotência, enquanto a capacidade de diferenciar as células do endoderma extra germinal é limitada.

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Obtenção de células-tronco embrionárias humanas

Até recentemente, acreditava-se que era impossível obter um ESC do trofoblasto. No entanto, a linha de células estaminais diplóides de trophectoderm isoladas do blastocisto, em um ambiente onde FGF2 e heparina estão presentes em vez de LIF, proliferam e se transformam em células-tronco. Se você remover do meio de FGF2, as células trofectoderma parar de procriar, eles começam endorreduplicação de cromossomas e elementos celulares trofektodermalnye gradualmente transformada em um células trofoblásticas gigantes. Provavelmente, LIF não estimula a proliferação de células trofectoderma devido ao facto de FGF2 desencadeia um mecanismo transsignalizatsii por FGF2, ligação ao receptor citoplasmático (FGFR2), activar a MAP-cinase no citoplasma - ERK1 e ERK2. Por conseguinte, quando incorporado nas células do blastocisto de uma via de sinalização (LIF - gpl30 - JAK-cinase - STAT3) massa celular interna são transformados em hESCs pluripotentes, enquanto activa o segundo mecanismo de sinalização transmembranar (FGF2 - FGFR2 - MAP-quinases ERK1 / ERK2) No blastocisto, as células-tronco do trophectodermo são formadas. A escolha do caminho de sinalização, por sua vez, depende da atividade do gene oct4. Este domínio POU gene pertencente, localizado no locus T 17 autossomas e é expressa durante a oogese, no período de moagem, bem como em culas da massa celular interna do blastocisto, e em células germinativas primordiais. O papel funcional do gene oct4 reside na codificação do fator de transcrição necessário para o surgimento de células pluripotentes, sua diferenciação e desdiferenciação.

A expressão do gene oct4 no ESC varia dependendo da interação deste fator de transcrição com os cofatores. Uma regulação direcional da expressão de oct4 em blastocistos mostrou que, quando sua atividade diminui, metade das células formam um trophectoderm, enquanto que com um aumento na expressão induzida de oct4, predominantemente ocorre ESC.

No experimento, o ESC não pode ser convertido em uma linha ao cultivar blastômeros totipotentes no estágio de esmagamento, bem como no estágio de gastrulação e fases posteriores do desenvolvimento embrionário. Os ESC dos ratos geralmente são alocados no 3,5-4,5º dia de gravidez, o que corresponde ao sexto (blastocisto de camada única) e ao sétimo estágio (um blastocisto de duas camadas - um cilindro de ovo precoce) de embriogênese normal. Obviamente, apenas no período de pré-implantação os embriões de camundongos contêm populações celulares que podem ser transformadas em ESC. Consequentemente, o isolamento das linhas ESC só é possível em certos estágios da embriogênese. Totitipotent, do ponto de vista da possibilidade de desenvolver um embrião viável com membranas embrionárias e placenta, são o zigoto e os blastômeros que surgem durante o esmagamento. A perda da potência total das células germinativas começa no estágio final da morula, quando a fragmentação do blastomere depende da sua localização. Os blatomeros de morel precoce mantêm a totipotência, porque manipulações experimentais com mudanças em sua localização, por exemplo, a inversão de sua localização, não impedem o desenvolvimento de um embrião cheio.

Verificou-se que a eficiência da liberação de ESC na linha é afetada pelo estado dos blastocistos no momento de sua explicação. O uso de blastocistos após a modelagem de uma diapausa de sete dias no trato genital de camundongos ovariectomizados no dia 3.5 da gravidez e a realização de progesterona promove uma alocação mais bem sucedida de linhas de células estaminais embrionárias. Supõe-se que, sob tais condições, o número de blastômeros que formam a massa celular interna aumenta. Também é possível que o ciclo celular se estenda e a maioria dos blastômeros entram na fase G0.

Além disso, a criação de linhas de células estaminais embrionárias humanas pluripotentes estáveis depende dos embriões genótipo: bastante facilmente distinguidos dos CES Murino blastocistos linha 129, é significativamente mais difícil obtê-las utilizando murganhos CS7BL / 6 e praticamente impossível isolar a linha de hESCs blastocistos ratos CBA / Ca. Obviamente, os embriões precoce possuem algumas características genéticas que afetam o desenvolvimento da linha pluripotente ESC. No entanto, no cultivo de epiblast isolado, e também com a seleção seletiva de células diferenciadas, as linhas ESC de embriões precoce de camundongos CBA / Ca ainda estavam isoladas.

Uma técnica padrão comprovada para obtenção de linhas ESK a partir de blastocistos é dada em manuais de laboratório sobre a técnica de experimentação de embriões precoce. As linhas ESK experimentais também podem ser obtidas cultivando um epístata isolado (ectodermo primário) de embriões de mouse de 4,5 dias com uma técnica microcirúrgica bastante complexa e condições de cultivo modificadas. A complexidade deste procedimento é justificada, uma vez que a freqüência de formação de linhas ESC foi muito maior do que no trabalho com a massa celular interna do blastocisto.

Para isolar as linhas ESC, cada clone é transferido para um micro-poço, um agregado de células 40-60 é cultivado, está novamente disperso. A repetição múltipla deste procedimento permite obter uma linha ESC imortalizada com uma taxa de proliferação máxima de células normocaróticas anexadas ao plástico, que, através de 50-100 passagens, mantêm a totipotência e a alta atividade da telomerasa. No processo de suporte de linhas ESC, a poluição do meio ambiente ou soro com endotoxinas bacterianas é a concentração mais perigosa - mesmo traço de endotoxina no meio de cultura, causa morte maciça de células germinativas imaturas. Com um monitoramento cuidadoso do crescimento linear e da dispersão atempada, os ESCs em cultura são capazes de divisão simétrica, em que ambas as células filhas permanecem pluripotentes e capazes de realizar um número ilimitado de ciclos celulares, mantendo um cariotipo diploide e potência total.

A seleção de uma população limpa de ESCs humanos pode ser realizada após a transfecção em seu genoma de moléculas de DNA recombinante contendo um gene que codifica a síntese de uma proteína verde fluorescente (GFP). A expressão de GFP aumenta com o crescimento de ESC em condições que suportam sua proliferação, enquanto que com o início da diferenciação, o nível de expressão desse gene é reduzido, o que permite a seleção de linhas celulares pluripotentes estáveis e puras em um meio seletivo. Quando cultivada com a seleção GFP de ESCs, a freqüência de colônias é grandemente aumentada, pois nas condições de seleção, o poderoso efeito antiproliferativo de células diferenciadas é eliminado.

A transferência de células estaminais embrionárias humanas para a linha é realizada pelo método de isolamento de embriões pré-implantação (na fase de 80-120 células), que permanecem após o procedimento de fertilização in vitro. Para isso, os embriões de "excesso" obtidos artificialmente são dispersos mecanicamente no ambiente Delbecco-Needle. Depois que as células são rotuladas com anticorpos monoclonais seletivos com um marcador fluorescente, as células do embrião são isoladas. O embrião é disperso em células individuais usando uma mistura de disaspase-colagenase. As células dissociadas foram cultivadas em um meio especial (80% de meio Delbekko + soro de vitelo fetal a 20% na presença de 500 ug / ml de IL-6, LIF e SCF) na monocamada de fibroblastos embrionários alimentador 3 primeiras passagens. Neste caso, a sobrevivência e a proliferação de células estiradas e progenitoras são suportadas pela exposição a IL-6, LIF e SCF. Em um ambiente desse tipo, os ESCs crescem por meio de clones de suspensão de células raspadas, que devem ser dissociadas por pipetagem múltipla suave. Novos clones aparecem na cultura suspensa no dia 5º-7º. A taxa máxima de crescimento de ESC é conseguida pela dissociação repetida de clones no estágio de 10 a 15 células. Então, cada clone é transferido para uma microcélula e cresceu para um agregado de 40-50 células. O procedimento é repetido muitas vezes em passagens, aumentando o volume de cultura para uma densidade de 5-10 milhões de células por copo de 6 centímetros. Ao utilizar tais passaging um Thomson foi isolado 10 clones CES humanas imortais que através de passagens 100 retêm elevada actividade da telomerase, a capacidade de proliferação intensa e características fenotípicas potência total mínimo, com diferenciação em qualquer uma das 350 linhas de células especializadas que são derivados ecto, meso - e endoderma. A diferenciação de ESCs humanos começou (com uma mudança de ambiente, a adição de soro e eliminação de LIF) a partir da fixação de células ao substrato, o que indica o desenvolvimento do citoesqueleto e a expressão de receptores de adesão. É importante que, com a proliferação irrestrita de ESCs humanos, um cariotipo normal foi preservado.

O segundo método de isolação de linhas ESC humanas é baseado no uso de células sexuais primárias. Estudos experimentais mostraram que as linhas celulares de Eu podem ser obtidas a partir de placas genitais de embriões de camundongos de 12,5 dias de idade. No entanto, nestes casos, a frequência de formação das linhas celulares progenitoras foi significativamente menor do que em experiências com embriões anteriores. Ao mesmo tempo, as células sexuais primárias de gônadas de embriões de ratos de idade gestacional de 13,5 dias geralmente são incapazes de se transformar em linhas.

As primeiras linhas estáveis de células EG pluripotentes humanas foram obtidas a partir de gonócitos primários isolados das células genitais de embriões de 5-9 semanas de idade. As células isoladas foram cultivadas num substrato de fibroblastos embrionários de rato inactivados em meio DMEM com soro fetal ao qual foram adicionados mercaptoetanol, forscolina, bem como factores de crescimento humanos recombinantes (FGF e LIF). Após 7-12 dias, as colônias multicelulares apareceram em cultura, de acordo com características morfológicas e marcadores moleculares correspondentes a células EG humanas. Após a agregação, essas células formaram corpos embrióides, com o desenvolvimento adicional de quais células especializadas apareceram, características para os derivados de todas as três folhas embrionárias. Ao longo de 10 a 20 passagens, as linhas de células EG mantêm o cariotipo normal e não perderam pluripotência.

Também é demonstrado que o efeito combinado dos fatores LIF, ligados à membrana e de ácido solúvel, bem como TGF-b, modifica o programa para o desenvolvimento de células germinais primárias. Em vez de parar as divisões mitóticas e começar a se diferenciar em relação à oogênese ou à espermatogênese, as células sexuais primárias continuam a proliferar. Após vários ciclos mitóticos adicionais, eles se tornam semelhantes às células epiblastas e, perdendo as propriedades dos precursores das células germinativas, são transformados em células EG de tronco embrionárias pluripotentes.

Assim, em 1998, as linhas imortalizadas de células sexuais primárias foram isoladas pela primeira vez do rudimento sexual do tecido de autópsia fetal humana. Em embriogênese humana, as células sexuais primárias aparecem no saco vitelino na 3ª semana de desenvolvimento, e às 4 a 5 semanas migram para a zona do tubérculo sexual, onde se formam populações latentes de gonócitos primários. No estado inativo, as células germinais primárias permanecem no botão até o nascimento. As linhas de células germinais primárias são isoladas do tubérculo genital fetal de embriões de 5-9 semanas de idade, o tecido extraído ex tempore tratado com uma mistura de colagenases de tipo IV-V, hialuronidase e DNase para aumentar o rendimento celular quantitativo e qualitativo. As células germinais primárias nos tecidos do tubérculo genital fetal são cercadas por células do estroma Sertoli (mesenquimatosas). O propósito funcional das células de Sertoli é a produção de fatores anti-apoptóticos (Fas-ligando), mitógenos, bem como imunossupressores que protegem as células-tronco sexuais do ataque imune do corpo. Além disso, o microambiente estromal do tubérculo genital desempenha um papel importante na maturação dos gametas. As células germinativas primárias isoladas são plantadas na cultura sobre a camada estromal do alimentador consistindo nos fibroblastos fetais das três primeiras passagens. A combinação mais eficaz de mitógenos é um complexo composto por LIF, FGF e forscolina (um estimulante para a formação de AMPc). A proliferação de células germinais primárias in vitro requer a adição de soro fetal, na presença da qual a proliferação de gonócitos primários em cultura é acompanhada pela formação de clones de células globulares, não ligados ao substrato.

No Instituto Nacional de Saúde dos Estados Unidos, com base na generalização da informação existente sobre os métodos de isolamento das linhas ESC humanas do blastocisto, concluiu-se que a liberação bem sucedida do ESC é mais provável no cultivo de blastocistos com massa celular interna bem formada (células-tronco: progresso científico e futuras orientações de pesquisa Nat. Inst, da Health USA). Deste ponto de vista, a fonte ideal de ESC para a criação de linhas são blastocistos do 5º dia de desenvolvimento, dos quais, ao isolar a massa celular interna, o trophectoderm deve ser cuidadosamente removido. A massa celular interna isolada, que consiste em 30-35 células nesta fase, deve ser cultivada no substrato de fibroblastos murinos embrionários, que é a condição decisiva para a formação de colônias ESC em cultura.

A análise das características fenotípicas das células estaminais embrionárias

De particular interesse é a análise comparativa interespecífica de características fenotípicas do ESC. Verificou-se que as colónias ESC humanos - uma densa aglomerados de células epiteliais achatadas, enquanto que os ratinhos de bezerro embrióides consistem de conglomerado solto das células arredondadas. No ESC humano, o índice da relação nuclear-plasma é menor que no ESK do mouse. As células estaminais embrionárias de macacos formam colônias de células mais planas com bordas irregulares. Nos primeiros clones de primatas ESC, células simples são facilmente vistas. O ESC proliferativo de todas as espécies animais estudadas não expressa moléculas de MHC da primeira e segunda classes. Ao mesmo tempo, os CES humanos dar uma resposta positiva a anticorpos TERA 1-60 e GCTM-2, o que indica a presença na sua superfície queratina / proteoglicanos de sulfato de condroitina, característica de embrionário (teratomas), as células estaminais -kartsinomnyh. Expressão em hESCs todos os tipos de gene de animais oct4 sugere que, apesar das diferenças fenotípicas em CES humanos e de ratinho, aparentemente activado pelo mesmo conjunto de genes responsáveis pela manutenção da pluripotência (Peru, 2001). Além disso, as linhas de ESC derivadas de ratos embrionários, porcos, coelhos, primatas, e bovinos, têm características morfológicas semelhantes, um conjunto semelhante de identificação molecular de marcadores e um mecanismo molecular quase idêntico para a execução do programa a embriogénese que lhe permite ter um novo olhar para o problema xenotransplante .

Ao contrário da embriogênese normal in vivo, a proliferação de ESC in vitro não é acompanhada pela formação de folhas embrionárias e prossegue no contexto do bloqueio de Nogens homeóticos, isto é, sem organogênese. Como os genes de segmentação não funcionam, o desenvolvimento embrionário, como a inserção embrionária, a segmentação embrionária, a formação do saco vitelino, os órgãos e os tecidos alanóicos e outros órgãos e órgãos provisórios, não podem ser reproduzidos na cultura ESC. Os ESC culturais foram congelados no início da formação de 350 linhas de restrição de células especializadas. Assim, o clone das células progenitoras da filha e ESC centralizado local são apenas um modelo do embrião, no decurso do desenvolvimento, das quais diferentes linhas de células especializadas, que, no entanto, são originárias de precursores comuns, formam-se simultaneamente em diferentes regiões de tecido. Apesar do nível mínimo de receptores na superfície de hESCs, retêm a capacidade de executar processos morfogenéticos primitivos que simulam a maior parte da estrutura de embrião precoce: hESCs lamas em cultura e agregados forma uma estrutura semelhante a blastocisto ou ainda mais tarde embriões (cilindros de ovo). Esses agregados de suspensão foram adequadamente denominados corpos de embriões simples e complexos.

Quando misturado diferenciar-se em várias células do corpo embrióide expressas simultaneamente por ectoderme genes precoces (OCT3, FGF-5, nodal), endoderme (GATA-4), mesoderme (brachyury), mesoderme cardiogénico (PKH-2,5), tubo neural (msx3 ) e hematopoiese (elkf). Usando várias combinações de citoquinas e de factores de crescimento para o direccionamento a formação das células da camada germinal in vitro num número de casos, foi possível obter corpos embrióides, os quais foram preferencialmente expressos genes ectoderme ou mesoderme, que abre o caminho para a modelação de gastrulação e fase organogénese cedo.

O crescimento clonal de ESC é evidência de divisão celular assimétrica, na qual apenas um dos ESCs no centro do clone mantém o potencial reprodutivo ilimitado, enquanto a segunda célula-filha gera uma geração de células progenitoras que já estão em diferenciação. Portanto, a taxa de multiplicação do clone na periferia do corpo embrionóide é maior do que no centro. As células marginais do clone crescente sofrem diferenciação desordenada espontânea, migram ou morrem pelos mecanismos da apoptose. Estes eventos determinar o destino do clone se a taxa de proliferação excede a taxa de migração e morte celular por apoptose, clone tamanhos continuar a aumentar, estabilização ocorre com igual a apoptose e a taxa de formação de nova velocidade célula, regressão - a relação inversa desses processos. As células progenitoras se dividem simetricamente, isto é, ambas as células filhas são ainda diferenciadas em linhas celulares especializadas maduras. A proporção de células ESC / progenitor varia, mas sempre a quantidade de ESC é apenas uma fração de um por cento da população de células progenitoras. Portanto, apenas uma pipetagem cuidadosa e uma desagregação oportuna de clones podem aumentar o número de ESCs em cultura. Para obter o rendimento máximo de ESC, o mais efetivo foi a desagregação dos clones no estágio de 10 a 12 células. A direção e o grau de diferenciação das células no corpo embrionóide dependem da sua localização. As células externas do corpo embrionário não expressam o gene oct4 e são diferenciadas nas células do endoderma primário, a partir das quais as células epiteliais do endoderma extra germinal parietal e visceral são posteriormente formadas. As células internas do corpo embrionário expressam o gene oct4 e mantêm a pluripotência durante 48 horas de cultura. No entanto, em seguida, ocorre um rearranjo morfológico da cultura na monocamada epitelial e começa a expressão dos genes que controlam o desenvolvimento do ectodermo primário. Em seguida, começa o processo de cito-distingação desordenada total com a aparência de vários tipos de células que são as derivadas das três folhas germinais. No processo de diferenciação espontânea de células do corpo embrionário, os agregados com marcadores de endoderma na forma de fragmentos (cistos) do saco vitelino aparecem em primeiro lugar. Além disso, os angioblastos e as células endoteliais dos capilares crescentes aparecem nessas estruturas. Nos estágios finais da diferenciação espontânea das células internas do corpo embrionóide, várias células diferenciadas terminam, incluindo neurônios, elementos gliais, cardiomiócitos, macrófagos e eritrócitos. Em certa aproximação (considerando a inversão espacial de folhas que formam o tecido embrionário) via os corpos embrióides in vitro pode explorar processos morfogenéticos e analisam os mecanismos moleculares de período inicial de citodiferenciao embrionário, e estabelecer o papel de genes específicos na execução desses processos.

Assim, dentro do clone são células nas quais são descobertos diferentes programas de desenvolvimento genético - ESC, progenitores iniciais e populações diferenciadoras de progenitores. O cultivo de ESC pelos métodos de uma queda caída ou cultura de massa sem uma camada de alimentação e sem a adição de LIF no meio inevitavelmente leva à formação de corpos de embrioides. A morfologia das células das camadas externa e interna dos corpos embrionóides é diferente. A camada externa consiste em grandes células de processo. Sua superfície, de frente para o meio ambiente, é coberta por inúmeras microvílias. A camada externa das células é separada da membrana basal interna que se assemelha à membrana de Reichert, enquanto que as células da camada interna dos corpos de embrioides são um epitélio cilíndrico. Morfologicamente, a camada interna, apesar de conter muitas células divisórias, é mais uma reminiscência de colônias ESC indiferenciadas.

Características de células estaminais embrionárias humanas

Ausência de interacções parenquimatosas-mesenquimal no sinal de fundo bloqueando genes homeosis provoca o crescimento desordenado de PGC na cultura, uma vez que este guia é quebrado e os órgãos de infra-estruturas provisórias formação. Crescimento desorganizado e diferenciação espontânea desordenada de hESCs na cultura devido à falta de marcação estrutura do estroma de corpos futuros mesenquimais: in vitro é possível a formação de milhões de hepatócitos, mas você não pode obter quaisquer segmentos do fígado, incluindo elementos estruturais e funcionais tais, como os seios, o espaço de células Disse e Kupffer.

Acredita-se que a pluripotência do ESC se realiza exclusivamente na embriogênese com a formação de tecidos e órgãos do embrião, enquanto a placenta e o cordão umbilical derivam do trofoblasto. Fechado em uma concha trofektodermalnuyu ESK consistentemente gerar clones de células Provisória perceber programa de desenvolvimento por ARNm combinatórias grandes quantidades de matriz Nohteyaov topográfico, que determinam o arranjo espacial, forma, dimensões, o número de células de órgãos provisórias e definitivas e montagem parênquima na unidade estrutural e funcional. Ao mesmo tempo, o CES são o único tipo de célula em que o mecanismo molecular de realização dos seus potenciais completamente dissociado do programa genético do desenvolvimento e ESCO privaram-se a possibilidade de interacção com outras células devido ao bloqueio de ambas as percepções dos receptores e sistemas transsignalizatsii. No entanto, a ativação adequada do ESC leva a uma implantação gradual do programa de embriogênese, resultando no nascimento de uma vida totalmente formada e pronta para o feto de um organismo que consiste em bilhões de células. Neste processo curto mas demorado no espaço celular do caminho, os erros inevitavelmente surgem tanto nos mecanismos moleculares que suportam a atividade vital das células como nos programas que controlam sua proliferação, diferenciação e especialização. Portanto, na farmacogenômica moderna, consideramos separadamente as doenças da estrutura molecular e a doença da programação celular. E o efeito da maioria dos novos medicamentos visa corrigir os programas de diferenciação, proliferação e organogênese, bem como a regeneração de órgãos e tecidos. No organismo adulto através CES torna-se possível controlar o comportamento de células estaminais / progenitoras transplantados para o cérebro, fígado, baço, medula óssea e outros órgãos do ser humano, para reparar um danificado órgãos parenquimatosos receptoras, devido às células doador mesenquimais diferenciação e especialização matriz preservadas. Essencialmente, o programa totipotency está lançando mais oócito genoma de nível, zigotos e blastômeros, mas estas células ainda não é possível clonar e repicadas nas quantidades necessárias para as necessidades da medicina experiental e prático. Portanto, o ESC continua a ser uma fonte única de informação genética contendo códigos para um mapa de embriões tridimensional e códigos de restrição linear para linhas celulares especializadas durante a gastrulação.

As capacidades regenerativas praticamente ilimitadas do ESC são devidas ao fato de seu genoma, ao contrário do aparelho genético de células somáticas diferenciadas, preservar a pluripotência. Uma manifestação do estado dormente enraizada na CES informação genética é a chamada fenótipo mínimo - na superfície do CES de expressar um número limitado de receptores, e, por conseguinte, implementado muito poucos programas para interagir aparelho nuclear transsignalizatsii da célula com o seu microambiente. Contra o fundo de genes hibernação responsáveis pela restrição de linhas de células especializadas e diferenciação de células, apenas cerca de 30 dos 500 genes cujos produtos proporcionam células de comunicação com o microambiente circundante activado. Utilizando o método de análise em série da expressão do gene mostraram que a generalidade das caixas de genomas funcionais principais que regulam energia e metabolismo em células somáticas e os CES em última determinada quantidade extremamente baixa de mRNA de receptores, proteínas G, segundos mensageiros, transcriptases, cofactores expressão e repressão , isto é, todo o sistema de transferência transmembranar do sinal regulatório para a célula. Isto é devido à falta ou à expressão muito baixa de genes de transsanalização. Durante a diferenciação induzida no genoma de ESC 18 operação é interrompido de forma síncrona funcionando genes para o fundo activação transsignalizatsii 61 gene que controla a síntese de receptores de adesão celular, componentes da matriz extracelular, restrição transcriptases elementos messendzhernyh e sistema de transmissão de sinal para uma unidade nuclear com os receptores de membrana de células do plasma. Ao mesmo tempo, a expressão dos genes responsáveis pela síntese das proteínas silenciadoras, bem como os co-inibidores da expressão gênica, que asseguram a totipotência do genoma ESC, é bloqueada.

Foram encontrados marcadores genéticos para as células dos três folhetos embrionários. Camada de células ectodérmicas identificação realizada sobre a expressão de genes nodal, OCT3 e FGF-5, células mesodérmicas - brachyury gene, zeta-globina, endoderme - pelo GATA-4 expressão do gene. Na embriogénese normal, durante a gastrulação observada uma migração activa de populações imaturas de células estaminais e progenitoras, localmente designando áreas dos ossos faciais do crânio, algumas partes do cérebro, sistema nervoso periférico, sistema de condução cardíaco e tecido do timo, que são formados a partir de clones de células deslocadas. A marcação de células nos genes iniciais das folhas embrionárias facilita a tarefa de análise topográfica dos processos de migração de células progenitoras no embrião em desenvolvimento. Encontra-se em particular, que as células em expressão P19 agregados embryocarcinoma do primeiro brachyury mesoderme gene começa durante a redução da expressão do gene do activador de plasminogénio de tecido, a-fetoproteína, queratina 8, e queratina 19, que são marcadores de populações migratórias início da mesoderme. Consequentemente, a formação de tecidos de origem mesodérmica só começa após a conclusão do processo de migração de pontos e migração de células progenitoras mesodérmicas.

Com sinais fenotípicos extremamente limitados e ausência da maioria das unidades de sinalização trans, os ESC ainda expressam algumas moléculas receptoras que podem ser usadas para identificá-las. Vale ressaltar que os antígenos - marcadores de ESCs em seres humanos e primatas foram encontrados como comuns. Na maioria das vezes usados para hESCs rotulagem marcados anticorpos para antigénios membrannosvyazannym SSEA-3, (antígenos lipídicos originais que representam GL7 glicolípido complexo com ácido siálico) SSEA-4, bem como glicoproteínas de polímero elevado TRA-1-81, TRA-1-60. Além disso, os ESCs expressam antígeno embrionário específico SSEA-1 e fosfatase alcalina endógena, bem como um fator de transcrição específico de Oct4. A última é necessária para manter mecanismos de proliferação hESCs - gene Oct4 factor de transcrição específico activa a expressão de crescimento de fibroblastos factor de 4 a expressão do gene e estabiliza boxe responsável por não limitativo reduplicação ADN em células imaturas. As proteínas marcantes intracelulares mais importantes são Oct3, Oct4, Tcf e Groucho, que estão relacionadas às proteínas do silenciador de cromatina.

Quase imediatamente após os CES cultivadas tentativas de longo prazo é vencida e o organismo foi preparado pela primeira vez por cultura de células estaminais isolado a partir de blastócitos de ratinho, e cultura de células germinativas primário, começou fase estudos de capacidade CES pluripotência quando administrada nas primeiras fases do desenvolvimento embrionário. Foi demonstrado que, no estágio de morula e blastocistos, os ESCs podem formar embriões quiméricos em que os descendentes de ESCs doador são detectados em todos os tecidos somáticos e até mesmo em gametas. Assim, uma "ponte" entre estudos experimentais in vivo e in vitro foi estabelecida em biologia do desenvolvimento com a ajuda de ESCs, o que expandiu consideravelmente as possibilidades de estudar os processos de colocação de tecidos e órgãos primários, sua diferenciação e organogênese embrionária.

Está claramente estabelecido que in vivo no processo de embriogênese, os ESCs são integrados na massa inicial de células germinativas e seus derivados são encontrados em todos os órgãos e tecidos. Os ESCs colonizam no embrião quimérico uma linha das células do sexo, cujos descendentes formam óvulos e espermatozóides de pleno direito. As células estaminais embrionárias são clonogénico - PGCs individuais podem criar geneticamente idêntica a uma colónia de células com marcadores moleculares, que incluem expressão do gene Oct4 e fosfatase alcalina, a actividade elevada de telomerase, bem como a expressão de antigénios específicos embrionárias.

Para estudar os mecanismos de embriogénese, utilizando a técnica de hESCs quimerizao mórula através da criação de uma estrutura biológica, que está localizado do lado de fora da camada de blastómeros tetraplóides receptoras e dadoras PGCs são administrados em. Assim, trofoblasto formado a partir de descendentes tetraplóide blastómeros destinatário que permite implantação e placentação, e as PGC dadoras que actuam como a massa celular interna, que é formado a partir de uma linha germinativa vivel do corpo e progenitoras primárias gâmetas. O valor de pesquisa do ESC não é apenas quando se manipula in vitro com o seu genoma, preserva-se a pluripotência, mas também é preservada a capacidade de ESC para participar da formação de células sexuais primárias do feto quimérico. Mostra-se que os descendentes de apenas um ESC geneticamente modificado estão preenchendo todos os rudimentos primários e os tecidos emergentes de um embrião quimérico obtido por agregação ou co-cultivo desta célula com um embrião de 8 células. Quando transplantados para a morula de camundongos ESC transfectados com o gene da proteína fluorescente verde, os descendentes fluorescentes desta célula foram encontrados em todos os tecidos de teste do embrião em desenvolvimento (Shimada, 1999). O transplante de ESC para o morula permite a criação de camundongos viáveis, cujo corpo é constituído apenas por descendentes do ESC dos doadores, o que abre perspectivas para várias opções de clonagem terapêutica. Agora, esta abordagem metódica é usada com sucesso para estudar os problemas da biologia do desenvolvimento, em particular, analisa os mecanismos de inativação genética do cromossomo X ou a instabilidade epigenética do ESC. O transplante de ESC para o embrião precoce também é utilizado na biotecnologia na agricultura, bem como em experimentos de terapia genética.

Os transplantes de ESC geneticamente modificados são usados para testar as células alvo de genes mutantes. Os cultivos de cultivos in vitro são utilizados na biotecnologia para criar camundongos knockout. Para fazer isso, por recombinação homóloga, o gene a ser examinado é removido do ESC e as células que faltam este gene são isoladas em meios seletivos. Em seguida, os ESCs knockout são injetados no blastocisto ou agregados com blastômeros de morula. Os embriões precoce quiméricos assim obtidos foram transplantados para receptores femininos e nos camundongos recém nascidos, indivíduos com gâmetas, nuiltzigotous para o gene, foram selecionados. Com esta tecnologia, foram criadas muitas linhas de ratos knockout, que são amplamente utilizados em biologia experimental e medicina experimental. Em tais modelos biológicos, estuda-se a importância de certos genes no desenvolvimento embrionário, bem como seu papel nos mecanismos de doenças e condições patológicas do homem. Além disso, as linhas de animais knockout são usadas na fase de teste pré-clínico de novos métodos de terapia genética. Por exemplo, por transfecção no genoma ESC de um alelo normal de um gene mutante, é possível corrigir efetivamente uma mutação que danifica o sistema de hematopoiese. A introdução de genes alienígenas no ESC permite a criação de linhas de animais de laboratório transgênico homozigotos a uma taxa acelerada. No entanto, deve notar-se que a técnica de remoção de genes de recombinação direta foi estabelecida de forma confiável, pelo tempo, apenas em relação ao ESC de camundongos. Usando CES murino duplo knockout instalado agrupamento funcional papel área de genes no cromossoma 7 (cópia região genómica cromossoma humano 19 minutos), e a porção proximal do cromossoma 11 (de cópias do cromossoma humano 5d) - eliminação destes genes em Os ratos ESK permitiram avaliar a função de seus análogos em seres humanos.

Os estudos de função a capacidade de genes embrionárias humanas, transfeco no gene que animais de laboratório permitiram hESCs em particular cripto esclarecer o papel do gene na guia e que formam o gene da mesoderme cardiogénico, pax-6 - na embriogénese olho. São confirmados os primeiros mapas de expressão gênica em teratocarcinomas e blastocistos de ESK proliferantes imaturos, de camundongos, repressão supressiva em ESC de genes de transsignação. A combinação dos CES mutantes 60-80 e 20-30 células de embriões de murganhos normais pré-implantação leva ao desenvolvimento de embriões quiméricos em que bookmarks corpos são feitos de células dadoras e receptoras que nos permite determinar o papel dos genes desconhecidos em gastrulação e organogénese. Mapa funcional de genes de desenvolvimento de embriões de ratinho detalhes ampliados da função do gene guia SF-1 na glândula adrenal e primórdios genital, em peso 1-gene - nos rins genes familiares guia MyoD - no separador da família do gene do músculo esquelético do GATA-1-4 - na maturação restrição rudimentos de eritro e linfopoiese.

Dirigido fora de alelos maternos e paternos de genes em hESCs utilizando vector de recombinase serviu para clarificar as funções de vários genes durante o desenvolvimento embrionário precoce e tecnologia de segmentação de genes desconhecidos humanos em CES rato contribuir para a descoberta de novos genes mutantes responsáveis pelo desenvolvimento de doenças hereditárias graves. Usando o método nocaute definido significado obrigatório de alguns genes para o assentamento de tecidos embrionários: GATA-4 - para enfarte, GATA-1 - a eritróides hematopoiético tecido, myoD - músculo esquelético, brachyury - para restrição mesoderme transcriptases hnf3 e HNF4 - para células-tronco do fígado, rag-2 - para a colocação de clones de linfócitos T e B (Repin, 2001). A deleção dupla de genes no ESC abriu o acesso ao estudo do papel funcional dos genes do germoplasma, segmentação e homeostasia e o transplante de ESC possibilitou a obtenção de embriões / híbridos interespecíficos viáveis. Utilizando a técnica melhorada de transplante de um ESC de dador único para o embrião de 8 células, o fato da quimerização no nível celular de muitos órgãos do embrião-receptor foi provado. Note-se que germes celulares de tecido humano são encontrados nos órgãos de camundongos receptores e após a introdução de células estaminais hematopoiéticas humanas no blastocisto. Foi estabelecido que os ESC pluripotentes circulam em embriões murinos durante o período de formação de órgãos no sangue. É possível que sua função biológica esteja na organização embrionária do futuro sistema imunológico. Com CES reproduzida in vitro modelos adequados de doença genética humana: gene da distrofina duplo knockout modelos em ratos de distrofia muscular de Duchenne, gene desligamento atm (de controlo do sinal de síntese quinase cromatina) - ataxia-teleangektaziyu. Nesta doença hereditária fatal em crianças devido a defeitos no reparo do DNA, desenvolve-se a degeneração de células de Purkinje no cerebelo, que é acompanhada por uma involução do timo devido à morte de células em proliferação. A clínica, a fisiopatologia e a patomorfologia da ataxia-telangiectasia, reproduzidas pela introdução de informação genética patológica no ESC, em camundongos quimera correspondem aos humanos. Além disso ataxia-teleangektazii usando PGC e ratinhos knockout desenvolvido modelo experimental, algumas doenças humanas homozigóticos hereditárias associadas com desordens de hidratos de carbono e metabolismo lipídico, o catabolismo de ácidos aminados, a remoção do cobre e bilirrubina, que aumentou significativamente a possibilidade da medicina experimental para testes pré-clínicos de novos métodos para o tratamento de doenças relevantes direitos.

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O uso de células-tronco cito-híbridas

As células híbridas obtidas por fusão de ESC com células somáticas são um modelo adequado e promissor para estudar a pluripotência de células-tronco e reprogramando cromossomos de células diferenciadas. Tsitogibridy obtida através da fusão de ESC com células diferenciadas do animal adulto, proporcionar uma oportunidade para estudar a relação entre os genomas de diferentes "idades": desenvolve uma situação original, onde os cromossomas homogos derivados a partir de células de vários estágios de diferenciação, e diferentes graus de maturidade, estão no mesmo núcleo, onde eles podem facilmente para trocar sinais regulatórios transitórios. É difícil prever como os sistemas epigenéticos cisregulatórios de cromossomos homólogos que se desenvolveram durante o curso do in vivo desenvolvimento dividual, em resposta aos sinais de transdeystvuyuschih impacto a partir de genomas relacionados embrionárias. Além disso, nas células híbridas ocorre segregação do cromossoma parental que permite estudar a interacção dos genomas ao nível do cromossoma separado, ou seja, potencialmente identificar a parte de cromossomas específicos na manutenção da pluripotência, ou pelo contrário, uma saída em diferenciação.

Como o primeiro modelo experimental para estudar a interação de genomas com diferentes "história de desenvolvimento", foram utilizados citohíbridos obtidos pela fusão de teratocarcinoma pluripotente e células somáticas diferenciadas. Em alguns casos, tais células híbridas conservaram propriedades pluripotentes em um nível suficientemente alto. Em particular, as células híbridas teratocarcinoma-somáticas in vivo induziram o desenvolvimento de teratomas verdadeiros contendo os derivados das três folhas germinativas e os corpos embrióides in vitro foram formados nas culturas em suspensão. Mesmo em citohíbridos interespecíficos desse tipo, foram observados antígenos embrionários nos casos em que parceiros somáticos na fusão com células de teratocarcinoma tinham linfócitos ou timócitos. Vale ressaltar que os cito-híbridos criados pela fusão de células de teratocarcinoma com fibroblastos correspondem a fibroblastos de acordo com o fenótipo.

O fato mais importante estabelecido é que, nas células híbridas teratocarcinoma-somáticas, apareceram sinais de reprogramação do genoma de células diferenciadas, caracterizadas pela reativação de genes individuais ou por um cromossomo X inativo do parceiro somático. Assim, os resultados dos estudos sobre cito-híbridos, como as células somatocarcinoma-somáticas, indicam que as células híbridas geralmente mantêm a pluripotência e há sinais de reprogramação do genoma do parceiro somático.

Nos experimentos de obtenção de células híbridas embrionárias intraespecíficas por fusão de ESK de ratinho com esplenócitos de um animal adulto, as características desses citocídidos foram estudadas, a segregação de cromossomos parentais foi analisada e a pluripotência do genoma híbrido foi estimada. Para células híbridas intraespecíficas obtidas a partir da fusão de células de teratocarcinoma com células somáticas, um baixo nível de segregação de cromossomos com um cariotipo tetraploide ou quase tetraploide é típico. Uma composição cromossômica semelhante foi observada no cito-híbrido pela fusão de células sexuais primárias com linfócitos. Ao mesmo tempo, células híbridas interespecíficas obtidas como resultado da fusão de células de teratocarcinoma de mouse com linfócitos de mink, marcaram a segregação cromossômica intensiva do parceiro somático.

Um qualitativamente nova etapa no estudo da segregação de cromossomas parentais em híbridos inter veio após o desenvolvimento do método de análise de microssatélites por utilização da reacção em cadeia de polimerase, pelo que cada cromossoma do rato encontrado algumas centenas de marcadores, permitindo discriminar com fiabilidade entre qualquer par de cromossomas homólogos nas células híbridas.

Ao fundir ESK (usando células HM-1 deficientes em actividade de gipoksantinfosforiboziltransferazy, 2n = 40, XY, isolado a partir da estirpe blastocistos de ratinho 129 / 01a) com esplenócitos de ratinhos linha congénica DD / c não conseguiu receber o conjunto de clones híbridos morfologicamente tinha semelhança com hESCs. Todos os clones foram isolados em um meio seletivo em que somente células com hipoxantina fosforibosiltransferase ativa podem crescer. A análise eletroforética mostrou a presença em todos os clones de uma variante alélica de hipoxantina fosforibosiltransferase, característica dos camundongos DD / c. Com a análise citogenética, verificou-se que dos quatro clones híbridos, três tinham um conjunto de cromossomos quase diploides. Um clone quase tetraplóide continha duas populações de células híbridas, uma das quais era tetraploid, e a segunda, a menor, diploide.

Análise de microssatélites permitindo discriminar qualquer par de cromossomas homogos de ratinho 129 / 01a e DD / C, nos clones híbridos com okolodiploidnym conjunto mostrou que os clones ocorreu em dois eliminação preferencial parceiro somática autossomas distinta. A maioria dos autosomas nos clones HESS2 e HESS3 apresentava marcadores da linha 129 / 01a, ou seja, um parceiro pluripotente. As únicas exceções foram os cromossomos 1 e I: os clones de HESS2 e HESS3, juntamente com marcadores de células HM-1, continham um pequeno número de marcadores do parceiro somático. Estes resultados podem reflectir segregação incompleto de cromossomas 1 e parceiro e somática e são consistentes com os dados citogenéticos que trissomia de cromossomas que ocorre em 30-40% HESS2 e clones de células HESS3. Clone HESS4 diferiram significativamente na composição cromossómica: muitos autossomas Este clone originados a partir do genoma ESK (cromossomas 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14 e 17), mas os cromossomas 1, 9, 11, 12, 15, 16, 18 e 19 foram representados por homólogos de ambos os pais. A proporção quantitativa de microsatélites rotulando esses cromossomos homólogos corresponde aproximadamente a 1: 1. Isso permitiu que os autores assumissem que um homólogo é derivado do genoma do ESC e o outro das células diferenciadas. Em alguns subclones do clone HESS4, apenas os marcadores cromossômicos 18 e 19 do parceiro somático estavam presentes. Os resultados indicam que as células clonar HESS4, em adição à segregação de cromossomas parceiro somática, houve a eliminação de um ou ambos os homólogos do genoma pluripotentes acima cromossoma, isto é, houve uma segregação de dois lados de cromossomas de ambos os pais - o fenómeno é bastante invulgar, porque tsitogibridov segregação característica de cromossomas única um dos pais.

Além disso, após a 20ª passagem, todos os clones de células híbridas continham exclusivamente marcadores de cromossomo X do parceiro somático, isto é, nos clones, o cromossomo X de ESC foi substituído pelo cromossomo X do parceiro somático. Isto é confirmado por dados de hibridação in situ usando uma sonda marcada com FITC específica para o cromossomo X do mouse: um sinal positivo foi detectado apenas em um cromossomo. Deve-se notar que em estágios iniciais de cultivo (até a 15ª passagem), de acordo com dados citogenéticos, em muitas células havia dois cromossomos X. Conseqüentemente, o uso de meios seletivos possibilita a manipulação da composição cromossômica de células híbridas e seletivamente alvo de clones que transportam cromossomos únicos do parceiro somático no contexto do genoma ESC.

Uma vez que a característica única do genoma cito-híbrido é a localização dos genomas parentais em um núcleo, naturalmente, surge a questão de preservar as propriedades pluripotentes do genoma embrionário em híbridos celulares ESC-somáticos em condições de seu contato próximo com o genoma da célula diferenciada. Morfologicamente, o cito-híbrido de ESC e células somáticas se assemelhava à linha parental do ESC. A avaliação da pluripotência mostrou que todos os clones com um conjunto de cromossomos quase diploides foram capazes de formar corpos de embrioides em culturas em suspensão em que estavam presentes derivados de três folhas germinais.

A maioria das células híbridas continha o antígeno ECMA-7, um marcador característico dos primeiros embriões de rato, e também tinha uma alta atividade de fosfatase alcalina. Os dados mais convincentes sobre as altas propriedades pluripotentes de células híbridas foram obtidos em experimentos para obter uma série de quimeras de injeção envolvendo células híbridas do clone HESS2. A análise de marcadores bioquímicos mostrou que os descendentes de células híbridas dadoras estavam na maioria dos tecidos quiméricos. Portanto, as células híbridas obtidas por fusão de ESC e células diferenciadas somáticas mantêm a pluripotência em um nível alto, incluindo a capacidade de formar quimeras quando inseridas na cavidade do blastocisto.

Os clones HESS2 e HESS4 diferiram significativamente na composição dos cromossomos originais, mas tiveram propriedades pluripotentes semelhantes. Pode-se acreditar que a pluripotência no genoma híbrido se manifesta como uma característica dominante, mas é possível que nem todos os cromossomos do genoma embrionário estejam envolvidos no processo de manter a pluripotência. Se esta suposição for correta, pode-se esperar que a eliminação de alguns cromossomos do parceiro pluripotente do genoma do hibridoma não seja acompanhada por uma mudança no seu estado pluripotente. Neste caso, a análise da segregação de cromossomos parentais em células híbridas embrionárias possibilitaria a aproximação próxima da identificação de cromossomos responsáveis pelo controle da pluripotência de células embrionárias.

O. Serov e os co-autores (2001) não encontraram entre 50 descendentes obtidos atravessando quimeras com camundongos normais, como teria o genótipo dos ratos 129 / 01a e carregando o cromossomo X de camundongos DD. Os autores vêem o motivo disso na redução da pluripotência em células híbridas sob a influência do genoma somático. Uma explicação alternativa pode ser o efeito negativo da trissomia em alguns autosomas e desequilíbrios nos cromossomos sexuais (XXY foram observados nas células até a 15ª passagem) em células híbridas quando passaram pela meiose. Sabe-se que células de XXY não podem passar pela meiose e formar gametas. A trissomia também é capaz de causar uma diminuição na atividade proliferativa de células híbridas, pelo que a vantagem seletiva no desenvolvimento de quimeras pode pertencer às células do embrião receptor. Segue-se que, para avaliar adequadamente o potencial pluripotente das células híbridas, é necessário obter clones híbridos com um conjunto diploide normal de cromossomos.

Nas experiências de O. Serov e co-autores (2001), a possibilidade de reprogramar o cromossomo X de uma célula somática no genoma das células híbridas foi demonstrada pela primeira vez. Esta conclusão resulta de uma análise da expressão do gene hprt (marcador de cromossomo X) em quimeras: a presença de variante alélica de camundongos hdt de DD / c foi detectada em todos os tecidos quiméricos analisados. Deve ser enfatizado que, após a introdução de células híbridas na cavidade blastocisto tsitogibridy caem em condições não-selectivas e a preservação do cromossoma X no genoma das células híbridas significa que tornou-se um componente obrigatório do seu genoma e não discrimina-lo do Y parceiro cromossoma pluripotentes.

Resumindo os resultados da análise da interação de genomas somáticos e pluripotentes em células embrionárias híbridas, os autores concluem que, em alguns citocíbridos, a pluripotência se manifesta como uma característica dominante. Um genoma híbrido é capaz de reprogramar cromossomos individuais de células diferenciadas, o que, no entanto, não exclui a possibilidade do efeito reverso do genoma somático na pluripotência do genoma embrionário. No cultivo de células híbridas, a indução de diferenciação ocorre muito mais frequentemente do que na linha original do ESC NM-1. Um efeito semelhante é observado na formação de colônias primárias: muitas colônias primárias de células híbridas embrionárias se diferenciam nos estágios iniciais da formação com grandes perdas de clones durante sua seleção e multiplicação.

Assim, as citohíbridas criadas pela fusão de ESC com células somáticas, apesar do contato próximo com o genoma de células diferenciadas, preservam a pluripotência como uma propriedade única do genoma embrionário. Além disso, em tais células híbridas, é possível reprogramar os cromossomos individuais provenientes das células difusas. Ainda não está claro o quão completa são as propriedades pluripotentes do genoma embrionário em células híbridas, em particular, sua capacidade de participar da formação da via embrionária em quimeras. Para isso, é necessário obter células embrionárias híbridas com um cariotipo normal. Em qualquer caso, as células híbridas embrionárias pluripotentes podem se tornar um modelo genético real para a identificação de cromossomos envolvidos na manutenção da pluripotência ou seu controle, uma vez que a segregação em dois lados dos cromossomos parentes potencialmente oferece essa oportunidade.

Não menos atraente é o estudo do fenômeno, que O. Serov e co-autores (2001) definem como "memória cromossômica". Em um genoma híbrido, os cromossomos homólogos estão em duas configurações alternativas: os homólogos do parceiro somático já foram diferenciados, enquanto nos homólogos do parceiro pluripotente, esse processo está apenas começando. Conseqüentemente, a persistência de altas propriedades pluripotentes por células híbridas sugere que a configuração "pluripotente" dos homólogos ESC é bastante estável no genoma híbrido, apesar da influência dos fatores transmissores provenientes do parceiro somático. Os sinais acima descritos de reprogramação de cromossomos homólogos de um genoma diferenciado no desenvolvimento de quimeras não excluem o fato de que nos primeiros estágios da formação e cultivo de citohíbridos in vitro mantêm seu status adquirido durante a diferenciação in vivo. De acordo com dados recentemente obtidos, quando as células híbridas embrionárias são transferidas para um meio não seletivo, observa-se a eliminação intensiva de cromossomos do único parceiro somático, ou seja, o genoma celular híbrido discrimina facilmente homólogos após cultura in vitro para 10-15 passagens. Assim, as células híbridas embrionárias representam um modelo experimental promissor para estudar não apenas uma propriedade fundamental do genoma embrionário como a pluripotência, mas também suas alternativas - diferenciação embrionária.

Eficácia terapêutica do transplante de células estaminais embrionárias

Antes de analisar a eficácia terapêutica do transplante ESC e seus derivados, resumimos o material acima. O potencial do ESC em termos de implementação completa da embriogênese in vitro é inadequado, uma vez que os defeitos de desenvolvimento neste caso são devidos à ausência de células estaminais mesenquimais, que no corpo surgem de forma autônoma e independente do ESC. A potência genética do ESC é menor do que o potencial genético do zigoto, portanto não é diretamente usado para a clonagem de embriões. O potencial biológico exclusivo do ESC como as únicas células em que os programas de desenvolvimento são implantados em plena sucessão é encontrado em estudos sobre a função dos genes. Com a ajuda do ESC, as primeiras combinações de sinais que ativam a expressão de genes iniciais e tardios que codificam o desenvolvimento de três folhas embrionárias são decifradas. A preservação da pluripotência do genoma ESC in vitro os torna uma ferramenta única para a regeneração reparadora, capaz de reabastecer as perdas celulares de danos nos órgãos e nos tecidos. Numa concretização ideal hipotética pode assumir que "... No transplante de PGCs doadores no organismo receptor são transferidos programas compactamente embalados que em condições favoráveis são realizados na construção de novas tkani'7 capaz" ... Efetivamente integrado no corpo do receptor como morfológica, funcionais e funcionais ".

Naturalmente, seguindo o desenvolvimento de métodos de monodifferenciação de ESC, iniciou-se o estudo in vivo da atividade funcional de células obtidas in vitro a partir de um único clone especializado. O clone ESO em proliferação gera populações de células progenitoras migratórias que são realmente capazes de se integrar ativamente nas zonas de danos nos tecidos do receptor, que é usada na medicina de plástico regenerativo. Foi estabelecido que o transplante de neurônios de Dopa em substância negra reduz as manifestações clínicas no hemiparkinsonismo experimental. Os transplantes regionais de células-tronco neurais doadoras reduzem o grau de distúrbios motores causados por trauma ou contusão da medula espinhal e do cérebro. Recebidos e os primeiros resultados positivos do transplante de células-tronco em doenças desmielinizantes. Parece que as potências plasmáticas regenerativas dos ESCs abrem possibilidades ilimitadas para o uso do transplante celular em medicina prática. No entanto, quando se transplante para zonas ectópicas, os ESCs inevitavelmente se transformam em tumores. Quando a injeção subcutânea de ESC em teratomas de camundongos imunodeficientes é formada. Quando a suspensão de ESK é transplantada sob a cápsula do testículo em camundongos singênicos, também é formado um teratoma formado por diferentes tecidos, cujas células são derivadas dos três folhetos embrionários. Em tais teratomas, os processos de organogênese reduzida são extremamente raros.

Uma série de trabalhos fornece informações sobre os resultados positivos do transplante de derivados iniciais de ESCOs para animais com uma patologia experimental. O desenvolvimento de neurotransplantes celulares utilizando derivados de ESC é desenvolvido no experimento e os primeiros ensaios clínicos para corrigir distúrbios funcionais em lesões cerebrais e espinhais, tratamento de siringomielia e esclerose múltipla (Repin, 2001). Com o advento da técnica de neuronogênese de ESK in vitro, em vez de usar tecido cerebral embrionário, estão sendo desenvolvidos métodos de transplante de derivados de neuroesferas derivadas de culturas de tecido nervoso embrionário. Tais suspensões de transplante são muito mais homogêneas e contêm precursores neuronais e neuroglia comprometidos.

Com a adição regular de ácido retinóico ao meio de cultura a uma dose de 10 μg / ml durante 6 semanas, mais de 80% dos neurônios pós-mitóticos são formados na linha embrionária (carcinoma de terato) da NTERA-2 humana. A homogeneidade completa da população neuronal é conseguida através da classificação de fluxo de marcadores imunofenotípicos marcados por neurônios maduros, o que permite livrar-se dos restos de teratocarcinoma e células imaturas. Após o transplante para várias regiões do cérebro de animais experimentais, esses neurônios não apenas sobrevêm, mas também são incorporados nas redes neurais regionais. Em animais com modelos experimentais de defeitos locais do SNC neurotransplantação reduz manifestações clínicas da patologia humana, tais como os efeitos de trauma craniocerebral, acidente vascular cerebral, doenças desmielinizantes, defeitos de desenvolvimento do cerebelo hereditárias, doenças deposição de lípidos e polissacáridos.

Para otimizar os processos de regeneração em doenças degenerativas do sistema nervoso central, estão sendo desenvolvidas tecnologias para a preparação de oligodendrócitos produtores de mielina da ESK. A primeira etapa tradicionalmente envolve a proliferação de ESCs com a multiplicação do número de células necessárias para o transplante. No segundo estágio, é realizada a diferenciação direcionada de células em uma população de precursores de oligodendrócitos produtores de mielina, que é controlada por antígenos marcadores seletivos.

São abertas certas perspectivas para o uso de derivados ESK, a fim de desenvolver métodos para corrigir imunodeficiências causadas por defeitos genéticos na maturação do timo. Em estudos em nocaute (pano 1) ratos com defeito genético induzido - violação mecanismo de recombinação V (D) loci do gene J de TCR, conduzindo à perda da função de linfócitos T, de transplantação primeiros derivados de PGC no timo dos animais recupera maturação de populações normais de clones imunes responsáveis pela imunidade celular. São realizados ensaios clínicos de transplante de ESK pré-formado in vitro para o tratamento de anemia hereditária fatal em crianças.

As objeções à rápida introdução do transplante de células-tronco na clínica são justificadas por um número limitado de linhas estáveis de células estaminais embrionárias humanas e a necessidade de sua padronização. Para aumentar a pureza das linhas ESC padronizadas, bem como as células estaminais adultas, propõe-se utilizar o método de seleção de linha com base na análise genética molecular de repetições em tandem curtas de DNA. Também é necessário verificar as linhas ESC para a presença de pequenos rearranjos cromossômicos e mutações genéticas, a possibilidade potencial de ocorrência sob condições de cultivo celular é suficientemente alta. A tese sobre o teste obrigatório de propriedades de todos os tipos de ESC e células-tronco pluripotentes regionais é avançada, uma vez que a sua reprodução in vitro pode levar à aparência de novas características não inerentes às células estaminais do embrião ou tecidos definitivos. Em particular, é permitido que o cultivo prolongado em meios de citocinas se aproxime de linhas ESK para células tumorais, uma vez que ocorrem alterações semelhantes nas formas de regulação dos ciclos celulares com a aquisição da capacidade de realizar um número ilimitado de divisões celulares. Alguns autores, com base no potencial para o desenvolvimento de tumores, consideram o transplante humano de derivados iniciais de células estaminais embrionárias como imprudência. Na sua opinião, é muito mais seguro usar os descendentes comprometidos do ESC, ou seja, as linhas dos antepassados das células diferenciadas. No entanto, uma técnica confiável para a obtenção de linhas de células humanas estáveis que se diferenciam na direção certa ainda não foi desenvolvida.

Assim, na literatura há mais e mais dados sobre o efeito terapêutico positivo do transplante de derivados de células estaminais embrionárias humanas. No entanto, muitos desses trabalhos estão sujeitos a revisão e crítica. Alguns pesquisadores acreditam que os resultados dos primeiros ensaios clínicos são preliminares e sugerem apenas que as células estaminais podem ter um efeito benéfico no curso clínico de uma doença. Portanto, é necessário obter dados sobre os resultados a longo prazo do transplante de células. Como argumento, os estágios de desenvolvimento da neurotransplantologia clínica são dados. De fato, na literatura, as publicações sobre a alta eficiência de transplante de fragmentos cerebrais de embriões na doença de Parkinson inicialmente prevaleciam, mas os relatórios começaram a aparecer que negavam a eficácia terapêutica do tecido nervoso embrionário ou fetal transplantado para o cérebro dos pacientes.

Os primeiros ensaios clínicos foram conduzidos para avaliar a segurança do transplante de neuroblastos - os derivados ESK derivados de teratocarcinoma NTERA-2, cujas células imaturas sofreu proliferação em cultura antes do acúmulo de 100 milhões de massas celulares. Algumas das células assim obtidas foram utilizadas para caracterizar o fenótipo e determinar as impurezas das células, bem como para testar a possível contaminação por vírus e bactérias. LIF e a camada de alimentação de células fetais do estroma foram removidas do meio de cultura e foram criadas condições para a diferenciação direta de ESC em neuroblastos por uma combinação de citocinas e fatores de crescimento. Então, os neuroblastos foram purificados a partir de células de teratocarcinoma imaturo em um classificador de gaiola de fluxo. Após a segunda purificação e caracterização do fenótipo de neuroblastos células transplantadas (10-12 milhões) suspensão utilizando uma seringa e microcânulas estereotaxia especial e sob o controlo de CT injectado no núcleo basal do cérebro de pacientes (o sétimo mês após acidente vascular cerebral hemorrágico). O pós-transplante de um ano de triagem das conseqüências do transplante neuronal na zona do acidente vascular cerebral não apresentou efeitos colaterais e efeitos indesejáveis. Metade dos pacientes experimentou uma melhora na função motora no período de 6 a 12 meses após o transplante. As alterações clínicas positivas foram acompanhadas pelo aumento do suprimento de sangue na zona do acidente vascular cerebral após o transplante de células: o aumento médio da absorção de 2-desoxiglucose marcada de forma fluorescente, de acordo com a tomografia por emissão de positrões, atingiu 18% e em pacientes individuais - 35%.

No entanto, o Instituto Nacional de Saúde dos EUA realizou um estudo independente sobre a eficácia clínica do neurotransplante em pacientes com Parkinsonismo. Os pacientes do primeiro grupo foram transplantados com tecido nervoso embrionário produzindo dopamina, enquanto o segundo grupo de pacientes estava passando por uma operação falsa. Os resultados indicam uma eficácia clínica zero desse neurotransplante, apesar do fato de que os neurônios embrionários produtores de dopamina sobreviveram no cérebro dos receptores. Além disso, em 2 anos após o transplante de tecido nervoso embrionário, 15% dos pacientes desenvolveram discinesia persistente, que estava ausente em pacientes do grupo placebo (células-tronco: progresso científico e futuras tendências de pesquisa, Nat. Inst., Of Health. EUA). As observações sobre o desenvolvimento da doença nesses pacientes continuam.

Alguns autores atribuem a literatura contraditórios sobre a avaliação de dados eficácia neurotransplantação clínicos com uma abordagem diferente para a selecção dos grupos de pacientes, a escolha inadequada de métodos objectivas para avaliar a sua condição e, mais importante ainda, os diferentes termos do desenvolvimento do tecido nervoso fetal e em diferentes partes do cérebro a partir da qual o tecido foi produzido em tamanhos diferentes transplante e características metódicas da cirurgia.

Deve-se notar que as tentativas de transplantar diretamente células embrionárias de caule pluripotentes para o corpo estriado de cérebro de rato com hemiparkinsonismo experimental foram acompanhadas pela proliferação de ESC e sua diferenciação em neurônios dopaminérgicos. Deve-se supor que os neurônios recém-formados fossem efetivamente integrados em redes neuronais, uma vez que após o transplante de ESC observou-se a correção de anomalias comportamentais e assimetria motora no teste de apomorfina. Ao mesmo tempo, alguns dos animais morreram devido à transformação do ESK transplantado no tumor cerebral.

Especialistas da Academia Nacional e Medicina dos Estados Unidos, especialistas dos Institutos Nacionais de Saúde acredita que o potencial clínico de hESCs merece séria atenção, no entanto, insistem sobre a necessidade de um estudo detalhado das suas propriedades, a probabilidade de complicações e efeitos a longo prazo em experimentos com modelos biológicos adequados de doenças humanas (Células-tronco eo futuro medicamento regenerativo National Academy Press, células-tronco e as futuras orientações de pesquisa, Nat. Inst, de Health USA).

A partir deste ponto de vista, é importante que a análise histológica comparativa de teratoma experimental obtida por transplante em PGC de lamas testículo com teratomas que tenham desenvolvido devido a transplante de embrião precoce, que incluíram também presente CES mostrou que ESK, independentemente da sua origem ou interacção com por essas ou outras células circundantes, da mesma forma, realizam suas potências tumorigênicas. Verificou-se que tais teratomas são de origem clonal, uma vez que os tumores que consistem nos derivados dos três folhetos embrionários podem surgir de um ESC. (Peera, 2001). Vale ressaltar que ao transplantar camundongos imunodeficientes clonaram ESK com um cariotipo normal, também foram formados teratomas formados por diferentes tipos de células somáticas diferenciadas. Esses dados experimentais são a prova perfeita da origem clonal do teratoma. Do ponto de vista da biologia do desenvolvimento, eles indicam que não múltiplas células precursoras comprometidas, mas uma única célula-tronco pluripotente, atua como fonte de derivados diferenciados das três folhas embrionárias que constituem teratoma. No entanto, nos resultados práticos transplante de células destes estudos são, se não proibitivo, em seguida, um sinal de aviso de perigo potencial, uma vez que CES inoculação ou células germinativas primordiais em diferentes tecidos de ratos imunodeficientes adultos, inevitavelmente, provoca o desenvolvimento de tumores a partir das células transplantadas. A degeneração neoplásica de ESCs transplantados ectopicamente é acompanhada pelo surgimento de populações satélites de células diferenciadas - devido à diferenciação parcial de ESC e clones progenitores em linhas especializadas. Curiosamente, ao transplantar ESC nos músculos esqueléticos ao lado de células de teratocarcinoma, os neurônios são mais frequentemente formados. No entanto, a introdução de ESC em um óvulo esmagado ou blastocisto é acompanhada pela integração completa de células no embrião sem a formação de elementos neoplásicos. Neste caso, os ESCs são integrados praticamente a todos os órgãos e tecidos do embrião, incluindo o rudimento sexual. Tais animais alofênicos foram primeiro obtidos pela introdução das células do teratocarcinoma 129 em embriões precoce nos estádios de 8-100 células. Em allofennyh populações de ratos geterogenomnyh PGC dadoras derivadas de células são introduzidas em medula óssea, intestino, pele, fígado e genitais, que lhe permite criar no mesmo experimento quimeras celulares interespécies. Quanto menor o desenvolvimento do embrião inicial, maior a percentagem de quimerização celular, com o maior grau de quimerização observado no sistema hematopoiético, pele, sistema nervoso, fígado e intestino delgado do embrião alofano. No organismo adulto, o tecido quimerizao passíveis protegidos da exposição ao sistema imune das barreiras destinatário gistogematicalkie: culas germinais primordiais de transplante no parênquima testículo acompanhada por inserção de células-tronco do doador no receptor camada germenativny tecido. No entanto, com o transplante de ESC para o blastocisto, a formação de rudimentos quiméricos dos órgãos genitais com a geração de células sexuais primárias do doador não ocorre. CES pluripotência ao criar condições especiais e pode ser utilizado para a clonagem: CES ratinhos transplante 16/08 de células de embrião de ratinho, em que a mitose celular tsitokalazinom bloqueado, contribui para a embriogénese normal com o desenvolvimento do embrião as PGC dadoras.

Por conseguinte, uma alternativa é o transplante alogico de clonagem terapêutica CES baseada em transplante de núcleos de células somáticas num oócito enucleado para criar uma massa celular interior de blastocistos de que são então atribuídos linha de PGC dadoras geneticamente idênticos núcleo somático. Tecnicamente, essa idéia é bastante viável, uma vez que a possibilidade de criar linhas de ESK a partir de blastocistos obtidos após o transplante de núcleos somáticos em ovos enucleados tem sido repetidamente comprovada em experiências com animais de laboratório (Nagy, 1990, Munsie, 2000). Em particular, em caminhos homozigotos para a mutação do gene rag2, foram utilizados fibroblastos obtidos pela cultura de células do tecido subepidérmico como doadores de núcleos que foram transplantados para oócitos enucleados. Após a ativação dos oócitos, o cigoto foi cultivado para formar um blastocisto, a partir do qual a massa celular interna foi isolada por ESCs e transferida para a linha de Nullizygotes pelo gene celular mutante (rag2 ~ / ~). Por recombinação homóloga em tais ESCs, a mutação de um gene alélico foi corrigida. Na primeira série de experiências de hESCs gene recombinante recuperado foram preparados corpos embrióides, transfectadas células do mesmo com um retrovírus recombinante (HoxB4i / GFP) e depois de propagação em ratinhos injectados veia RAG2 ~ / ~. Na segunda série, os blastômeros tetraplóides foram agregados com ESC geneticamente modificados e transplantados para os receptores femininos. Os ratinhos imunocompetentes nascidos serviram como doadores de medula óssea para transplante para ratos mutantes rag2 ~ / ~. Em ambas as séries, o resultado foi positivo: em 3-4 semanas, verificou-se que todos os ratinhos maduros tinham células mieloides e linfóides normais capazes de produzir imunoglobulinas. Assim, o transplante para o oócito dos núcleos de células somáticas pode ser usado não só para obter linhas ESC, mas também para citogenoterapia - correção de anomalias hereditárias, utilizando o ESC como vetor para o transporte de informações genéticas corretivas. Mas nesta direção do transplante celular, além de problemas bioéticos, existem limitações. Não está claro como é seguro o transplante de células clonadas terapêuticas com um genótipo idêntico ao de um paciente particular, uma vez que tais células podem introduzir mutações que predispõem a outras doenças. Os óvulos humanos normais permanecem um objeto difícil de alcançar, enquanto que mesmo quando os núcleos somáticos são transplantados para animais de óvulos enucleados, apenas 15-25% dos "zigotos" construídos se desenvolvem no estágio de blastocisto. Não é determinado quanto o blastocisto é necessário para obter uma única linha de ESC clonados pluripotentes. Deve-se notar e alto nível de custos financeiros associados à complexidade da metodologia de clonagem terapêutica.

Em conclusão, no genoma pluripotência CES hipometiladas ADN é combinada com a actividade de telomerase e de alta fase C ^ ciclo celular curto, o que garante a multiplicação intensivo e potencialmente infinita, durante o qual as PGC reter cromossomas diplóide e "juvenil" conjunto de características fenotípicas. O crescimento clonal de ESC em cultura não impede sua diferenciação em qualquer linha celular especializada do organismo quando a proliferação pára e os sinais regulatórios correspondentes são adicionados. A diferenciação restritiva de ESC na linha de células somáticas in vitro é realizada sem a participação do mesênquima, ignorando Nokhteiov, organogênese externa e sem formação de embrião. A administração ectopica de ESC in vivo inevitavelmente leva à formação de teratocarcinomas. O transplante de ESC para o blastocisto ou embrião precoce é acompanhado por sua integração com os tecidos do embrião e a quimerização estável de seus órgãos.

As tecnologias de plástico regenerativo baseadas no transplante de células são o ponto de interseção dos interesses dos representantes da biologia celular, biologia do desenvolvimento, genética experimental, imunologia, neurologia, cardiologia, hematologia e muitos outros ramos da medicina experimental e prática. Os resultados experimentais mais importantes comprovar a possibilidade de reprogramar as células estaminais com a direcção de alteração das suas propriedades, o que abre perspectivas para o controlo de processos de citodiferenciao com factores de crescimento - para a regeneração do miocárdio, restauração de lesões do SNC e normalização das funções do aparelho de ilhotas do pâncreas. No entanto, para a ampla introdução do transplante de derivados de ESK em medicina prática, é necessário estudar mais detalhadamente as propriedades das células-tronco humanas e continuar experiências com ESC em modelos experimentais de doenças.

As questões bioéticas eo problema da rejeição de um transplante de células alogênicas podem ser resolvidos pela plasticidade revelada do genoma de células estaminais regionais de um organismo adulto. No entanto, a informação inicial é que quando o transplante do fígado células hematopoiéticas autólogas isoladas e completamente caracterizados, dos quais existem novas hepatócitos, incorporando na lóbulos hepáticos, estão agora a ser revista e criticado. No entanto, os dados publicados, que a transplantação de células estaminais neurais, no timo, é a formação de novos rebentos de T dadoras e B-linfócitos, e transplante de células estaminais neurais do cérebro na medula óssea conduz à formação de hematopoiético germe sustentada mielóide dador e eritropoiese . Conseqüentemente, nos órgãos de um organismo adulto, células-tronco pluripotentes capazes de reprogramar o genoma para o potencial de um ESC podem ser preservadas.

O embrião humano continua a ser a fonte de receber o ESC para fins médicos, que predetermina a inevitabilidade de uma nova interseção de problemas morais, éticos, morais, legais e religiosos no momento do nascimento da vida humana. A descoberta dos ESCs deu um poderoso impulso à retomada de discussões severas sobre a mentira da linha entre células vivas e matéria, substância e personalidade. Ao mesmo tempo, não existem normas, regras e leis universais sobre o uso de ESC em medicina, apesar das repetidas tentativas de criar e aceitá-las. Cada estado dentro de sua legislação resolve esse problema por conta própria. Por sua parte, médicos de todo o mundo continuam a tentar desenvolver a medicina plasmática regenerativa além dessas discussões, principalmente através do uso de células estaminais não embrionárias e as reservas de células-tronco de um organismo adulto.

Parte da história do isolamento de células-tronco embrionárias

Terato- células (embrião) foram isolados a partir de -kartsinomnye ocorrendo espontaneamente 129 células / ter-Sv, espontâneas ovarianos linhas de ratinhos teratomas Lt / Sv, e a partir de teratomas, ektopichno fonte foram transplantados ou tecidos embrionários do testículo, estirpe de ratinho teratomas. Entre as cepas murinas de células de carrapato de terato e embrião obtidas dessa maneira, algumas eram pluripotentes, outras eram diferenciadas apenas em células de um tipo particular, e algumas geralmente eram incapazes de citoferifação.

Ao mesmo tempo, a pesquisa centrou-se na possibilidade de retorno de células de terato-embrião-carcinoma para um fenótipo normal após a sua introdução no tecido embrionário em desenvolvimento, bem como no trabalho de criação in vitro de células de conto-carcinoma de embrião geneticamente modificado células, com a ajuda de quais camundongos mutantes foram obtidos para modelagem biológica de patologia hereditária humana.

O cultivo de suspensão condicionada foi utilizado para isolar as linhas de células de carrapato de terato e embrião. Em terato- cultura (embrião) -kartsinomnye células, como CES, crescer para formar corpos embrióides e necessitam de ser traduzido em um linha de dissociação ligação a manutenção da pluripotência sobre uma camada alimentadora de fibroblastos embrionários ou cultura de suspensão em meio condicionado. As células das linhas plato-embrionárias-carcinoma pluripotentes são grandes, esféricas, caracterizadas pela alta atividade da fosfatase alcalina, formam agregados e são capazes de diferenciar multidirecionalmente. Quando introduzidos no blastocisto, agregam-se com a morula, o que leva à formação de embriões quiméricos, na composição de vários órgãos e tecidos dos quais se encontram os derivados de células de carrapato de terato-embrião. No entanto, a maioria esmagadora de tais embriões quiméricos morrem no útero, e nos órgãos das quimeras recém-nascidas sobreviventes, as células estranhas são raramente detectadas e com baixa densidade. Ao mesmo tempo a incidência de tumores (fibrossarcoma, rabdomiossarcoma, e outros tipos de edema maligno e Pâncreas adenoma) aumenta consideravelmente, e degeneração neoplásica frequentemente ocorre mesmo no útero embriões quiméricos.

A maioria das células de carrapato de terato e embrião no microambiente de células embrionárias normais, naturalmente, adquirem características neoplásicas malignas. Acredita-se que a malignidade irreversível se deve à ativação de proto-oncogenes no processo de rearranjos estruturais. Uma exceção é a linha celular de embriocarcinoma SST3, derivada de testículos murinos (linha 129 / Sv-ter), que mostram uma alta capacidade de integração nos tecidos e órgãos do embrião sem a subsequente formação de tumores em camundongos quiméricos. Derivados de linhas de células de carbo-embrião terato-embrião em camundongos quiméricos praticamente não participam da formação de gonócitos primários. Obviamente, isso é devido à alta freqüência de aberrações cromossômicas características da maioria das linhas de carcinoma de terato (embrião), em células das quais aneuploidia e anormalidades cromossômicas são observadas.

No laboratório, foram obtidas várias linhas estáveis de carcinomas de embriões terato-humanos, caracterizados por pluripotência, atividade proliferativa elevada e a capacidade de se diferenciar com o crescimento em culturas. Em particular, a linha de células de terato-embrião-carcinoma humano NTERA-2 foi utilizada para estudar os mecanismos de cito-distingação neural. Após o transplante de células desta linha para a região subventricular do prosencéfalo de ratos recém nascidos, sua migração e neuronogênese foram observadas. Mesmo as tentativas foram feitas para transplantar os neurônios obtidos cultivando as células da linha NATOA-2 de terato-embrião-carcinoma, pacientes com AVC, que, de acordo com os autores, levaram a uma melhora no curso clínico da doença. Nesse caso, não foram observados casos de malignidade de células transplantadas da linha de carrapato de terato-embrião NTERA-2 em pacientes com AVC.

Evans e Martin receberam as primeiras linhas de células-tronco embrionárias pluripotentes indiferenciadas de camundongos no início dos anos 80 do século passado, isolando-as da massa celular interna do blastocisto, o embrião. As linhas ESC isoladas durante muito tempo preservaram a pluripotência e a capacidade de se diferenciar em diferentes tipos de células sob a influência de fatores de um meio de cultura especial.

O termo "célula estaminal pluripotente embrionário" pertence Leroy Stevens que a investigação de impacto alcatrão do tabaco sobre a frequência de desenvolvimento de tumor chamou a atenção para a ocorrência de teratocarcinoma testicular espontânea de linear (129 / v) de ratinhos do grupo de controlo. Células de teratocarcinoma testicular foram caracterizados por um índice de proliferação elevado, e na presença de líquido deixada na cavidade abdominal com a formação de diferenciação espontânea de neurónios, queratinócitos, condrócitos, cardiomiócitos, bem como fragmentos de cabelo e de osso, mas sem qualquer indicação de um cytoarchitectonics ordenados de tecidos apropriado. Ao plantar em cultura de células de teratocarcinoma crescido solto para os clones pluripotentes substrato e corpos embrióides formados foram, em seguida, temperada e submetido a desordenada fissão espontânea diferenciar-se em neurónios, glia, células musculares e cardiomiócitos. Stevens descobriram que rato teratocarcinoma 129 / v contém menos de 1% de células capazes de se diferenciar em uma variedade de linha somática especializado, e a própria diferenciação depende de factores que os afectam (composição fluido peritoneal, os produtos adicionados à cultura de células maduras ou tecidos). Leroy Stevenson hipótese sobre a presença no meio de células de teratocarcinoma células germinais sexual progenitoras embrionário foi confirmada: a suspensão embrioblasto células de embriões pré-implantação em tecidos de murganho adulto teratocarcinoma formado, e separou-se a partir deles linhas de células puras após administração intraperitoneal a animais receptores tinha diferenciado em neurónios, cardiomiócitos e outro kletki somática derivados de todas as três camadas germinais. Em experiências in vivo transplante ESK (obtido a partir de embrioblasto mas não trofoblasto) em embriões de ratos em diferentes estádios linhas 8-32 blastero nascimento terminou do animal quimico (sem formação de tumor) em órgãos que detecta tecido couves dador. Quimerismo foi observada mesmo na linha de células sexuais.

As células germinativas progenitoras primárias isoladas do germe genital do embrião de camundongo, de acordo com a morfologia, o fenótipo imunológico e as características funcionais, corresponderam ao STS obtido por Stevenson a partir do teratocarcinoma e do embrião. Nas quimeras nascidas após a introdução do ESC no blastocisto, a morfogênese alofrenica dos órgãos foi caracterizada por uma alternância em mosaico de unidades estruturais e funcionais do fator, do pulmão e dos rins dos doadores e receptores. Em vários casos, observou-se a formação de criptas intestinais ou lóbulos do fígado, consistindo simultaneamente nas células receptoras e doadoras. No entanto, sempre a realização da morfogênese ocorreu de acordo com o programa genético das espécies às quais o beneficiário pertencia e o quimerismo foi limitado unicamente ao nível celular.

Em seguida, verificou-se que a proliferação de hESCs sem citodiferenciação em um alimentador células mesenquimais derivadas de camada (fibroblastos fetais) ocorre na presença de ligação de LIF em meios nutrientes selectivos que fornecem selectivamente apenas a sobrevivência de células estaminais e células progenitoras, ao passo que a grande maioria dos elementos celulares especializadas morre. Com a ajuda dessas técnicas em 1998 por James Thomson foi alocado cinco linhas imortalizadas de células-tronco embrionárias a partir da massa celular interna de uma pessoa blastocisto. Nesse mesmo ano, John Gerhart desenvolveu um método de isolar as linhas ESC imortais de sopro sexual de quatro-cinco-semana embriões humanos. Devido às suas propriedades únicas, apenas dois anos mais tarde, as células estaminais embrionárias e as células de tecido definitivo começou a ser utilizado na prática da medicina regenerativa e terapia génica haste.