Células estaminais mesenquimais

Entre as células-tronco regionais, um lugar especial é ocupado pelas células-tronco mesenquimais (MSCs), cujos derivados constituem a matriz estromal de todos os órgãos e tecidos do corpo humano. A prioridade na pesquisa sobre MSCs cabe a representantes da ciência biológica russa.

Em meados do século passado, uma cultura homogênea de células-tronco estromais multipotentes da medula óssea foi isolada pela primeira vez no laboratório de A. Friedenstein. As células-tronco mesenquimais aderidas ao substrato mantiveram alta intensidade de proliferação por um longo tempo e, em culturas com baixa densidade de semeadura após a fixação no substrato, formaram clones de células semelhantes a fibroblastos que não tinham atividade fagocítica. A cessação da proliferação de MSC terminou com sua diferenciação espontânea in vitro em células de osso, gordura, cartilagem, músculo ou tecido conjuntivo. Estudos posteriores tornaram possível estabelecer o potencial osteogênico de células semelhantes a fibroblastos do estroma da medula óssea de várias espécies de mamíferos, bem como sua atividade formadora de colônias. Experimentos in vivo mostraram que o transplante heterotópico e ortotópico de células semelhantes a fibroblastos formadoras de colônias resulta na formação de osso, cartilagem, tecido fibroso e adiposo. Como as células-tronco estromais da medula óssea são caracterizadas por uma alta capacidade de autorrenovação e diferenciação multifacetada dentro de uma única linhagem celular, elas são chamadas de células progenitoras mesenquimais multipotentes.

Vale ressaltar que ao longo de 45 anos de pesquisa fundamental com células-tronco mesenquimais, foram criadas condições reais para o uso de seus derivados na prática clínica.

Hoje, não há dúvida de que todos os tecidos do corpo humano são formados a partir de células-tronco de diversas linhagens celulares, como resultado dos processos de proliferação, migração, diferenciação e maturação. No entanto, até recentemente, acreditava-se que as células-tronco em um organismo adulto eram específicas do tecido, ou seja, capazes de produzir linhagens de células especializadas apenas dos tecidos em que se localizavam. Essa posição conceitual foi refutada pelos fatos da transformação de células-tronco hematopoiéticas não apenas em elementos celulares do sangue periférico, mas também em células ovais do fígado. Além disso, as células-tronco neurais mostraram-se capazes de dar origem a neurônios e elementos gliais, bem como a linhagens precoces de células progenitoras hematopoiéticas. Por sua vez, as células-tronco mesenquimais, que geralmente produzem elementos celulares de osso, cartilagem e tecido adiposo, são capazes de se transformar em células-tronco neurais. Supõe-se que, no processo de crescimento, regeneração fisiológica e reparadora de tecidos, células progenitoras não comprometidas sejam geradas a partir de reservas-tronco não específicas de tecidos. Por exemplo, a reparação do tecido muscular pode ser realizada devido à migração de células-tronco mesenquimais da medula óssea para os músculos esqueléticos.

Embora essa intercambialidade cruzada de células-tronco não seja reconhecida por todos os pesquisadores, a possibilidade de uso clínico de células-tronco mesenquimais como fonte para transplante celular e vetor celular de informação genética não é mais contestada por ninguém, assim como a multipotência das células-tronco estromais da medula óssea, que podem ser isoladas e expandidas com relativa facilidade em cultura in vitro. Ao mesmo tempo, relatos sobre a potencial pluripotência das células-tronco estromais da medula óssea continuam a aparecer na literatura científica. Como evidência, são citados protocolos de pesquisa nos quais, sob a influência de indutores específicos de transdiferenciação, as MSCs são transformadas em células nervosas, cardiomiócitos e hepatócitos. No entanto, alguns cientistas têm sérias dúvidas sobre a possibilidade de ativação e expressão repetidas de genes desde o período da embriogênese inicial. Ao mesmo tempo, todos entendem que, se forem encontradas condições para expandir a multipotência das células-tronco mesenquimais para a pluripotência das CCEs, muitos problemas éticos, morais, religiosos e legais na medicina plástica regenerativa serão automaticamente resolvidos. Além disso, como neste caso a fonte do potencial regenerativo do tronco são as células estromais autólogas do paciente, o problema da rejeição imunológica do transplante de células também está resolvido. O futuro próximo mostrará quão realistas são essas perspectivas.

[ 1 ], [ 2 ]

Uso de células-tronco mesenquimais na medicina

Na clínica, o uso de derivados de células-tronco mesenquimais está principalmente associado à restauração de defeitos teciduais que ocorrem com lesões cutâneas térmicas extensas e profundas. Na fase pré-clínica, foi realizada uma avaliação experimental da viabilidade do uso de células-tronco mesenquimais alogênicas semelhantes a fibroblastos para tratar queimaduras profundas. Foi demonstrado que as células-tronco mesenquimais da medula óssea semelhantes a fibroblastos formam uma monocamada em cultura, o que torna possível seu transplante para otimizar os processos de regeneração de feridas de queimaduras profundas. Os autores observam que os fibroblastos embrionários têm uma propriedade semelhante, mas seu uso clínico é limitado por problemas éticos e legais existentes. Uma queimadura térmica profunda com dano a todas as camadas da pele foi modelada em ratos Wistar. A área queimada foi de 18-20% da superfície total da pele. O primeiro grupo experimental incluiu ratos com queimadura térmica profunda e transplante de células-tronco mesenquimais alogênicas semelhantes a fibroblastos. O segundo grupo consistiu de animais com queimadura térmica profunda e transplante de fibroblastos embrionários alogênicos. O terceiro grupo foi representado por ratos controle com queimadura térmica profunda que não foram submetidos à terapia celular. Uma suspensão de células-tronco mesenquimais semelhantes a fibroblastos e fibroblastos embrionários foi aplicada na superfície da queimadura com uma pipeta na quantidade de 2 x 10 ^4.células no 2º dia após a modelagem da queimadura e excisão da crosta necrótica resultante. Após o transplante de células, a superfície da queimadura foi coberta com um guardanapo de gaze umedecido com solução isotônica de cloreto de sódio com gentamicina. Células da medula óssea foram coletadas para obter MSCs com sua subsequente indução em uma linha de células-tronco mesenquimais semelhantes a fibroblastos de ratos Wistar adultos de fêmures. Fibroblastos embrionários foram obtidos dos pulmões de embriões de 14 a 17 dias de idade. Fibroblastos embrionários e células da medula óssea para obtenção de MSCs foram preliminarmente cultivados em placas de Petri a uma temperatura de 37 °C em uma incubadora de CO2, em uma atmosfera com 5% de CO2 a 95% de umidade. Fibroblastos embrionários foram cultivados por 4 a 6 dias, enquanto a formação de uma monocamada de MSCs exigiu de 14 a 17 dias. Subsequentemente, as MSCs foram criopreservadas como material de origem para células-tronco mesenquimais semelhantes a fibroblastos, que foram obtidas por descongelamento e cultivo de MSCs por 4 dias. O número de células-tronco mesenquimais semelhantes a fibroblastos formadas foi mais de 3 vezes maior do que o número de fibroblastos embrionários formados durante o mesmo período de cultivo. Para identificar as células transplantadas em feridas de queimadura na fase de cultivo, seu genoma foi marcado usando um vetor de transporte viral baseado em adenovírus recombinante tipo V carregando o gene 1ac-2 que codifica a ß-galactosidase de E. coli. Células vivas em diferentes momentos após o transplante foram detectadas imuno-histoquimicamente em criosseções com a adição de substrato X-Gal, que produz uma coloração azul-esverdeada característica. Como resultado da avaliação visual dinâmica, planimétrica e histológica da condição da ferida de queimadura, foi estabelecido que já no 3º dia após o transplante celular, diferenças significativas no curso do processo da ferida aparecem nos grupos selecionados. Essa diferença tornou-se especialmente distinta no 7º dia após o transplante celular. Nos animais do primeiro grupo, para os quais foram transplantadas células-tronco mesenquimais semelhantes a fibroblastos, a ferida adquiriu uma coloração rosa intensa e uniforme, o tecido de granulação cresceu em toda a sua área até o nível da epiderme e a superfície queimada diminuiu significativamente de tamanho. O filme de colágeno formado na superfície da ferida tornou-se um pouco mais fino, mas continuou a cobrir toda a área queimada. Nos animais do segundo grupo, para os quais foram transplantados fibroblastos embrionários, o tecido de granulação subiu até o nível da epiderme das bordas da ferida, mas apenas em alguns pontos, enquanto a plasmorreia da ferida foi mais intensa do que no primeiro grupo, e o filme de colágeno inicialmente formado praticamente desapareceu. Nos animais que não receberam terapia celular, no sétimo dia a ferida queimada apresentou-se com tecido necrótico, pálido e com sulcos, recoberto por fibrina. Plasmoreia foi observada em toda a superfície queimada. Histologicamente, os animais do primeiro e segundo grupos apresentaram diminuição da infiltração celular e do desenvolvimento da rede vascular.e esses sinais do processo regenerativo incipiente foram mais pronunciados nos ratos do 1º grupo. No grupo controle, foram observados sinais de infiltração celular da ferida, o padrão histológico de vasos neoformados estava ausente. No 15º ao 30º dia de observação, a área da superfície queimada nos animais do 1º grupo foi significativamente menor do que nos ratos dos outros grupos, e a superfície de granulação estava mais desenvolvida. Nos animais do 2º grupo, a área da superfície queimada também diminuiu em comparação com o tamanho das feridas de queimadura nos ratos do grupo controle, o que ocorreu devido à epitelização marginal. No grupo controle, a superfície queimada permaneceu pálida em locais com granulações raras, asteriscos vasculares apareceram nela, havia ilhotas de placa fibrinosa, plasmorreia moderada continuou em toda a superfície queimada e uma crosta difícil de separar permaneceu em alguns locais. Em geral, nos animais do 3º grupo, o tamanho da ferida também diminuiu, mas as bordas da ferida permaneceram comprometidas.

Assim, durante um estudo comparativo da taxa de cicatrização de feridas utilizando células-tronco mesenquimais semelhantes a fibroblastos e fibroblastos embrionários, bem como sem o uso de terapia celular, observou-se uma aceleração da taxa de cicatrização da superfície queimada como resultado do transplante de células-tronco mesenquimais semelhantes a fibroblastos e fibroblastos embrionários. No entanto, no caso do uso de células-tronco mesenquimais semelhantes a fibroblastos alogênicos, a taxa de cicatrização de feridas foi maior do que com o transplante de fibroblastos embrionários. Isso se refletiu na aceleração da mudança de fases do processo regenerativo – os períodos de infiltração celular foram reduzidos, a taxa de crescimento da rede vascular aumentou, bem como a formação de tecido de granulação.

Os resultados da planimetria dinâmica indicam que a taxa de cicatrização espontânea da ferida de queimadura (sem o uso de terapia celular) foi a mais baixa. No 15º e 30º dias após o transplante de células-tronco mesenquimais semelhantes a fibroblastos alogênicos, a taxa de cicatrização da ferida foi maior do que com o transplante de fibroblastos embrionários. O método histoquímico para detecção de beta-galactosidase mostrou que, após o transplante de células-tronco mesenquimais semelhantes a fibroblastos e fibroblastos embrionários, as células transplantadas permanecem viáveis na superfície e na profundidade das feridas em regeneração durante todo o período de observação. Os autores acreditam que a maior taxa de regeneração de feridas de queimadura com o uso de células-tronco mesenquimais semelhantes a fibroblastos se deve à liberação de fatores estimulantes de crescimento biologicamente ativos por essas células durante o processo de maturação.

O transplante de queratinócitos alogênicos ou autogênicos e fibroblastos alogênicos para o tratamento de queimaduras também tem sido utilizado na prática clínica. Deve-se notar que o tratamento cirúrgico de crianças com queimaduras profundas extensas é uma tarefa complexa devido à alta natureza traumática e múltiplas intervenções cirúrgicas, perda sanguínea significativa e diversas reações aos meios de infusão utilizados. As principais dificuldades na realização de cirurgias plásticas de pele para queimaduras profundas extensas, com área superior a 40% da superfície corporal, devem-se à gravidade do estado das vítimas e à escassez de recursos de pele doadora. O uso de transplantes de tela com alto coeficiente de perfuração não resolve o problema, uma vez que as células formadas após a perfuração se epitelizam muito lentamente e os próprios retalhos de pele frequentemente lisam ou ressecam. Coberturas de queimaduras como xenoskin, aloenxertos de cadáveres e coberturas de filme sintético nem sempre são eficazes o suficiente; portanto, novos métodos de cobertura de superfícies queimadas com camadas de queratinócitos e fibroblastos cultivados estão sendo desenvolvidos. Em particular, foi proposto um método de cobertura de superfícies queimadas com a ajuda de alofibroblastos cultivados, que, quando transplantados, têm um efeito estimulante pronunciado na proliferação de epidermócitos preservados na ferida em queimaduras limítrofes, bem como queratinócitos nos septos de transplantes de tela. O trabalho de L. Budkevich e coautores (2000) apresenta os resultados do uso desse método para tratar queimaduras em crianças. O estudo incluiu 31 crianças com trauma térmico com idades entre 1 e 14 anos. Em três crianças, a área total de queimaduras de graus IIIA-B - IV foi de 40%, em 25 - 50-70%, em outras três - 71-85% da superfície corporal. A necrectomia cirúrgica precoce foi combinada com transplante de alofibroblastos cultivados e autodermoplastia. O primeiro estágio do tratamento envolveu a excisão de tecidos necróticos, o segundo estágio envolveu o transplante de alofibroblastos cultivados em filmes carreadores e o terceiro estágio (48 horas após o transplante de alofibroblastos cultivados) envolveu a remoção da matriz e autodermoplastia com retalhos de pele com uma proporção de perfuração de 1:4. Três pacientes admitidos na clínica com doença de queimadura grave tiveram alofibroblastos cultivados transplantados em feridas de granulação. O transplante de alofibroblastos cultivados foi realizado uma vez em 18 crianças, duas vezes em 11 crianças e três vezes em dois pacientes. A área da superfície da ferida coberta com cultura de células variou de 30 a 3500 cm2. A eficácia dos alofibroblastos cultivados foi avaliada pela porcentagem geral de enxerto de pele, tempos de cicatrização de queimaduras e o número de fatalidades por trauma térmico grave. O enxerto foi completo em 86% dos pacientes. A não enxertia parcial de enxertos de pele foi observada em 14% dos casos. Apesar do tratamento, seis (19,3%) crianças morreram. A área total de danos cutâneos nelas variou de 40 a 70% da superfície corporal.O transplante de alofibroblastos cultivados não foi associado à mortalidade por queimadura em nenhum paciente.

Analisando os resultados do tratamento, os autores observam que danos térmicos cutâneos profundos, anteriormente cobrindo 35-40% da superfície corporal, foram considerados incompatíveis com a vida (para crianças menores - até 3 anos de idade - queimaduras profundas cobrindo 30% da superfície corporal são críticas, para crianças maiores - mais de 40% da superfície corporal). Ao realizar necrectomia cirúrgica com transplante de alofibroblastos cultivados e subsequente autodermoplastia com retalhos de pele com alto coeficiente de perfuração, queimaduras de grau IIIB - IV permanecem críticas, mas atualmente há perspectivas de salvar a vida até mesmo dessas vítimas em muitos casos. A necrectomia cirúrgica em combinação com transplante de alofibroblastos cultivados e autodermoplastia em crianças com queimaduras profundas provou ser especialmente eficaz em pacientes com lesões cutâneas disseminadas e escassez de áreas doadoras. Táticas cirúrgicas ativas e o transplante de alofibroblastos cultivados contribuem para a rápida estabilização do estado geral desses pacientes, a redução do número de complicações infecciosas da doença de queimaduras, a criação de condições favoráveis para a realização de transplantes, a redução do tempo de restauração da pele perdida e da duração do tratamento hospitalar, além da redução da frequência de óbitos em vítimas com queimaduras extensas. Assim, o transplante de alofibroblastos cultivados com subsequente autodermoplastia com retalhos cutâneos permite a recuperação de crianças com queimaduras graves, que antes eram consideradas fadadas ao óbito.

É geralmente aceito que o objetivo principal do tratamento de queimaduras é a restauração mais completa e rápida da pele danificada para prevenir efeitos tóxicos, complicações infecciosas e desidratação. Os resultados do uso de células cultivadas dependem em grande parte da prontidão da própria ferida de queimadura para transplante. Em casos de transplante de queratinócitos cultivados na superfície da ferida após necrectomia cirúrgica, uma média de 55% (por área) das células transplantadas enxertam, enquanto em feridas de granulação a taxa de enxertia diminui para 15%. Portanto, o tratamento bem-sucedido de queimaduras cutâneas profundas e extensas requer, antes de tudo, táticas cirúrgicas ativas. Na presença de queimaduras de grau IIIB-IV, a superfície queimada é imediatamente liberada do tecido necrótico para reduzir a intoxicação e o número de complicações da doença de queimadura. O uso dessas táticas é a chave para reduzir o tempo desde o momento da queimadura até o fechamento das feridas e o tempo de internação de pacientes com queimaduras extensas no hospital, além de reduzir significativamente o número de desfechos fatais.

Os primeiros relatos de uso bem-sucedido de queratinócitos cultivados para cobrir superfícies queimadas surgiram no início da década de 1980. Posteriormente, essa manipulação foi realizada utilizando camadas de queratinócitos cultivados, na maioria das vezes obtidos de autocélulas, e muito menos frequentemente de aloceratinócitos. No entanto, a tecnologia de autoceratinocitoplastia não permite a criação de um banco de células, enquanto o tempo necessário para produzir um transplante de queratinócitos de área suficiente é longo, chegando a 3-4 semanas. Durante esse período, o risco de desenvolver complicações infecciosas e outras complicações da doença de queimadura aumenta acentuadamente, o que prolonga significativamente o tempo total de internação dos pacientes. Além disso, os autoceratinócitos praticamente não criam raízes quando transplantados para feridas de queimadura em granulação, e o alto custo de meios de crescimento especiais e estimuladores biologicamente ativos do crescimento de queratinócitos limita significativamente seu uso clínico. Outros métodos biotecnológicos, como a colagenoplastia, o transplante de xenoskin criopreservada e o uso de diversos revestimentos biopolímeros, aumentam a eficácia do tratamento de queimaduras superficiais extensas, mas não profundas. O método de cobertura da superfície da ferida com fibroblastos cultivados é fundamentalmente diferente, pois os fibroblastos, e não os queratinócitos, são usados como o principal componente da camada celular cultivada.

O pré-requisito para o desenvolvimento do método foi a comprovação de que os pericitos que circundam pequenos vasos são células mesenquimais progenitoras capazes de se transformar em fibroblastos que produzem diversos fatores de crescimento e garantem a cicatrização de feridas devido a um forte efeito estimulante sobre a proliferação e adesão dos queratinócitos. O uso de fibroblastos cultivados para o fechamento de superfícies de feridas revelou imediatamente uma série de vantagens significativas desse método em comparação com o uso de queratinócitos cultivados. Em particular, a obtenção de fibroblastos em cultura dispensa o uso de meios nutritivos especiais e estimulantes de crescimento, o que reduz o custo do transplante em mais de 10 vezes em comparação com o custo da obtenção de queratinócitos. Os fibroblastos são facilmente passivados, durante o qual perdem parcialmente os antígenos de histocompatibilidade de superfície, o que, por sua vez, abre a possibilidade de utilização de células alogênicas para a fabricação de transplantes e a criação de seus bancos. O tempo necessário para a obtenção de transplantes prontos para uso em uma clínica é reduzido de 3 semanas (para queratinócitos) para 1 a 2 dias (para fibroblastos). Uma cultura primária de fibroblastos pode ser obtida cultivando células de fragmentos de pele retirados durante a autodermoplastia, e a densidade de semeadura de células para obtenção de subculturas de fibroblastos humanos é de apenas 20 x 10 ³ por 1 cm ².

Com o objetivo de estudar o efeito dos fibroblastos e suas proteínas reguladoras na proliferação e diferenciação de queratinócitos, foi realizada uma análise comparativa da morfologia e proliferação de queratinócitos em substratos de colágeno tipos I e III, bem como fibronectina em cultura conjunta com fibroblastos humanos. Queratinócitos humanos foram isolados de fragmentos de pele de pacientes com queimaduras, obtidos durante autodermoplastia. A densidade de semeadura de queratinócitos foi de 50 x 103 células por 1 cm2. A eficácia clínica do transplante de fibroblastos cultivados foi avaliada em 517 pacientes. Todos os pacientes foram divididos em dois grupos: Grupo 1 - vítimas adultas com queimaduras de grau IIA, B - IV; Grupo 2 - crianças com queimaduras profundas de grau IIIB - IV. A avaliação da dinâmica da organização estrutural e funcional de fibroblastos de cultura em monocamada, levando em consideração o papel dos glicosaminoglicanos, fibronectina e colágeno nos processos de regeneração, permitiu aos autores determinar o 3º dia como o período mais favorável para o uso de culturas de fibroblastos para a realização de transplantes. Um estudo do efeito dos fibroblastos na proliferação e diferenciação de queratinócitos mostrou que os fibroblastos in vitro têm um efeito estimulante pronunciado, principalmente nos processos de adesão de queratinócitos, aumentando o número de células aderidas e a taxa de sua fixação em mais de 2 vezes. A estimulação dos processos de adesão é acompanhada por um aumento na intensidade da síntese de DNA e no nível de proliferação de queratinócitos. Além disso, verificou-se que a presença de fibroblastos e da matriz extracelular formada por eles é uma condição necessária para a formação do aparelho tonofibrilar dos queratinócitos, conexões intercelulares e, em última análise, para a diferenciação dos queratinócitos e a formação da membrana basal. No tratamento de crianças com queimaduras profundas, a alta eficiência clínica do transplante de cultura de alofibroblastos foi estabelecida, especialmente no grupo de pacientes com lesões cutâneas extensas em condições de deficiência do sítio doador. Um estudo morfofuncional abrangente mostrou que os fibroblastos transplantados são caracterizados pela síntese ativa de DNA, bem como de colágeno, fibronectina e glicosaminoglicanos, que fazem parte da matriz extracelular formada pelas células. Os autores apontam para uma alta porcentagem de enxerto de fibroblastos transplantados (até 96%), uma redução acentuada no tempo de recebimento (dentro de 24-48 horas em vez de 2-3 semanas no caso do uso de queratinócitos), uma aceleração significativa da epitelização da superfície da queimadura, bem como uma redução significativa no custo (em 10 vezes) da tecnologia para o cultivo de um transplante a partir de fibroblastos em comparação ao transplante de queratinócitos. O uso do transplante de alofibroblastos cultivados permite salvar a vida de crianças com queimaduras críticas - danos térmicos em mais de 50% da superfície corporal,que antes era considerado incompatível com a vida. Vale ressaltar que, com o transplante de fibroblastos embrionários alogênicos, não apenas foi comprovada de forma convincente a regeneração mais rápida de feridas e a convalescença de pacientes com queimaduras de diversos graus e áreas, mas também uma redução significativa na mortalidade.

Fibroblastos autólogos também são utilizados em uma área tão complexa da cirurgia plástica quanto a correção reconstrutiva de lesões nas cordas vocais. O colágeno bovino é geralmente utilizado para esse fim, cuja duração de ação é limitada por sua imunogenicidade. Sendo uma proteína estranha, o colágeno bovino é sensível à colagenase do receptor e pode causar reações imunológicas, para reduzir o risco de reações adversas, foram desenvolvidas tecnologias para a obtenção de preparações de colágeno reticulado com glutaraldeído. Sua vantagem reside na maior estabilidade e menor imunogenicidade, o que encontrou aplicação prática na eliminação de defeitos e atrofia das cordas vocais. As injeções de colágeno autólogo foram utilizadas pela primeira vez em 1995. A técnica garantiu a preservação da estrutura primária das fibras de colágeno autólogo, incluindo ligações cruzadas intramoleculares catalisadas enzimaticamente. O fato é que as fibras de colágeno natural são mais resistentes à destruição por proteases do que o colágeno reconstituído, no qual os telopeptídeos são cortados. A integridade dos telopeptídeos é importante para a estrutura quaternária das fibras de colágeno e para a formação de ligações cruzadas entre as moléculas de colágeno adjacentes. Ao contrário das preparações de colágeno bovino, o colágeno autólogo não causa reações imunológicas no receptor, mas não é suficientemente eficaz como agente de reposição. Uma correção estável pode ser alcançada por meio da produção local de colágeno por meio do transplante de fibroblastos autólogos. No entanto, certas dificuldades foram identificadas durante o estudo da eficácia do transplante autólogo de fibroblastos na clínica. No período inicial após o transplante de fibroblastos, o efeito clínico foi mais fraco em comparação com o após a introdução do colágeno bovino. Ao cultivar fibroblastos autólogos, não se pode descartar a possibilidade de transformação de fibroblastos normais em patológicos, os chamados miofibroblastos, responsáveis pelo desenvolvimento de fibrose e formação de cicatrizes, evidenciada pela contração do gel de colágeno causada pela interação específica de fibroblastos e fibrilas de colágeno. Além disso, após a passagem em série in vitro, os fibroblastos perdem a capacidade de sintetizar proteínas da matriz extracelular.

No entanto, um método para cultura de fibroblastos humanos autólogos foi desenvolvido experimentalmente, eliminando as deficiências mencionadas acima e não resultando em transformação oncogênica de fibroblastos normais. Fibroblastos autólogos obtidos usando este método são usados para restaurar defeitos em tecidos faciais moles. Em um estudo de G. Keller et al. (2000), 20 pacientes com idades entre 37 e 61 anos com rugas e cicatrizes atróficas foram tratados. Biópsias de pele (4 mm) da região retroauricular foram transportadas para o laboratório em tubos de ensaio estéreis contendo 10 ml de meio de cultura (meio de Eagle com antibiótico, micoséptico, piruvato e soro fetal bovino). O material foi colocado dentro de 3-5 placas de cultura de 60 mm de diâmetro e incubado em um termostato com atmosfera contendo 5% de CO2. Após 1 semana, as células foram removidas das placas por tripsinização e colocadas em frascos de 25 cm2. As células foram injetadas em pacientes na quantidade de 4 x 107. Um efeito clínico significativo e persistente foi observado em pacientes durante a correção de sulcos nasolabiais, bem como em pacientes com cicatrizes 7 e 12 meses após o terceiro transplante de fibroblastos autólogos. De acordo com a citometria de fluxo, os fibroblastos cultivados produziram uma grande quantidade de colágeno tipo I. Estudos in vitro demonstraram contratilidade normal dos fibroblastos injetados. Dois meses após a administração subcutânea de fibroblastos cultivados na dose de 4 x 107 células, nenhum tumor foi detectado em camundongos nude. Os fibroblastos injetados não causaram cicatrizes ou fibrose difusa nos pacientes. Segundo o autor, os fibroblastos autólogos enxertados são capazes de produzir colágeno constantemente, o que proporcionará um efeito de rejuvenescimento cosmético. Ao mesmo tempo, como a vida útil das células diferenciadas é limitada, os fibroblastos retirados de um paciente jovem são mais eficazes do que aqueles obtidos de idosos. No futuro, presume-se que será possível criopreservar uma cultura de fibroblastos de um doador jovem para, posteriormente, transplantar suas próprias células jovens para um paciente idoso. Em conclusão, não é totalmente correto concluir que fibroblastos autólogos, desde que funcionalmente preservados, sejam um meio ideal para corrigir defeitos dos tecidos moles da face. Ao mesmo tempo, o próprio autor observa que algumas situações problemáticas relacionadas ao uso do sistema fibroblasto-colágeno autólogo surgiram durante o estudo. O efeito clínico foi frequentemente mais fraco do que com o uso de colágeno bovino, o que causou decepção nos pacientes.

Em geral, os dados da literatura sobre as perspectivas para o uso clínico de células-tronco mesenquimais parecem bastante otimistas. Tentativas estão sendo feitas para usar células progenitoras mesenquimais multipotentes de medula óssea autólogas para tratar lesões articulares degenerativas. Os primeiros ensaios clínicos do uso de células progenitoras mesenquimais cultivadas no tratamento de fraturas ósseas complexas estão sendo conduzidos. Células estromais de medula óssea mesenquimais auto e alogênicas são usadas para criar tecido cartilaginoso para transplante na correção de defeitos da cartilagem articular devido a trauma ou lesões autoimunes. Métodos estão sendo desenvolvidos para o uso clínico de células progenitoras mesenquimais multipotentes para eliminar defeitos ósseos em crianças com uma forma grave de osteogênese incompleta causada por mutações no gene do colágeno tipo I. Após a mieloablação, as crianças receptoras são transplantadas com medula óssea de doadores saudáveis compatíveis com HLA, uma vez que a medula óssea não fracionada pode conter um número suficiente de células-tronco mesenquimais para compensar um defeito ósseo grave. Após o transplante de medula óssea alogênica, essas crianças apresentaram alterações histológicas positivas nos ossos trabeculares, aumento na taxa de crescimento e diminuição na incidência de fraturas ósseas. Em alguns casos, um resultado clínico positivo é alcançado com o transplante de medula óssea alogênica e osteoblastos intimamente relacionados. O transplante de células-tronco mesenquimais (MSC) também é utilizado para tratar a fragilidade óssea congênita causada por um desequilíbrio de osteoblastos e osteoclastos no tecido ósseo. Nesse caso, a restauração da formação óssea é alcançada por meio da quimerização do conjunto de células-tronco e estromais progenitoras no tecido ósseo dos pacientes.

O aprimoramento dos métodos de modificação genética de células-tronco mesenquimais de doadores para fins de correção de defeitos genéticos em tecidos estromais continua. Supõe-se que, em um futuro próximo, as células progenitoras mesenquimais serão utilizadas em neurologia para quimerização direcionada de células cerebrais e criação de um conjunto saudável de células capazes de gerar enzimas ou fatores deficientes responsáveis pelas manifestações clínicas da doença. O transplante de células-tronco mesenquimais pode ser utilizado para a restauração do estroma da medula óssea em pacientes com câncer após radioterapia e quimioterapia, e em combinação com células da medula óssea para a restauração da hematopoiese. O desenvolvimento de terapias de substituição visando a eliminação de defeitos do sistema musculoesquelético com o auxílio de células-tronco mesenquimais é promovido por avanços na engenharia no campo do desenvolvimento de biomateriais de matriz ou biomiméticos, formando estruturas povoadas por progênie de células-tronco mesenquimais.

Fontes de células-tronco mesenquimais

A principal fonte de células-tronco mesenquimais é a medula óssea, cujas células-tronco hematopoiéticas no corpo de mamíferos se diferenciam constantemente em células sanguíneas e do sistema imunológico, enquanto as células-tronco mesenquimais são representadas por uma pequena população de células semelhantes a fibroblastos do estroma da medula óssea e contribuem para a preservação do estado indiferenciado das células-tronco hematopoiéticas. Sob certas condições, as células-tronco mesenquimais se diferenciam em células de cartilagem e tecido ósseo. Quando semeadas em meio de cultura sob condições de plantio de baixa densidade, as células estromais mononucleares da medula óssea formam colônias de células adesivas, que são, na verdade, células progenitoras mesenquimais multipotentes semelhantes a fibroblastos. Alguns autores acreditam que as células-tronco mesenquimais não comprometidas são depositadas na medula óssea, que, devido à sua capacidade de autorrenovação e alto potencial de diferenciação, fornece a todos os tecidos do corpo precursores mesenquimais de elementos estromais ao longo da vida do organismo mamífero.

Na medula óssea, os elementos celulares estromais formam uma rede que preenche o espaço entre os sinusoides e o tecido ósseo. O conteúdo de células-tronco mesenquimais dormentes na medula óssea de um adulto é comparável à quantidade de células-tronco hematopoiéticas e não excede 0,01-0,001%. Células-tronco mesenquimais isoladas da medula óssea e não submetidas a cultivo são desprovidas de moléculas de adesão. Tais células-tronco mesenquimais não expressam CD34, ICAM, VCAM, colágeno tipos I e III, CD44 e CD29. Consequentemente, in vitro, não são as células-tronco mesenquimais que são fixadas no substrato de cultura, mas sim derivados progenitores mais avançados de células-tronco mesenquimais que já formaram os componentes do citoesqueleto e o aparelho receptor de moléculas de adesão celular. Células estromais com o fenótipo CD34 são encontradas até mesmo no sangue periférico, embora na medula óssea haja significativamente menos delas do que células mononucleares CD34-positivas. Células CD34 isoladas do sangue e transferidas para cultura se ligam ao substrato e formam colônias de células semelhantes a fibroblastos.

Sabe-se que, no período embrionário, a base estromal de todos os órgãos e tecidos de mamíferos e humanos surge de um conjunto comum de células-tronco mesenquimais, antes e durante a organogênese. Portanto, acredita-se que, em um organismo maduro, a maioria das células-tronco mesenquimais deva estar no tecido conjuntivo e ósseo. Foi estabelecido que a maior parte dos elementos celulares do estroma do tecido conjuntivo frouxo e do tecido ósseo é representada por células progenitoras comprometidas, que, no entanto, retêm a capacidade de proliferar e formar clones in vitro. Quando tais células são introduzidas na corrente sanguínea geral, mais de 20% das células progenitoras mesenquimais são implantadas entre os elementos estromais do tecido hematopoiético e dos órgãos parenquimatosos.

Uma fonte potencial de células-tronco mesenquimais é o tecido adiposo, entre as quais foram identificados precursores de adipócitos comprometidos em graus variados. Os elementos progenitores menos maduros do tecido adiposo são as células estromais vasculares, que, assim como as células precursoras mesenquimais multipotentes da medula óssea, são capazes de se diferenciar em adipócitos sob a influência de glicocorticoides, fator de crescimento semelhante à insulina e insulina. Em cultura, as células estromais vasculares diferenciam-se em adipócitos e condrócitos, e no tecido adiposo de origem na medula óssea, existem células que formam adipócitos e osteoblastos.

Células-tronco estromais também foram encontradas em músculos. Na cultura primária de células isoladas do músculo esquelético humano, células estreladas e miotubos multinucleados são detectados. Na presença de soro de cavalo, as células estreladas proliferam in vitro sem sinais de citodiferenciação e, após a adição de dexametasona ao meio nutriente, sua diferenciação é caracterizada pelo aparecimento de elementos celulares com o fenótipo de células musculares esqueléticas e lisas, osso, cartilagem e tecido adiposo. Portanto, células progenitoras mesenquimais multipotentes comprometidas e não comprometidas estão presentes no tecido muscular humano. Foi demonstrado que a população de células progenitoras presentes no músculo esquelético se origina de células progenitoras mesenquimais multipotentes não comprometidas da medula óssea e difere das células satélites miogênicas.

Células estreladas adesivas, correspondentes a células progenitoras mesenquimais multipotentes em potencial de diferenciação, também foram encontradas no miocárdio de ratos recém-nascidos, uma vez que, sob a influência da dexametasona, diferenciam-se em adipócitos, osteoblastos, condrócitos, células musculares lisas, miotubos do músculo esquelético e cardiomiócitos. Foi demonstrado que as células musculares lisas vasculares (pericitos) são derivadas de células progenitoras mesenquimais multipotentes perivasculares indiferenciadas. Em cultura, as células-tronco mesenquimais perivasculares expressam α-actina do músculo liso e receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas e são capazes de se diferenciar pelo menos em células musculares lisas.

Um lugar especial, do ponto de vista das reservas do tronco, é ocupado pelo tecido cartilaginoso, cujo baixíssimo potencial reparador se acredita ser devido à deficiência de células progenitoras mesenquimais multipotentes ou de fatores de diferenciação e crescimento. Supõe-se que células progenitoras mesenquimais multipotentes, pré-comprometidas com a condrogênese e a osteogênese, entrem no tecido cartilaginoso a partir de outras fontes teciduais.

A origem tecidual e as condições de comprometimento das células progenitoras mesenquimais nos tendões também não foram estabelecidas. Observações experimentais indicam que, no período pós-natal inicial, as células do tendão calcâneo de coelho em culturas primárias e na primeira passagem retêm a expressão de colágeno tipo I e decorina, mas com o cultivo posterior perdem os marcadores de diferenciação dos tenócitos.

Deve-se observar que a resposta à questão de saber se as células progenitoras mesenquimais multipotentes localizadas em vários tecidos estão realmente constantemente presentes em seu estroma, ou se o conjunto de tecidos de células-tronco mesenquimais é reabastecido pela migração de células-tronco estromais da medula óssea, ainda não foi recebida.

Além da medula óssea e de outras zonas de tecido mesenquimal de um organismo adulto, o sangue do cordão umbilical pode ser outra fonte de MSCs. Foi demonstrado que o sangue da veia do cordão umbilical contém células que têm características morfológicas e antigênicas semelhantes às células progenitoras mesenquimais multipotentes, são capazes de adesão e não são inferiores às células progenitoras mesenquimais multipotentes de origem da medula óssea em potencial de diferenciação. Em culturas de células-tronco mesenquimais de sangue do cordão umbilical, foram encontradas de 5 a 10% de células progenitoras mesenquimais multipotentes não comprometidas. Descobriu-se que seu número no sangue do cordão umbilical é inversamente proporcional à idade gestacional, o que indica indiretamente a migração de células progenitoras mesenquimais multipotentes para vários tecidos durante o desenvolvimento fetal. Surgiram as primeiras informações sobre o uso clínico de células-tronco mesenquimais isoladas do sangue do cordão umbilical, bem como aquelas obtidas de biomaterial embrionário, que se baseia na capacidade conhecida das células-tronco fetais de se integrar, enxertar e funcionar nos órgãos e sistemas de tecidos de receptores adultos.

Busca por novas fontes de células-tronco mesenquimais

O uso de células-tronco mesenquimais de origem embrionária, bem como de outras células fetais, cria uma série de problemas éticos, legais, judiciais e legislativos. Portanto, a busca por material celular extraembrionário de doadores continua. Uma tentativa de uso clínico de fibroblastos de pele humana não teve sucesso, o que foi predeterminado não apenas pela alta capacidade financeira da tecnologia, mas também pela rápida diferenciação de fibroblastos em fibrócitos, que têm um potencial de proliferação significativamente menor e produzem um número limitado de fatores de crescimento. Progressos adicionais no estudo da biologia de células-tronco mesenquimais (MSCs) e células progenitoras mesenquimais multipotentes da medula óssea nos permitiram desenvolver uma estratégia para o uso clínico de células-tronco mesenquimais autólogas. A tecnologia de seu isolamento, cultivo, reprodução ex vivo e diferenciação direcionada exigiu, antes de tudo, o estudo do espectro de marcadores moleculares de MSCs. Sua análise mostrou que culturas primárias de tecido ósseo humano contêm vários tipos de células progenitoras mesenquimais multipotentes. O fenótipo proosteoblástico foi detectado em células que expressam o marcador de células progenitoras estromais STRO-1, mas não carregam o marcador osteoblástico - fosfatase alcalina. Tais células são caracterizadas por uma baixa capacidade de formar matriz óssea mineralizada, bem como a ausência de expressão de receptores de osteopontina e hormônio da paratireoide. Derivados de células STRO-1-positivas que não expressam fosfatase alcalina são representados por osteoblastos intermediários e completamente diferenciados. Foi descoberto que elementos celulares de linhagens clonadas de células ósseas trabeculares humanas STRO-1-positivas são capazes de se diferenciar em osteócitos e adipócitos maduros. A direção da diferenciação dessas células depende do efeito de ácidos graxos poli-insaturados, citocinas pró-inflamatórias - IL-1b e fator de necrose tumoral a (TNF-a), bem como anti-inflamatório e imunossupressor TGF-b.

Posteriormente, descobriu-se que células progenitoras mesenquimais multipotentes não possuem um fenótipo específico inerente apenas a elas, mas expressam um complexo de marcadores característicos de células mesenquimais, endoteliais, epiteliais e musculares na ausência da expressão de antígenos imunofenotípicos de células hematopoiéticas - CD45, CD34 e CD14. Além disso, células-tronco mesenquimais produzem constitutivamente e induzivelmente fatores de crescimento hematopoiéticos e não hematopoiéticos, interleucinas e quimiocinas, e receptores para algumas citocinas e fatores de crescimento são expressos em células progenitoras mesenquimais multipotentes. Células dormentes, ou em repouso, com um imunofenótipo quase idêntico ao perfil antigênico de células progenitoras mesenquimais multipotentes não tratadas com 5-fluorouracil foram encontradas entre as células da matriz estromal do corpo humano - ambas as células expressam CD117, que marca células-tronco "adultas".

Assim, um marcador celular exclusivo para células-tronco mesenquimais ainda não foi identificado. Supõe-se que as células quiescentes representem uma população de células progenitoras mesenquimais multipotentes não comprometidas, uma vez que não expressam marcadores de células comprometidas com osteo- (Cbfa-1) ou adipogênese (PPAR-y-2). A exposição prolongada de células quiescentes de proliferação lenta ao soro bovino fetal leva à formação de progenitores comprometidos com diferenciação terminal, caracterizados por crescimento rápido. A expansão clonal dessas células-tronco mesenquimais é sustentada pelo FGF2. Parece que o genoma das células-tronco estromais é bastante "fechado". Há relatos da ausência de diferenciação espontânea em MSCs - sem condições especiais para comprometimento, elas não se transformam nem mesmo em células da linhagem mesenquimal.

Para estudar a estrutura populacional de derivados de células-tronco mesenquimais, uma busca por proteínas marcadoras de diferenciação é realizada em linhagens de células estromais e em culturas primárias. A análise clonal in vitro de células formadoras de colônias de medula óssea mostrou que o EGF aumenta o tamanho médio da colônia e diminui a expressão clonal da fosfatase alcalina quando aplicado a culturas primárias, enquanto a adição de hidrocortisona ativa a expressão da fosfatase alcalina, que é um marcador da direção osteogênica da diferenciação de MSC. Anticorpos monoclonais para STRO-1 tornaram possível separar e estudar a população de células adesivas STRO-1-positivas em um sistema heterogêneo de culturas de Dexter. Foi determinado um espectro de citocinas que regulam não apenas a proliferação e diferenciação de células hematopoiéticas e linfoides, mas também participam da formação, formação e reabsorção de tecidos esqueléticos por meio de mecanismos para, auto e endócrinos. A liberação mediada por receptores de mensageiros secundários como AMPc, diacilglicerol, trifosfato de inositol e Ca2+ também é utilizada para análise de marcadores de diversas categorias de células do tecido estromal que expressam os receptores correspondentes. O uso de anticorpos monoclonais como marcadores possibilitou estabelecer a pertença de células reticulares do estroma de órgãos linfoides às zonas dependentes de T e B.

Por algum tempo, debates científicos continuaram em torno da questão da possibilidade de origem das MSC a partir de uma célula-tronco hematopoiética. De fato, quando suspensões de células da medula óssea são explantadas em culturas de monocamada, colônias discretas de fibroblastos crescem nelas. No entanto, foi demonstrado que a presença de precursores de colônias de fibroblastos e vários brotos de diferenciação do tecido hematopoiético na medula óssea não é evidência de sua origem comum a partir de uma célula-tronco hematopoiética. Usando análise discriminante de células-tronco da medula óssea, foi estabelecido que o microambiente durante o transplante heterotópico de medula óssea não é transferido por células hematopoiéticas, o que comprova a existência de uma população de MSCs na medula óssea que é histogeneticamente independente de células hematopoiéticas.

Além disso, o método de clonagem seletiva permitiu identificar uma nova categoria de células progenitoras estromais em culturas de monocamada de células da medula óssea, determinar seu número e estudar suas propriedades e potenciais proliferativos e de diferenciação. Descobriu-se que células estromais semelhantes a fibroblastos proliferam in vitro e formam colônias diploides que, quando transplantadas de volta ao corpo, proporcionam a formação de novos órgãos hematopoiéticos. Os resultados do estudo de clones individuais indicam que, entre as células progenitoras estromais, existe uma população de células que, por seu potencial proliferativo e de diferenciação, pode reivindicar o papel de células-tronco do tecido estromal, histogeneticamente independente das células-tronco hematopoiéticas. As células dessa população são caracterizadas por crescimento autossustentável e se diferenciam em elementos de células progenitoras do osso, cartilagem e tecido reticular da medula óssea.

De grande interesse são os resultados dos estudos de R. Chailakhyan e coautores (1997-2001), que cultivaram células progenitoras estromais da medula óssea de coelhos, porquinhos-da-índia e camundongos no meio nutriente a-MEM com a adição de soro fetal bovino. Os autores realizaram a explantação com uma densidade inicial de 2-4 x 103 células da medula óssea por 1 cm2. Células homólogas ou heterólogas da medula óssea inativadas por radiação foram usadas como alimentador em uma dose que manteve o efeito alimentador, mas bloqueou completamente sua proliferação. Colônias primárias discretas de fibroblastos com duas semanas de idade foram tripsinizadas para obter cepas monoclonais. A evidência da origem clonal das colônias foi obtida usando um marcador cromossômico em culturas mistas de medula óssea de porquinhos-da-índia machos e fêmeas, fotografia em lapso de tempo de culturas vivas e em culturas mistas de medula óssea singênica de camundongos CBA e CBAT6T6. O transplante de uma suspensão de células de medula óssea recém-isoladas ou de fibroblastos estromais cultivados in vitro sob a cápsula renal foi realizado em arcabouços porosos de ivalon ou gelatina, bem como em matriz óssea esponjosa de coelho inativada. Para o transplante de clones em uma bainha óssea, fêmures de cobaias foram limpos de tecido mole e periósteo, epífises foram aparadas e a medula óssea foi completamente lavada. O osso foi cortado em fragmentos (3-5 mm), seco e irradiado a uma dose de 60 Gy. Colônias individuais de fibroblastos foram colocadas em bainhas ósseas e implantadas intramuscularmente. Para o transplante intraperitoneal de fibroblastos estromais cultivados in vitro, câmaras de difusão dos tipos A (V = 0,015 cm3, h = 0,1 mm) e O (V = 0,15 cm3, h = 2 mm) foram utilizadas.

Ao estudar a dinâmica de crescimento de linhagens clonais, R. Chailakhyan et al. (2001) descobriram que células individuais formando colônias de fibroblastos, assim como seus descendentes, têm enorme potencial proliferativo. Na 10ª passagem, o número de fibroblastos em algumas linhagens era de 1,2-7,2 x 10 ⁹ células. Durante seu desenvolvimento, eles realizaram até 31-34 duplicações celulares. Neste caso, o transplante heterotópico de linhagens derivadas de medula óssea formadas por precursores estromais de várias dezenas de clones resultou na transferência do microambiente da medula óssea e na formação de um novo órgão hematopoiético na zona de transplante. Os autores levantaram a questão de se os clones individuais são capazes de transferir o microambiente da medula óssea de células estromais ou se a cooperação de vários precursores estromais clonogênicos diferentes é necessária para isso? E se clones individuais forem capazes de transferir o microambiente, ele será completo para todos os três brotos hematopoiéticos, ou clones diferentes fornecem a formação do microambiente para diferentes brotos hematopoiéticos? Para resolver essas questões, foi desenvolvida uma tecnologia para o cultivo de células progenitoras estromais em um gel de colágeno, permitindo que as colônias de fibroblastos cultivadas sejam removidas da superfície para posterior transplante heterotópico. Clones individuais de fibroblastos estromais cultivados a partir de células da medula óssea de camundongos CBA e porquinhos-da-índia foram excisados juntamente com um fragmento do revestimento de gel e transplantados heterotopicamente - sob a cápsula renal de camundongos singênicos ou no músculo abdominal de porquinhos-da-índia autólogos. Quando transplantadas para o músculo, as colônias no gel foram colocadas em bainhas ósseas.

Os autores descobriram que 50-90 dias após o transplante de colônias de fibroblastos de medula óssea, o desenvolvimento de osso ou tecido ósseo e hematopoiético foi observado na zona de transplante em 20% dos casos. Em 5% dos animais receptores, os focos formados de tecido ósseo continham uma cavidade preenchida com medula óssea. Dentro dos cilindros ósseos, tais focos tinham uma forma arredondada e uma cápsula construída de tecido ósseo com osteócitos e uma camada osteoblástica bem desenvolvida. A cavidade da medula óssea continha tecido reticular com células mieloides e eritroides, cuja relação proporcional não diferiu daquela na medula óssea normal. No rim, o transplante foi um órgão típico de medula óssea formado durante o transplante de medula óssea nativa, com a cápsula óssea cobrindo a cavidade da medula óssea apenas do lado da cápsula renal. O tecido hematopoiético incluía elementos mieloides, eritroides e megacariocíticos. O estroma da cavidade da medula óssea tinha um sistema sinusal bem desenvolvido e continha células de gordura típicas. Ao mesmo tempo, tecido ósseo sem sinais de hematopoiese foi encontrado na zona de transplante de algumas colônias sob a cápsula renal. O estudo dos potenciais proliferativos e de diferenciação de clones individuais foi continuado em linhagens monoclonais de medula óssea de coelhos, cujas células foram ressuspensas em meio nutriente e em uma esponja de ivalon separada com uma massa de 1-2 mg foram transplantadas sob a cápsula renal de um doador de medula óssea de coelho. Células de 21 linhagens monoclonais foram submetidas a esse autotransplante. Os resultados foram levados em consideração após 2-3 meses. Os autores descobriram que, em 14% dos casos, as linhagens monoclonais transplantadas formaram um órgão de medula óssea constituído por tecido ósseo e uma cavidade da medula óssea preenchida com células hematopoiéticas. Em 33% dos casos, as linhagens transplantadas formaram um osso compacto de tamanho variável com osteócitos imobilizados nas cavidades e uma camada osteoblástica desenvolvida. Em alguns casos, tecido reticular sem osso ou elementos hematopoiéticos se desenvolveu nas esponjas com clones transplantados. Às vezes, estroma reticular com uma rede bem desenvolvida de sinusoides foi formado, mas não povoado com células hematopoiéticas. Assim, os resultados obtidos foram semelhantes aos dados obtidos durante o transplante de clones em gel de colágeno. No entanto, se o transplante de clones cultivados em um substrato resultou na formação de tecido de medula óssea em 5% dos casos, tecido ósseo em 15% e tecido reticular em 80% dos casos, então com o transplante de cepas monoclonais, a formação de elementos de medula óssea foi observada em 14% dos casos, tecido ósseo em 53% e tecido reticular em 53% dos casos. De acordo com os autores, isso indica que as condições para a implementação do potencial proliferativo e de diferenciação dos fibroblastos estromais durante o transplante em arcabouços porosos foram mais ótimas do que durante o transplante em bainhas ósseas e em um substrato de colágeno.É possível que o uso de métodos mais avançados de cultivo e transplante reverso de clones possa melhorar as condições para a realização do potencial de diferenciação dos clones e alterar essas proporções. De uma forma ou de outra, a principal importância dos estudos conduzidos reside no fato de que alguns clones de células estromais são capazes de formar tecido ósseo e, simultaneamente, fornecer um microambiente hematopoiético estromal para três brotos de hematopoiese da medula óssea simultaneamente: eritroide, mieloide e megacariocítico, criando plataformas bastante amplas de tecido hematopoiético e alguma massa óssea.

Os autores então abordaram a questão da capacidade de células progenitoras estromais clonogênicas individuais de passar por esses tipos de diferenciação celular em um sistema fechado de câmaras de difusão. Além disso, foi necessário determinar se os clones individuais possuem polipotência ou se a manifestação do potencial de diferenciação requer interação cooperativa de vários clones com uma característica de citodiferenciação fixa, cujas diferentes proporções determinam a formação preferencial de tecido ósseo, reticular ou cartilaginoso. Ao combinar duas abordagens metodológicas – obtenção de linhagens monoclonais de células progenitoras estromais da medula óssea e transplante delas para câmaras de difusão – R. Chailakhyan e coautores (2001) obtiveram resultados que lhes permitiram chegar mais perto da compreensão da organização estrutural do estroma da medula óssea. O transplante de linhagens monoclonais de células progenitoras estromais para câmaras do tipo O resultou na formação de tecido ósseo e cartilaginoso, indicando a capacidade dos descendentes de uma única célula formadora de colônias estromais de formar simultaneamente tecido ósseo e cartilaginoso. A suposição de que o tecido ósseo e cartilaginoso se origina de uma célula progenitora estromal comum tem sido repetidamente apresentada. No entanto, essa hipótese não teve confirmação experimental correta. A formação de osso e cartilagem em câmaras de difusão foi a prova necessária da existência de uma célula progenitora comum para esses dois tipos de tecido entre as células-tronco estromais da medula óssea.

Em seguida, 29 linhagens clonais das segundas e terceiras passagens obtidas de culturas primárias de medula óssea de coelho foram colocadas em câmaras de difusão e implantadas intraperitonealmente em animais homólogos. Os estudos mostraram que 45% das linhagens monoclonais de medula óssea possuem potencial osteogênico. Nove câmaras continham exclusivamente tecido reticular, mas ele estava presente junto com tecido ósseo e cartilaginoso em mais 13 câmaras, que constituíam 76% de todas as linhagens. Nas câmaras do tipo O, onde a diferenciação de tecido ósseo e cartilaginoso era possível, 16 linhagens foram estudadas. Em quatro câmaras (25%), tanto tecido ósseo quanto cartilaginoso foram formados. Deve-se notar mais uma vez que nos estudos de R. Chailakhyan et al. (2001), células progenitoras individuais sofreram de 31 a 34 duplicações dentro de uma linhagem celular, e sua progênie compreendeu 0,9-2,0 x 10 ⁹ células. O número de mitoses que as células progenitoras de linhagens policlonais sofreram foi virtualmente idêntico ao das linhagens monoclonais. A taxa de desenvolvimento de linhagens policlonais, especialmente na primeira fase de sua formação, dependeu em grande medida do número de colônias usadas para iniciar as linhagens. Linhagens diploides de fibroblastos embrionários humanos (WI-38), quando reclonadas nos níveis de 12 a 15ª duplicação, também formaram colônias que diferiram em diâmetro e conteúdo celular. Grandes colônias contendo mais de 103 células constituíram apenas 5 a 10%. Com o aumento do número de divisões, a porcentagem de grandes colônias diminuiu. Linhagens mono e policlonais de fibroblastos estromais da medula óssea mantiveram um conjunto diploide de cromossomos após 20 ou mais duplicações, e a tendência de seu desenvolvimento foi comparável à dinâmica de desenvolvimento de linhagens diploides de fibroblastos embrionários. A análise do potencial de diferenciação de células progenitoras estromais individuais da medula óssea, realizada por transplante de linhagens monoclonais em câmaras de difusão, mostrou que metade delas eram osteogênicas. Grandes colônias representavam 10% de seu número total. Consequentemente, o número de células formadoras de colônias osteogênicas correspondia a aproximadamente 5% de sua população total. A massa total de células progenitoras osteogênicas identificadas pelos autores incluía células capazes de formar simultaneamente tecido ósseo e cartilaginoso. Além disso, foi estabelecido pela primeira vez que esses dois tipos de tecido em um organismo adulto têm uma célula progenitora comum: 25% dos clones testados foram criados por tais células, e seu número entre a população total de células progenitoras era de pelo menos 2,5%.

Assim, o transplante heterotópico de clones individuais de fibroblastos da medula óssea revelou novos aspectos da organização estrutural da população de células progenitoras mesenquimais. Descobriu-se que células progenitoras estromais são capazes de transferir um microambiente específico para todos os brotos hematopoiéticos de uma só vez, cujo número entre os grandes clones estudados em diferentes modelos varia de 5 a 15% (0,5-1,5% do número total de células progenitoras detectadas). Juntamente com os clones que transferem o microambiente completo da medula óssea, existem células progenitoras determinadas apenas à osteogênese, que, quando transferidas em um sistema aberto, formam tecido ósseo que não suporta o desenvolvimento da hematopoiese. Seu número do número total de células progenitoras é de 1,5-3%. Algumas dessas células são capazes de formar tecido ósseo com um período limitado de automanutenção. Consequentemente, a população de células progenitoras estromais é heterogênea em seu potencial de diferenciação. Entre elas, há uma categoria de células que se autodenominam células-tronco estromais, capazes de se diferenciar nas três direções características do tecido estromal da medula óssea, formando osso, cartilagem e tecido reticular. Os dados apresentados nos permitem esperar que, utilizando diversos marcadores celulares, seja possível determinar a contribuição de cada tipo de célula estromal para a organização de um microambiente específico e o suporte da hematopoiese em culturas de Dexter.

Características das células-tronco mesenquimais

Nos últimos anos, estabeleceu-se que, em culturas estacionárias de medula óssea, as células progenitoras mesenquimais multipotentes são representadas por uma população limitada de pequenas células agranulares (células RS-1), caracterizadas por baixa capacidade de formação de colônias e ausência de expressão do antígeno Ki-67 específico para células em proliferação. Os parâmetros antigênicos das células RS-1 dormentes diferem do espectro de antígenos das células progenitoras estromais comprometidas de rápida proliferação. Estabeleceu-se que uma alta taxa de proliferação de células progenitoras comprometidas é observada apenas na presença de células RS-1. Por sua vez, as células RS-1 aumentam sua taxa de crescimento sob a influência de fatores secretados pelos derivados mais maduros das células progenitoras mesenquimais multipotentes. Parece que as células RS-1 são uma subclasse de MSCs não comprometidas capazes de reciclagem. In vitro, células progenitoras estromais da medula óssea resistentes ao 5-fluorouracil são caracterizadas por baixo conteúdo de RNA e alta expressão do gene da ornitina descarboxilase, um marcador de células não proliferantes.

A proliferação intensiva de células progenitoras estromais inicia-se após sua fixação no substrato. Nesse caso, o perfil de marcadores de células pouco diferenciadas é expresso: SH2 (receptor de TGF-(3)), SH3 (domínio de proteína de sinalização), colágeno tipo I e III, fibronectina, receptores de adesão VCAM-1 (CD106) e ICAM (CD54), caderina-11, CD44, CD71 (receptor de transferrina), CD90, CD120a e CD124, mas sem a expressão de marcadores característicos de células-tronco hematopoiéticas (CD34, CD14, CD45). O crescimento clonal possibilita a passagem repetida de células-tronco mesenquimais com a formação de numerosas células pluripotentes progenitoras estromais geneticamente homogêneas em cultura. Após 2 a 3 passagens, seu número atinge 50 a 300 milhões. Em uma cultura com densidade suficiente, após a cessação da proliferação, as células progenitoras estromais, diferentemente dos fibroblastos do tecido hematopoiético, diferenciam-se em adipócitos, miócitos, cartilagem e células ósseas. Uma combinação de três sinais reguladores de diferenciação, incluindo 1-metil-isobutilxantina (um indutor da formação de AMPc intracelular), dexametasona (um inibidor das fosfolipases A e C) e indometacina (um inibidor da ciclooxigenase, que também reduz a atividade da tromboxano sintase), converte até 95% das células mesenquimais progenitoras em adipócitos. A formação de adipócitos a partir de elementos estromais imaturos é confirmada pela expressão do gene da lipoproteína lipase, detecção histoquímica de apolipoproteínas e receptores peroxissomais. Células do mesmo clone, sob a influência de TGF-β em meio isento de soro, criam uma população homogênea de condrócitos. A cultura celular multicamadas desse tecido cartilaginoso é caracterizada por uma matriz intercelular desenvolvida, composta por proteoglicanos e colágeno tipo II. Em meio nutriente com 10% de concentração, o efeito de um complexo de sinalização de diferenciação, composto por b-glicerofosfato (um doador de fosfato inorgânico), ácido ascórbico e dexametasona, na mesma cultura de células progenitoras estromais, leva à formação de agregados celulares. Nessas células, observa-se um aumento progressivo da atividade da fosfatase alcalina e dos níveis de osteopontina, indicando a formação de tecido ósseo, cuja mineralização celular é confirmada pelo aumento progressivo do conteúdo intracelular de cálcio.

De acordo com alguns dados, a capacidade das células-tronco mesenquimais de se dividirem e reproduzirem ilimitadamente vários tipos de células da linha de diferenciação mesenquimal é combinada com um alto grau de plasticidade. Quando introduzidas nos ventrículos ou na substância branca do cérebro, as células-tronco mesenquimais migram para o parênquima do tecido nervoso e se diferenciam em derivados da linhagem celular glial ou neuronal. Além disso, há informações sobre a transdiferenciação de MSCs em células-tronco hematopoiéticas tanto in vitro quanto in vivo. Uma análise mais aprofundada em alguns estudos determinou uma plasticidade excepcionalmente alta das MSCs, que se manifesta em sua capacidade de se diferenciar em astrócitos, oligodendrócitos, neurônios, cardiomiócitos, células musculares lisas e células musculares esqueléticas. Vários estudos sobre o potencial de transdiferenciação de MSCs in vitro e in vivo estabeleceram que células progenitoras mesenquimais multipotentes originárias da medula óssea se diferenciam terminalmente em linhas celulares que formam osso, cartilagem, músculo, nervo e tecido adiposo, bem como tendões e estroma que dão suporte à hematopoiese.

No entanto, outros estudos não conseguiram revelar quaisquer sinais de restrição da pluripotência do genoma das células-tronco mesenquimais e das populações progenitoras de células estromais, embora mais de 200 clones de MSCs isolados de uma cultura primária tenham sido estudados para testar a possível pluripotência das células estromais. A esmagadora maioria dos clones in vitro manteve a capacidade de se diferenciar nas direções osteogênica, condrogênica e adipogênica. Ao excluir a probabilidade de migração de células receptoras pelo transplante de células-tronco mesenquimais sob a cápsula renal ou em câmaras de difusão, descobriu-se que as células progenitoras estromais in situ mantêm um fenótipo heterogêneo, o que indica a ausência de fatores de restrição na zona de transplante ou a ausência de pluripotência das MSC como tal. Ao mesmo tempo, a existência de um tipo raro de células-tronco pluripotentes somáticas, que são precursoras comuns de todas as células-tronco adultas, é permitida.

A multipotência, mas não a pluripotência, das células-tronco mesenquimais verdadeiras, que constituem uma proporção muito pequena das células da medula óssea e são capazes de proliferar sob certas condições durante o cultivo in vitro sem se diferenciar, é evidenciada por seu comprometimento induzido com células ósseas, cartilaginosas, adiposas e musculares, bem como com tenócitos e elementos estromais que sustentam a hematopoiese. Como regra, a exposição prolongada a um meio de cultura com soro fetal bovino provoca a liberação de MSCs em células progenitoras estromais comprometidas, cuja progênie sofre diferenciação terminal espontânea. In vitro, é possível atingir a formação direcionada de osteoblastos adicionando dexametasona, ß-glicerofosfato e ácido ascórbico ao meio de condicionamento, enquanto uma combinação de sinais de diferenciação por dexametasona e insulina induz a formação de adipócitos.

Foi estabelecido que, antes de entrarem no estágio de diferenciação terminal, as MSCs da medula óssea inicialmente se diferenciam em células-tronco mesenquimais semelhantes a fibroblastos sob certas condições de cultura. Derivados dessas células in vivo participam da formação de ossos, cartilagens, tendões, tecido adiposo e muscular, bem como do estroma que sustenta a hematopoiese. Muitos autores entendem o termo "células progenitoras mesenquimais multipotentes" como significando tanto as próprias MSCs quanto as células progenitoras estromais comprometidas da medula óssea e dos tecidos mesenquimais. A análise clonal de células progenitoras mesenquimais multipotentes de origem na medula óssea mostrou que pouco mais de um terço de todos os clones se diferenciam em osteo, condro e adipócitos, enquanto as células dos clones restantes têm apenas potencial osteogênico e formam apenas condro e osteócitos. Um clone de células progenitoras mesenquimais multipotentes, como a BMC-9, sob condições microambientais adequadas, diferencia-se em células com fenótipo e características funcionais não apenas de osteoblastos, condrócitos e adipócitos, mas também de células estromais que suportam a hematopoiese. Um clone de células RCJ3.1, isolado da medula óssea fetal de rato, diferencia-se em células mesenquimais de vários fenótipos. Sob a ação combinada de ácido ascórbico, β-glicerofosfato e dexametasona, os elementos celulares desse clone formam inicialmente miócitos multinucleares e, em seguida, sequencialmente, adipócitos, condrócitos e ilhotas de tecido ósseo mineralizado. A população de células granulares do periósteo de fetos de ratos corresponde a células progenitoras mesenquimais multipotentes não comprometidas, pois é caracterizada por baixa taxa de proliferação, não expressa marcadores de diferenciação e, em condições de cultura, diferencia-se para formar condro, osteo e adipócitos, bem como células musculares lisas.

Assim, deve-se reconhecer que a questão da pluripotência ou multipotência do genoma das células-tronco mesenquimais permanece em aberto, o que, consequentemente, também afeta as ideias sobre o potencial de diferenciação das células progenitoras estromais, que também não foi definitivamente estabelecido.

Uma característica importante e comprovada experimentalmente das células-tronco mesenquimais é sua capacidade de deixar o nicho tecidual e circular na corrente sanguínea geral. Para ativar o programa de diferenciação genética, essas células-tronco circulantes devem entrar no microambiente apropriado. Foi demonstrado que, com a introdução sistemática de MSCs na corrente sanguínea de animais receptores, células imaturas são implantadas em vários órgãos e tecidos, diferenciando-se em células sanguíneas, miócitos, adipócitos, condrócitos e fibroblastos. Consequentemente, em zonas teciduais locais, ocorrem interações de regulação de sinal entre células progenitoras estromais não comprometidas e comprometidas, bem como entre elas e as células maduras circundantes. Supõe-se que a diferenciação seja induzida por fatores reguladores parácrinos de origem mesenquimal e não mesenquimal (fatores de crescimento, eicosanoides, moléculas da matriz extracelular), que fornecem conexões espaciais e temporais no microambiente de células progenitoras mesenquimais multipotentes. Portanto, danos locais ao tecido mesenquimal devem levar à formação de zonas no microambiente de células progenitoras mesenquimais multipotentes que são qualitativamente diferentes do complexo de sinais regulatórios dos tecidos intactos, nos quais ocorrem processos de regeneração fisiológicos, e não reparativos. Essa diferença é extremamente importante em termos de especialização do fenótipo celular no microambiente normal e no microambiente induzido por dano.

De acordo com os conceitos, é aqui que se inserem os mecanismos que diferenciam fundamentalmente os dois processos conhecidos – regeneração fisiológica e proliferação inflamatória. O primeiro deles culmina na restauração da composição celular especializada do tecido e de sua função, enquanto o resultado da implementação do processo de proliferação é a formação de elementos maduros do tecido conjuntivo e a perda da função da zona tecidual danificada. Assim, para desenvolver programas otimizados para o uso de células progenitoras mesenquimais multipotentes na medicina regenerativa-plástica, é necessário um estudo aprofundado das características do impacto dos fatores microambientais na diferenciação das células-tronco mesenquimais (MSCs).

A dependência da estrutura do compartimento das células-tronco em reguladores para e autócrinos celulares, cuja expressão é modulada por sinais externos, é inquestionável. Entre as funções dos fatores regulatórios, as mais importantes são o controle da divisão assimétrica das MSCs e a expressão de genes que determinam os estágios de comprometimento e o número de divisões celulares. Os sinais externos, dos quais depende o desenvolvimento posterior das MSCs, são fornecidos por seu microambiente. Em um estado imaturo, as MSCs proliferam por um longo tempo, mantendo a capacidade de se diferenciar em linhagens de adipócitos, miofibroblastos, estroma de tecido hematogênico, cartilagem e células ósseas. Foi estabelecido que uma população limitada de elementos celulares estromais CD34-negativos circulantes no sangue retorna da corrente sanguínea geral para o estroma da medula óssea, onde é transformada em linhagens de células-tronco hematopoiéticas CD34-positivas. Essas observações sugerem que a recirculação de células mesenquimais progenitoras na corrente sanguínea mantém o equilíbrio tecidual das células-tronco estromais em diferentes órgãos, mobilizando um conjunto comum de elementos estromais imaturos da medula óssea. A diferenciação de células-tronco mesenquimais (MSCs) em células com múltiplos fenótipos mesenquimais e sua participação na regeneração ou reparo de osso, cartilagem, tecido adiposo e tendões in vivo foram comprovadas por meio de modelos de transferência adotiva em animais experimentais. De acordo com outros autores, a migração distante de MSCs ao longo do leito vascular é combinada com o movimento local ou de curta distância de células progenitoras mesenquimais multipotentes dentro do tecido durante o reparo da cartilagem, regeneração muscular e outros processos restaurativos.

As reservas locais de células-tronco da base do tecido estromal atuam como fonte de células nos processos de regeneração fisiológica do tecido e são reabastecidas pelo transporte distante de células-tronco mesenquimais (MSCs) à medida que os recursos de células-tronco do tecido estromal são consumidos. No entanto, em condições de necessidade de mobilização emergencial do potencial celular reparador, por exemplo, em caso de politraumatismo, todo o escalão de MSCs participa dos processos de regeneração reparadora, e as células progenitoras mesenquimais da medula óssea são recrutadas para a periferia através do fluxo sanguíneo geral.

Transplante de células-tronco mesenquimais

Certos paralelos podem ser traçados entre os processos de regeneração fisiológica dos tecidos e sua formação durante o desenvolvimento intrauterino. Na embriogênese humana e mamífera, a formação de vários tipos de células especializadas ocorre a partir do pool ectodérmico, meso e endodérmico das camadas germinativas, mas com a participação obrigatória do mesênquima. A rede celular frouxa do tecido mesenquimal embrionário desempenha inúmeras funções regulatórias, metabólicas, estruturais e morfogenéticas. A postura dos órgãos provisórios ocorre somente após a condensação do mesênquima devido ao crescimento clonogênico das células progenitoras, que geram os sinais morfogenéticos primários da organogênese. Derivados estromais do mesênquima embrionário criam a estrutura celular dos órgãos provisórios e formam a base para seu futuro suprimento energético-plástico devido ao crescimento dos vasos sanguíneos e linfáticos primários. Em outras palavras, os elementos estromais da unidade microcirculatória dos órgãos fetais surgem antes da formação de suas unidades estruturais e funcionais. Além disso, a migração ativa de células mesenquimais durante a organogênese fornece orientação espacial de órgãos em desenvolvimento, marcando seus limites de volume por meio da restrição de tipos Hox homeóticos. A estrutura estromal também serve como base para a montagem de unidades estruturais e funcionais de órgãos parenquimatosos, que frequentemente incluem células morfogeneticamente e funcionalmente completamente diferentes. Consequentemente, durante a embriogênese, as funções do mesênquima são primárias e são realizadas por meio da geração de sinais regulatórios que ativam a proliferação regional e a diferenciação de células epiteliais progenitoras. As células mesenquimais embrionárias produzem fatores de crescimento como HGF-β, HGF-β, CSF, para os quais as células progenitoras parenquimatosas possuem receptores correspondentes. Em tecido maduro diferenciado de um organismo adulto, a rede estromal de células também gera sinais para manter a viabilidade e a proliferação de células progenitoras de origem não mesenquimal. No entanto, o espectro de sinais regulatórios estromais na ontogênese pós-natal é diferente (SCF, HGF, IL-6, IL-1, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, GM-CSF, flt-3, LIF, etc.) e visa garantir a regeneração fisiológica ou o reparo de zonas de tecido danificadas. Além disso, as características espectrais dos fatores regulatórios estromais em cada tipo de tecido e até mesmo dentro de um órgão são diferentes. Em particular, a hematopoiese e a linfopoiese com a proliferação e diferenciação de células hematopoiéticas e imunocompetentes ocorrem apenas em certos órgãos, dentro dos limites dos quais o microambiente estromal opera, proporcionando condições para a maturação de células hematopoiéticas e linfoides. A capacidade das células hematopoiéticas e linfoides de repovoar um determinado órgão, proliferar e amadurecer em seus nichos microestruturais depende dos fatores regulatórios do microambiente.

Entre os componentes da matriz extracelular produzidos pelas células progenitoras mesenquimais multipotentes, destacam-se a fibronectina, a laminina, o colágeno e os proteoglicanos, bem como o CD44 (receptor de hialuronano e osteopontina), que desempenham um papel importante na organização das interações intercelulares e na formação da matriz extracelular na medula óssea e no tecido ósseo. Foi comprovado que as células progenitoras mesenquimais multipotentes da medula óssea criam um microambiente estromal que fornece sinais indutivos e regulatórios não apenas às células-tronco mesenquimais (MSCs), mas também às células-tronco hematopoiéticas e outras células-tronco não mesenquimais da medula óssea. Sabe-se que a participação das MSCs na hematopoiese é determinada por sua capacidade de se diferenciar em células estromais que sustentam a hematopoiese, e esse sinal instrutivo é recebido pelas MSCs diretamente das células-tronco hematopoiéticas. É por isso que, em cultura, a rede de células progenitoras estromais serve como base de alimentação para o desenvolvimento de todos os clones de células hematopoiéticas.

Em um organismo maduro, a intensidade da hemopoiese e da linfopoiese está em equilíbrio dinâmico com o "gasto" de células sanguíneas maduras e células do sistema imunológico na periferia. Como as células estromais da medula óssea e dos órgãos linfoides são renovadas extremamente raramente, não ocorre reestruturação significativa das estruturas estromais neles. O sistema pode ser desequilibrado por danos mecânicos a qualquer um dos órgãos da hemopoiese ou da linfopoiese, o que leva a alterações sequenciais uniformes que afetam não apenas e não tanto os elementos hematopoiéticos ou linfoides, mas as estruturas estromais do órgão danificado. No processo de regeneração reparadora, a base estromal é formada primeiro, sendo então repovoada por células hematopoiéticas ou imunocompetentes. Esse fato há muito conhecido torna a regeneração pós-traumática um modelo conveniente para o estudo do microambiente estromal dos órgãos hematopoiéticos. Em particular, o esvaziamento mecânico da cavidade medular dos ossos tubulares é utilizado para estudar a regeneração reparadora da medula óssea - curetagem, que permite a remoção rápida e eficaz do tecido hematopoiético do estado de equilíbrio dinâmico. Ao estudar os processos de regeneração reparadora dos componentes hematopoiéticos e estromais da medula óssea após o esvaziamento mecânico da cavidade medular da tíbia de cobaias, constatou-se que não há correlação direta entre os índices de regeneração das células hematopoiéticas e estromais (número de células hematopoiéticas, concentração e número de células progenitoras estromais). Além disso, verificou-se que um aumento na população de células progenitoras estromais ocorre mais cedo após a curetagem, e os próprios fibroblastos estromais tornam-se fosfatase-positivos, o que é típico do tecido osteogênico. Também foi estabelecido que a curetagem de 3 a 5 ossos tubulares leva ao crescimento dessa população de células na medula óssea de ossos não operados e até mesmo no baço, que em cobaias é um órgão exclusivamente linfopoiético.

O quadro morfológico dos processos reparativos na medula óssea de tíbias curetadas de cobaias geralmente corresponde aos dados descritos na literatura obtidos em experimentos com animais de outras espécies, e a dinâmica das alterações que ocorrem após a remoção do tecido hematopoiético é a mesma para todas as espécies animais, e a diferença diz respeito apenas aos parâmetros temporais. Morfologicamente, a ordem de fases da restauração da hematopoiese na cavidade medular esvaziada consiste em processos sucessivos de organização do coágulo sanguíneo, formação de tecido ósseo fibroso grosseiro, sua reabsorção, desenvolvimento de sinusoides e formação do estroma reticular, que é subsequentemente repovoado por elementos hematopoiéticos. Nesse caso, o número de células hematopoiéticas progenitoras no processo de regeneração do tecido da medula óssea aumenta paralelamente ao aumento do conteúdo de células-tronco hematopoiéticas.

Yu. Gerasimov e coautores (2001) compararam as alterações no número de células hematopoiéticas e o número de células progenitoras estromais em fases individuais do processo de regeneração. Descobriu-se que as alterações quantitativas nas células da medula óssea no osso curetado correspondem à dinâmica das características morfológicas da regeneração. Os autores associam a diminuição do conteúdo celular no regenerado durante os três primeiros dias com a morte das células hematopoiéticas devido ao efeito desfavorável do microambiente criado pelo tecido reticular em proliferação na medula óssea preservada na região da epífise, bem como com a formação de focos de tecido osteoide nesta última e dano vascular durante a curetagem. No 7º ao 12º dia, um aumento no nível de células nucleadas coincide com o aparecimento de focos individuais de hematopoiese mieloide nas zonas de proliferação de elementos estromais. No 20º dia, surgem áreas significativas de medula óssea regenerada e seios bem desenvolvidos, acompanhadas de um aumento significativo no número total de células. No entanto, o número de elementos hematopoiéticos durante esse período é de 68% do nível de controle. Isso é consistente com dados publicados anteriormente de que o número de células hematopoiéticas após a curetagem atinge o normal apenas no 35º-40º dia após a cirurgia.

No período pós-traumático inicial, a principal fonte para a restauração da hematopoiese são os elementos celulares locais preservados durante a curetagem. Em estágios posteriores, a principal fonte de regeneração do tecido hematopoiético da medula óssea são as células-tronco que repovoam as zonas estromais livres. Quanto às categorias individuais de células estromais (endoteliais, reticulares e osteogênicas), as fontes que garantem sua formação durante a reorganização da cavidade da medula óssea permanecem obscuras. Os resultados do estudo de Yu. V. Gerasimov e coautores (2001) indicam que, na medula óssea preservada após a curetagem, a concentração de células formadoras de colônias de fibroblastos é significativamente maior do que na medula óssea normal. Os autores acreditam que a curetagem resulta em uma eliminação seletiva mais intensiva das células hematopoiéticas em comparação com as células estromais formadoras de colônias, que participam da formação do estroma e estão mais fortemente associadas à sua substância principal do que as células hematopoiéticas.

A dinâmica da alteração no número de células que formam colônias de fibroblastos correlaciona-se com a intensidade dos processos de osteogênese, a subsequente reabsorção das trabéculas ósseas e a formação do estroma reticular, que é povoado por células hematopoiéticas. A maioria das células progenitoras do estroma, nos períodos especificados de regeneração, forma tecido ósseo fibroso grosseiro e estroma reticular. Em caso de fraturas do fêmur sob condições de osteossíntese prolongada, no 5º dia na zona de regeneração, a concentração e o número de células que formam colônias de fibroblastos aumentam e, durante o período de formação óssea intensiva, seu número aumenta 6 vezes. Sabe-se que as células da medula óssea que formam colônias de fibroblastos têm propriedades osteogênicas. O número de células progenitoras do estroma aumenta antes da colonização do território curetado da medula óssea pelas células hematopoiéticas. Isso está em boa concordância com os dados de que as células do estroma proporcionam a formação de um microambiente hematopoiético. Aparentemente, a criação de um microambiente hematopoiético corresponde a um certo nível de regeneração do tecido estromal, e o número de células hematopoiéticas aumenta com a expansão da plataforma estromal adequada para hematopoiese.

De grande interesse são os dados dos autores de que, imediatamente após a curetagem, o número de células progenitoras estromais nas partes remotas do esqueleto aumenta. A partir da sexta hora e até o vigésimo dia, inclusive, observa-se um aumento de mais de duas vezes na concentração e no número de células formando colônias de fibroblastos na tíbia contralateral. O mecanismo desse fenômeno provavelmente está associado ao fato de que a lesão maciça da medula óssea leva à formação de um grande número de coágulos sanguíneos com a destruição simultânea de um número significativo de plaquetas e a liberação de fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) no sangue, o que é conhecido por causar a proliferação de células formando colônias de fibroblastos localizadas no corpo fora do pool proliferativo. Em experimentos com coelhos, a administração local de MSCs promove a restauração do tecido cartilaginoso da articulação do joelho cirurgicamente danificada, o que pode estar associado à formação de condrócitos originários das MSCs injetadas. No entanto, a regeneração reparadora de defeitos ósseos em ratos de laboratório é significativamente melhorada pelo uso de células-tronco mesenquimais encapsuladas em uma estrutura cerâmica. Portanto, pode-se presumir que, se não for o RBOC, algum outro fator originário de células estromais danificadas exerce um efeito estimulante distante sobre a proliferação de células progenitoras mesenquimais em zonas intactas da medula óssea e estimula sua migração para a área defeituosa da medula óssea. Por sua vez, isso é contrariado por dados da literatura de anos anteriores que indicam que as células estromais responsáveis pelo microambiente, diferentemente das células hematopoiéticas, não são capazes de migração e se originam de fontes locais.

No entanto, os resultados do estudo de Yu. Gerasimov e coautores (2001) indicam que o trauma mecânico causa não apenas uma reestruturação acentuada do tecido estromal no osso curetado, mas também alterações significativas no estroma em ossos intactos distantes, ou seja, há uma resposta sistêmica do tecido estromal ao trauma local. Além disso, quando o politrauma é infligido - curetagem múltipla - essa reação é intensificada e é observada não apenas no osso operado e em partes distantes do esqueleto, mas também nos órgãos linfoides, em particular no baço. O mecanismo dessa resposta sistêmica do tecido estromal da medula óssea e do baço ao trauma local e ao politrauma permanece desconhecido. Supõe-se que esse processo esteja associado à ação de um fator humoral secretado pelo estroma mesenquimal da cavidade medular da medula óssea. A possibilidade de produção por células estromais da medula óssea e do baço de um fator humoral não específico de órgão, responsável pela proliferação de células formadoras de colônias de fibroblastos, é evidenciada por dados sobre sua atividade estimulante de colônias em culturas de monocamada de medula óssea.

Nesse sentido, vale ressaltar que, com a administração sistêmica de células progenitoras mesenquimais multipotentes, seus derivados repovoam não apenas a medula óssea, mas também outros tecidos, o que é utilizado, em particular, para terapia gênica. Foi demonstrado que, com a administração intravenosa de grandes quantidades de células-tronco mesenquimais (MSCs) com genoma selvagem em camundongos com mutação no gene do colágeno tipo I, as células do doador substituem até 30% das células do tecido ósseo e cartilaginoso dos receptores, e células-tronco mesenquimais de camundongo transfectadas, secretoras de IL-3 humana, sustentam eficazmente a hematopoiese por 9 meses, quando administradas simultaneamente com células-tronco hematopoiéticas humanas em camundongos imunodeficientes.

[ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

Modificação genética de células-tronco mesenquimais

Entre os sucessos da modificação genética experimental de MSCs, vale destacar a transfecção do gene do fator IX em MSCs humanas com subsequente transferência de células transfectadas para camundongos imunodeficientes, o que leva ao aparecimento de fator B anti-hemofílico no sangue por 8 semanas após o transplante. Neste experimento, a modificação pós-traducional do fator IX pela γ-glutamil carboxilase foi realizada nas células transfectadas. A transdução de MSCs com um vetor retroviral que codifica o fator IX humano teve menos sucesso — a administração subsequente dessas células a um cão com hemofilia B proporcionou um nível terapêutico de fator IX, mantendo a intensidade normal da hemostasia da coagulação, por apenas 12 dias.

O transplante de células-tronco mesenquimais para o parênquima cerebral de animais demonstrou que as células imaturas do doador são transformadas em populações neuronais e gliais. O enxerto de derivados neuronais de tecido mesenquimal de doador saudável teoricamente possibilita a correção de anormalidades genéticas do metabolismo cerebral em pacientes com doença de Gaucher e outros distúrbios do metabolismo de lipídios, gangliosídeos ou carboidratos.

A busca experimental por condições para a transdiferenciação de células-tronco estromais da medula óssea em células progenitoras do tecido neural e hepático está em andamento. A atenção dos pesquisadores está voltada para combinações de indutores de diferenciação e meios condicionados especiais. Em particular, para isolar a cultura primária de células estromais, células da medula óssea lavadas e ressuspensas em meio de cultura DMEM/F12 (1/1) com 10% de soro fetal bovino são semeadas a uma densidade de 200.000/cm². Após 24 horas, as células não aderentes são removidas e as células semelhantes a fibroblastos aderidas ao plástico são cultivadas por uma semana. Para a diferenciação de células estromais da medula óssea em neuroblastos, utiliza-se um meio condicionado obtido por cultivo de três dias da cultura primária de fibroblastos embrionários de camundongo, bem como meio DMEM/F12 (1/1) com 2% de soro fetal bovino e adição de 20 ng/ml de NF ou 10-6 M de ácido retinoico (neuroindutores utilizados para diferenciação neural de células-tronco embrionárias de camundongos e humanos). A diferenciação de células estromais da medula óssea em células precursoras de hepatócitos é induzida em um meio condicionado criado a partir do cultivo de três dias da cultura primária de células hepáticas embrionárias de camundongo em meio DMEM/F12 (1/1) com adição de 10% de soro fetal bovino.

Aqui deve ser notado mais uma vez que as células formadoras de colônias do estroma da medula óssea são heteromórficas e podem ser divididas em dois tipos. O primeiro tipo inclui células semelhantes a fibroblastos que formam filopódios com núcleos grandes e um ou dois nucléolos. O segundo tipo é representado por pequenas células fusiformes. Ao cultivar células de ambos os tipos em um meio condicionado obtido em uma camada alimentadora de fibroblastos embrionários primários de camundongo, células semelhantes a neuroblastos aparecem na cultura do 3º ao 4º dia. Nesse estágio, elas geralmente têm uma forma fusiforme com um ou dois processos longos terminando em filopódios. Menos comuns são células piramidais ou estreladas com dendritos curtos. Os dendritos de alguns neuroblastos têm expansões características (brotos de crescimento) e ramos em sua parte distal, enquanto outros têm cones de crescimento distintos com filopódios, através dos quais os dendritos crescem. Características morfológicas semelhantes (brotos e cones de crescimento com filopódios) inerentes aos neuroblastos que se diferenciam em neurônios foram descritas em detalhes em estudos sobre neurogênese. Com base nisso, alguns autores concluem que as células encontradas na cultura são neuroblastos. Em particular, E. Shchegelskaya e coautores (2002), após cultivar uma cultura primária de células estromais por duas semanas em um meio condicionado trocado a cada 3 ou 4 dias, descobriram que algumas das células proliferaram enquanto mantinham um estado indiferenciado. Externamente, essas células se assemelhavam a fibroblastos e foram detectadas na cultura junto com neuroblastos em diferenciação. A maioria das células (cerca de 80%) estava em diferentes estágios de diferenciação em células do tecido nervoso, principalmente em neurônios. Os processos dendríticos dessas células estavam em contato próximo uns com os outros, de modo que as células gradualmente formaram seções da rede nervosa no substrato na forma de longos filamentos multicelulares. Os processos dendríticos dos neuroblastos tornaram-se significativamente mais longos, alguns deles excedendo o comprimento do próprio corpo do neurônio em 8 a 10 vezes. A proporção de células piramidais e estreladas aumentou gradualmente. Os dendritos das células estreladas ramificaram-se. De acordo com os autores, a diferenciação posterior das células piramidais e estreladas em comparação com as células fusiformes corresponde à sequência de estágios da neurogênese normal em animais. Como resultado, os autores concluem que as células-tronco estromais da medula óssea sofrem neurogênese induzida, durante a qual todos os três principais tipos de neurônios são formados a partir de neuroblastos in vitro. Precursores de células nervosas também foram detectados durante o cultivo de células estromais da medula óssea por 3 a 4 dias em um meio com 2% de soro fetal e 20 ng/ml de LIF. Mas, neste caso, as células-tronco se dividiram muito lentamente, a diferenciação dos neuroblastos ocorreu apenas em 30% dos casos e elas não formaram redes neurais. Utilizando o ácido retinóico como um dos indutores da diferenciação das células nervosas, os autores obtiveram até 25-30% das células nervosas na cultura,com elementos gliais predominantemente - astrócitos e oligodendrócitos. Os neurônios constituíam apenas um terço de todas as células nervosas, embora fossem representados por todos os três tipos: células fusiformes, piramidais e estreladas. No 6º dia de cultivo de células estromais em meio com ácido retinoico, as células nervosas tornaram-se mais diferenciadas, e axônios foram encontrados em neurônios piramidais individuais, que na neuroontogênese normal aparecem mais tarde do que a formação de processos dendríticos. Segundo os autores, apesar do baixo rendimento de células nervosas, o método de indução com ácido retinoico tem suas vantagens: oligodendrócitos e astrócitos desempenham funções mielinizantes e nutricionais durante o crescimento de dendritos e axônios e são necessários para a formação normal do tecido nervoso. Portanto, para o reparo de suas áreas danificadas in vivo, é melhor usar uma suspensão de neurônios enriquecida com células gliais.

Na segunda série de experimentos, os autores tentaram induzir a diferenciação de células estromais da medula óssea em células hepáticas. Após três dias de cultivo de células-tronco estromais da medula óssea em um meio condicionado obtido pela incubação de hepatócitos embrionários de camundongos, foram encontradas células grandes e esféricas, frequentemente binucleares, com inclusões citoplasmáticas de tamanhos variados. Essas células estavam em diferentes estágios de diferenciação e diferiam em tamanho, número de núcleos e inclusões no citoplasma. Glicogênio foi detectado na maioria dessas células, com base no qual os autores as identificaram como células precursoras de hepatócitos. Como nenhuma célula semelhante a neuroblastos foi encontrada na cultura, concluiu-se que o meio condicionado obtido como resultado do cultivo de hepatócitos embrionários não possuía fatores de diferenciação de células nervosas e, inversamente, continha fatores que induziam a diferenciação de células estromais da medula óssea em células precursoras de hepatócitos. Em conclusão, os autores sugerem a presença de pluripotência nas células estromais da medula óssea, uma vez que elas se diferenciam in vitro em células do tecido nervoso ou hepático dependendo do meio condicionado específico e dos indutores utilizados.

Alguns estudos demonstraram, de fato, corretamente a diferenciação de células estromais da medula óssea em cardiomiócitos, cartilagem, osso e células do tecido nervoso. Há evidências de que, entre as células da medula óssea, existem populações de células-tronco capazes de se diferenciar em hepatócitos. À luz desses dados, os resultados dos experimentos em camundongos acima podem ser considerados uma confirmação adicional da presença, na medula óssea, de células-tronco mesenquimais pluripotentes capazes de se diferenciar em células de vários tecidos de um organismo adulto.

Transplante de células-tronco mesenquimais

Na transplantologia clínica, células-tronco mesenquimais humanas podem ser utilizadas para garantir a expansão de células-tronco hematopoiéticas, bem como de seus descendentes pré-comprometidos. Em particular, a introdução de células-tronco hematopoiéticas autólogas e células-tronco mesenquimais (MSCs) em pacientes com câncer após quimioterapia em altas doses acelera a restauração do número de neutrófilos e plaquetas no sangue periférico. Transplantes alogênicos e autólogos de células-tronco mesenquimais são utilizados para tratar mieloma múltiplo, anemia aplástica e trombocitopenia espontânea – doenças associadas a um defeito primário no estroma do tecido hematopoiético. A eficácia da terapia celular em patologias oncohematológicas é, em muitos casos, maior com a introdução simultânea de células-tronco estromais e hematopoiéticas, o que se manifesta por uma redução no período pós-operatório de restauração da hematopoiese e uma diminuição no número de desfechos fatais devido à destruição não seletiva de células cancerígenas regionais e circulantes, nas quais as células hematopoiéticas progenitoras do próprio paciente também morrem. As perspectivas de utilização de MSCs e outras células progenitoras mesenquimais multipotentes na prática clínica devem-se à relativa facilidade de obtenção a partir de aspirados de medula óssea, expansão em cultura e transfecção de genes terapêuticos. Ao mesmo tempo, a implantação local de células progenitoras mesenquimais multipotentes pode ser utilizada para compensar defeitos teciduais locais e, em caso de disfunções sistêmicas de tecidos de origem mesenquimal, sua introdução na corrente sanguínea geral não está excluída.

Os autores de trabalhos que analisam as perspectivas de utilização de células-tronco mesenquimais (MSCs) para transplantes locais, sistêmicos e terapia gênica sob a ótica da biologia celular estromal são mais cautelosos em seu raciocínio. A medula óssea pós-natal é tradicionalmente considerada um órgão constituído por dois sistemas principais de linhagens celulares claramente definidas: o próprio tecido hematopoiético e o estroma de suporte a ele associado. Portanto, as células-tronco mesenquimais da medula óssea foram inicialmente consideradas exclusivamente como fonte de base estromal para a produção de fatores reguladores do microambiente hematopoiético. Posteriormente, a atenção dos pesquisadores se voltou para o estudo do papel das MSCs como fonte de tecido esquelético. Os dados mais recentes indicam um potencial inesperado para a diferenciação de células estromais da medula óssea com a formação de tecido neural ou muscular. Em outras palavras, as células-tronco mesenquimais exibem plasticidade transgermânica – a capacidade de se diferenciar em tipos celulares fenotipicamente não relacionados às células do tecido original. Ao mesmo tempo, alguns aspectos da biologia das células estromais da medula óssea permanecem obscuros e sem solução, tanto em termos biológicos gerais quanto em detalhes individuais, incluindo a identificação, natureza, origem, desenvolvimento e função in vivo das células estromais da medula óssea, bem como o potencial de diferenciação permissível ex vivo e as possibilidades de uso terapêutico in vivo. Os dados obtidos sobre o potencial das células-tronco mesenquimais (MSCs), bem como os resultados de estudos sobre o potencial regenerativo de outras células-tronco, estão em forte contradição com os dogmas estabelecidos na biologia.

Quando cultivadas em baixa densidade, as células-tronco estromais da medula óssea formam colônias distintas, cada uma derivada de uma única célula progenitora. A porcentagem de células progenitoras estromais em células nucleadas da medula óssea, determinada pela capacidade de formação de colônias, é altamente dependente das condições de cultura e da espécie de MSC. Por exemplo, em roedores, a presença de células alimentadoras de medula óssea irradiadas e soro na cultura é absolutamente necessária para obter o número máximo de células progenitoras estromais, enquanto em humanos, a eficiência de formação de colônias das células-tronco mesenquimais é independente tanto do alimentador quanto do meio de cultura. O número de fatores mitogênicos conhecidos que estimulam a proliferação de células progenitoras estromais é limitado. Estes incluem PDGF, EGF, FGF, TGF-b e IGF1. Sob condições ótimas de cultura, as linhagens policlonais de MSC podem suportar mais de 50 divisões celulares in vitro, tornando possível obter bilhões de células estromais da medula óssea a partir de 1 ml de seu aspirado.

No entanto, a população de células estromais da medula óssea é heterogênea, o que se manifesta tanto pela variabilidade no tamanho das colônias, diferentes taxas de sua formação e uma variedade de morfologia celular, que abrange desde células fusiformes semelhantes a fibroblastos até grandes células planas. Durante o desenvolvimento dessas culturas, a heterogeneidade fenotípica também é observada após 20 dias. Algumas colônias são caracterizadas por alta expressão de fosfatase alcalina, outras não a expressam de forma alguma, e colônias do terceiro tipo são fosfatase-positivas na região central e fosfatase-negativas na periferia. Colônias individuais formam nódulos de tecido ósseo (o início da mineralização da matriz é marcado pela coloração com vermelho de alizarina ou para cálcio, de acordo com Van Koss). Em outras colônias, ocorre acúmulo de gordura, identificado pela coloração G com vermelho de óleo. Menos frequentemente, colônias de células-tronco mesenquimais formam cartilagens coradas com azul de Alcian).

Após transplante ectópico em animais experimentais, linhagens policlonais de MGK formam osso ectópico com estroma reticular associado à mielopoiese e adipócitos e, menos comumente, a tecido cartilaginoso. Quando linhagens monoclonais de células estromais da medula óssea são transplantadas, observa-se quimerismo em alguns casos, nos quais o osso de novo consiste em células de tecido ósseo, contém estroma e adipócitos de origem do doador, enquanto as células da linhagem hematopoiética e do sistema vascular são derivadas do receptor.

Os resultados desses estudos confirmam a natureza-tronco da célula progenitora estromal da medula óssea da qual a linhagem clonal foi derivada. Eles também indicam que nem todas as células clonogênicas em cultura são células-tronco verdadeiramente multipotentes. Alguns pesquisadores acreditam, e nós compartilhamos sua opinião, que as informações mais confiáveis sobre o real potencial de diferenciação de clones individuais só podem ser obtidas in vivo após o transplante, e não pela determinação do fenótipo de seus derivados in vitro. A expressão em cultura de marcadores fenotípicos de osteo, condro ou adipogênese (determinados por mRNA ou por técnicas histoquímicas) e mesmo a produção de matriz mineralizada não refletem o grau de pluripotência de um clone individual in vivo. Portanto, a identificação de células-tronco em um grupo de células estromais só é possível a posteriori, sob as condições apropriadas de um ensaio de transplante biológico. Em particular, a condrogênese é muito raramente observada em sistemas de transplante abertos, enquanto a formação de cartilagem está longe de ser incomum em sistemas fechados, como câmaras de difusão ou culturas in vitro de micromassa de células estromais, onde se obtém baixa tensão local de oxigênio, o que promove a formação de tecido cartilaginoso. Portanto, mesmo a técnica de transplante, bem como as condições inespecíficas de cultura in vitro, afetam significativamente a amplitude da diferenciação das CTMs.

O transplante experimental sob condições experimentais específicas é o padrão-ouro para determinar o potencial de diferenciação das células estromais da medula óssea e um elemento-chave em sua identificação. Historicamente, os estudos sobre transplante de células estromais da medula óssea estão associados ao problema geral do transplante de medula óssea. Foi estabelecido que o microambiente hematopoiético é criado pelo transplante de linhagens de células estromais da medula óssea e proporciona o desenvolvimento ectópico do tecido hematopoiético na zona de transplante. A origem do microambiente do doador e do tecido hematopoiético do hospedeiro nos permite considerar o osso ectópico como um verdadeiro transplante de medula óssea "invertido". O transplante local de células estromais da medula óssea promove a correção eficaz de defeitos ósseos, mais pronunciada do que com a regeneração reparativa espontânea. Vários estudos pré-clínicos em modelos experimentais demonstraram de forma convincente a possibilidade de usar transplantes de células estromais da medula óssea em ortopedia, embora o trabalho e a análise mais cuidadosos sejam necessários para otimizar esses métodos, mesmo nos casos mais simples. Em particular, as condições ótimas para a expansão de células estromais osteogênicas ex vivo ainda não foram estabelecidas, a estrutura e a composição do transportador ideal, bem como o número de células necessárias para a regeneração óssea volumétrica, permanecem pouco desenvolvidos.

Além do uso de células estromais da medula óssea expandidas ex vivo para a regeneração de tecidos de origem mesenquimal, a plasticidade não convencional das CTMs abre potenciais aplicações para a regeneração de células neurais ou a administração de produtos gênicos ao SNC. Em princípio, isso simplifica a terapia celular para lesões no sistema nervoso, uma vez que não há necessidade de obter células-tronco neurais humanas autólogas. Foram relatadas potenciais aplicações de células da medula óssea para a geração de cardiomiócitos e células progenitoras miogênicas de origem estromal verdadeira e extraestromal.

Experimentos estão sendo conduzidos com transplante sistêmico de células estromais da medula óssea para o tratamento de doenças esqueléticas comuns. Não há dúvida de que as células estromais da medula óssea são a população responsável por distúrbios genéticos em doenças esqueléticas, o que é bem ilustrado pela transferência vetorial de informação genética usando essas células, que leva à formação de tecido ósseo patológico em animais experimentais. No entanto, a capacidade das células estromais de se implantar, enxertar, proliferar e se diferenciar em ossos esqueléticos após a introdução na corrente sanguínea geral ainda não foi comprovada.

Isso ocorre, em parte, porque, no transplante padrão de medula óssea, o estroma não é transplantado juntamente com o tecido hematopoiético, de modo que critérios rigorosos para avaliar o sucesso do enxerto de células estromais administradas sistemicamente ainda precisam ser desenvolvidos. Deve-se lembrar que a presença de genes marcadores em extratos de tecido ou o isolamento de células de origem do doador em cultura não indica o enxerto das células, mas apenas sua sobrevivência. Mesmo a injeção intra-arterial de células estromais da medula óssea em um membro de camundongo pode levar a um enxerto praticamente nulo, apesar do fato de que células de origem do doador são encontradas em grande número na microvasculatura da medula óssea. Infelizmente, tais células são geralmente descritas como "enxertadas" simplesmente com base na detecção de genes marcadores para células do doador em cultura ex vivo. Além disso, devem ser fornecidas evidências convincentes da integração a longo prazo de células diferenciadas e funcionalmente ativas de origem do doador nos tecidos em estudo. Em muitos artigos publicados que relatam o enxerto de células estromais da medula óssea no esqueleto, a ausência de dados claros desse tipo é impressionante. Entretanto, deve-se notar que alguns experimentos corretos com animais de fato estabeleceram um enxerto limitado, mas real, de células progenitoras estromais após sua administração sistêmica.

Esses dados são consistentes com os resultados de estudos sobre a possibilidade de entrega de células progenitoras miogênicas da medula óssea ao músculo através do sistema vascular. No entanto, não se deve esquecer que tanto o tecido esquelético quanto o muscular são formados durante o desenvolvimento e o crescimento com base em movimentos celulares extravasculares que utilizam processos de migração que não envolvem a circulação sanguínea. Se existir uma via circulatória independente para a entrega de células progenitoras aos tecidos em fase sólida, é possível presumir a existência de células progenitoras mesenquimais circulantes fisiológicas? Qual é a origem dessas células, tanto no organismo em desenvolvimento quanto no pós-natal, e como elas penetram na parede vascular? A solução dessas questões parece absolutamente necessária e requer a mais cuidadosa análise pré-clínica. Mesmo após as respostas a essas perguntas serem encontradas, aspectos cinéticos problemáticos associados ao crescimento esquelético e à remodelação do tecido conjuntivo permanecerão sem solução. Ao mesmo tempo, o tratamento de distúrbios da osteogênese pela substituição de toda a população de células progenitoras esqueléticas mutadas por elementos estromais saudáveis parece ser uma perspectiva clínica real. Neste caso, zonas de fratura locais ou deformações devido à osteogênese patológica, bem como alterações destrutivas no tecido ósseo, podem ser corrigidas com células-tronco estromais cultivadas in vitro. Portanto, é aconselhável concentrar pesquisas futuras nos problemas de transformação ou correção genética de células progenitoras osteogênicas autólogas mutadas ex vivo.

A engenharia genética de células, de curto ou longo prazo, tornou-se a base da biologia celular e molecular, fonte de muitas descobertas científicas sobre o papel de proteínas individuais no metabolismo celular in vitro e in vivo. O uso de tecnologias moleculares para a correção de patologias hereditárias e doenças humanas é muito promissor para a medicina prática, uma vez que as propriedades das células-tronco estromais da medula óssea possibilitam o desenvolvimento de esquemas de transplante exclusivos para a correção de doenças genéticas do esqueleto. Ao mesmo tempo, células precursoras mesenquimais podem ser facilmente obtidas do futuro receptor, são passíveis de manipulação genética e capazes de se multiplicar em grandes quantidades em um curto período de tempo. O uso de células-tronco mesenquimais permite evitar as limitações e os riscos associados à entrega de material de informação genética diretamente ao paciente por meio de construções de vetores intravasculares. Uma estratégia semelhante é aplicável às células-tronco embrionárias, mas células estromais da medula óssea pós-natais autólogas são um material mais preferível, uma vez que sua introdução exclui possíveis complicações imunológicas pós-transplante. Para obter um efeito de curto prazo, por exemplo, para acelerar a regeneração óssea, o método mais adequado é a modificação genética de células-tronco mesenquimais usando eletroporação, fusão química, lipofecção, plasmídeos e construções adenovirais. Em particular, a transfecção viral em células estromais da medula óssea BMP-2 provou ser eficaz na aceleração da regeneração óssea em politraumatizados experimentais. A criação de construções de vetores adenovirais é preferível devido à ausência de toxicidade. No entanto, a modificação genética de células estromais da medula óssea, neste caso, é caracterizada por uma estabilidade extremamente baixa. Além disso, células estromais da medula óssea transformadas normais requerem o uso de vetores portadores de informação genética que são 10 vezes mais infecciosos do que outros tipos de células, o que aumenta significativamente a porcentagem de morte das células transfectadas.

O tratamento de doenças recessivas causadas por baixa ou nula atividade biológica de certos genes requer modificação de longo prazo ou permanente de células-tronco mesenquimais, o que requer o uso de vírus adeno-associados, retrovírus, lentivírus ou quimeras adeno-retrovirais. As regiões de transporte desses vírus são capazes de transferir grandes transfectos de DNA (até 8 kb). A literatura científica já relatou a atividade biológica exógena de células estromais da medula óssea transfectadas com construções retrovirais que codificam a síntese de moléculas reguladoras e marcadoras - IL-3, CD2, fator VIII, bem como enzimas envolvidas na síntese de L-DOPA. No entanto, mesmo nesses estudos, os autores apontam uma série de limitações que precisam ser superadas antes da aplicação prática dessa tecnologia. O primeiro problema é otimizar o processo de modificação de MSC ex vivo. Sabe-se que a proliferação de longo prazo (3-4 semanas) de células estromais da medula óssea in vitro reduz sua transfecção. Ao mesmo tempo, para atingir um alto nível de modificação genética das MSCs, é necessário realizar vários ciclos de transfecção. O segundo problema está associado à duração da expressão gênica terapêutica, que ainda não excede quatro meses. Uma diminuição natural na expressão gênica efetiva se deve à inativação do promotor e à morte das células modificadas. Dadas as perspectivas gerais de transferência de informação genética usando células-tronco mesenquimais, os resultados de estudos preliminares indicam a necessidade de maior otimização dos métodos de transfecção ex vivo, a escolha de um promotor adequado que regule a atividade biológica na direção desejada e um aumento na capacidade das células estromais da medula óssea modificadas de se automanterem in vivo após o transplante. Deve-se notar que o uso de construções retrovirais para modificar células estromais da medula óssea na direção desejada nem sempre requer seu enxerto obrigatório. As células-tronco mesenquimais transfectadas podem desempenhar uma função corretiva em um contexto de residência estável e sem incorporação física ativa obrigatória e funcionamento no tecido conjuntivo. Neste caso, devem ser considerados como uma minibomba biológica produtora in vivo de um fator cuja deficiência determina a manifestação de patologia genética.

O uso de células estromais de medula óssea transformadas para o tratamento de patologia genética dominante, caracterizada pela expressão de um gene com atividade biológica patológica ou anormal, é muito mais problemático, pois, nesse caso, é necessário bloquear a transferência ou implementação de informação genética distorcida. Um dos métodos de engenharia genética é a recombinação homóloga de células-tronco embrionárias para criar animais transgênicos. No entanto, o grau extremamente baixo de recombinação homóloga, em combinação com os problemas de identificação, separação e expansão de tais recombinantes, dificilmente contribuirá para o uso generalizado desse método em um futuro próximo, mesmo que novos métodos tecnológicos sejam desenvolvidos. A segunda abordagem na terapia gênica de patologia dominante baseia-se na correção automática de DNA danificado, uma vez que mutações genéticas podem ser corrigidas pela introdução de DNA exógeno com a sequência desejada (oligonucleotídeos curtos de DNA ou oligonucleotídeos quiméricos de RNA/DNA), que se liga a homólogos no genoma danificado. A terceira opção envolve o bloqueio da transmissão de informações patológicas, o que é obtido por meio do uso de oligonucleotídeos especificamente projetados que se ligam a um gene específico para formar uma estrutura helicoidal ternária que elimina a possibilidade de transcrição.

Embora a correção de uma doença genética no nível do genoma continue sendo o método terapêutico mais ideal e preferido, o mRNA também é um vetor promissor (possivelmente ainda mais acessível) para bloquear um gene negativo dominante. Moléculas de proteína com oligonucleotídeos antisense ou sequências completas que bloqueiam a ligação do mRNA ao aparato biossintético celular têm sido usadas há muito tempo para inibir a tradução e/ou aumentar a degradação do mRNA. Além disso, o RNA de fita dupla induz a rápida degradação do mRNA, cujo mecanismo permanece obscuro. No entanto, é improvável que a mera eliminação de mRNAs transcritos de um alelo mutante com mutações curtas ou únicas promova a expressão do mRNA do alelo normal. Uma alternativa é o uso de ribossínteses em cabeça de martelo e grampo de cabelo, que têm a capacidade de se ligar a regiões altamente específicas do mRNA com subsequente indução de sua clivagem e inativação durante a tradução. A possibilidade de usar esse método na terapia da osteogênese patológica está sendo estudada atualmente. Independentemente de qual seja exatamente o alvo - elementos genômicos ou citoplasmáticos, o sucesso das novas tecnologias de terapia genética será determinado pela eficiência da inclusão de reagentes em células estromais da medula óssea ex vivo, pela escolha ideal de um vetor específico e pela capacidade estável das células-tronco mesenquimais de expressar os fatores necessários in vivo.

Assim, a descoberta das células-tronco mesenquimais, com suas propriedades inesperadas, cria um novo esquema conceitual para o desenvolvimento de linhagens celulares. No entanto, pesquisas interdisciplinares adicionais são necessárias para compreender o papel biológico das células-tronco estromais, sua natureza, sua capacidade de transdiferenciação ou desdiferenciação, sua importância fisiológica durante o desenvolvimento embrionário, o crescimento pós-natal, a maturação e o envelhecimento, bem como em doenças humanas.