Limitações, perigos e complicações do transplante de células

A medicina plástica regenerativa se baseia na implementação clínica das propriedades toti e pluripotentes das células-tronco embrionárias e progenitoras, que permitem a criação in vitro e in vivo de linhas celulares específicas que repovoam tecidos e órgãos danificados de uma pessoa doente.

A real possibilidade de utilização de células-tronco embrionárias e de tecidos definitivos (as chamadas células-tronco "adultas") de humanos para fins terapêuticos é inquestionável. No entanto, especialistas das Academias Nacional e Médica dos EUA (Stem cells and the future regenerative medicine, National Academy Press) e do Instituto Nacional de Saúde dos EUA (Stem cells and the future research directions, Nat. Inst. of Health USA) recomendam um estudo mais detalhado das propriedades das células-tronco em experimentos com modelos biológicos adequados e uma avaliação objetiva de todas as consequências do transplante, para só então utilizar as células-tronco na clínica.

Foi estabelecido que as células-tronco fazem parte dos derivados teciduais de todas as três camadas germinativas. As células-tronco são encontradas na retina, córnea, epiderme da pele, medula óssea e sangue periférico, nos vasos sanguíneos, polpa dentária, rins, epitélio gastrointestinal, pâncreas e fígado. Usando métodos modernos, foi comprovado que as células-tronco neurais estão localizadas no cérebro e na medula espinhal de um adulto. Esses dados sensacionais atraíram atenção especial de cientistas e da mídia, uma vez que os neurônios no cérebro serviram como um exemplo clássico de uma população celular estática que não é restaurada. Tanto nos períodos iniciais quanto tardios da ontogênese, neurônios, astrócitos e oligodendrócitos são formados no cérebro de animais e humanos devido às células-tronco neurais (Células-tronco: progresso científico e direções futuras de pesquisa. Instituto Nacional de Saúde dos EUA).

No entanto, em condições normais, a plasticidade das células-tronco de tecidos definitivos não se manifesta. Para atingir o potencial plástico das células-tronco de tecidos definitivos, elas devem ser isoladas e cultivadas em meios com citocinas (LIF, EGF, FGF). Além disso, os derivados de células-tronco só enxertam com sucesso quando transplantados para o corpo de um animal com sistema imunológico deprimido (irradiação γ, citostáticos, bussulfano, etc.). Até o momento, não há evidências convincentes da implementação da plasticidade das células-tronco em animais que não foram expostos à radiação ou a outros efeitos que causem imunossupressão profunda.

Nessas condições, o potencial perigoso das CTEs se manifesta, primeiramente, durante seu transplante para áreas ectópicas – durante a injeção subcutânea de CTEs em camundongos imunodeficientes, formam-se teratocarcinomas no local da injeção. Além disso, durante o desenvolvimento do embrião humano, a frequência de anormalidades cromossômicas é maior do que na embriogênese animal. No estágio de blastocisto, apenas 20 a 25% dos embriões humanos consistem em células com cariótipo normal, e a esmagadora maioria dos embriões humanos iniciais obtidos após fertilização in vitro exibem mosaicismo cromossômico caótico e, com muita frequência, apresentam aberrações numéricas e estruturais.

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Efeitos benéficos das células-tronco

Resultados preliminares de ensaios clínicos confirmam o efeito benéfico das células-tronco no paciente, mas ainda não há informações sobre os efeitos a longo prazo do transplante de células. A literatura inicial era dominada por relatos de resultados positivos do transplante de fragmentos cerebrais embrionários na doença de Parkinson, mas depois começaram a surgir dados que negavam o efeito terapêutico eficaz do tecido nervoso embrionário ou fetal transplantado para o cérebro de pacientes.

Em meados do século XX, a restauração da hematopoiese em animais irradiados letalmente após transfusão intravenosa de células da medula óssea foi descoberta pela primeira vez e, em 1969, o pesquisador americano D. Thomas realizou o primeiro transplante de medula óssea em humanos. A falta de conhecimento sobre os mecanismos de incompatibilidade imunológica das células da medula óssea do doador e do receptor naquela época levou a uma alta mortalidade devido à falha frequente do transplante e ao desenvolvimento da reação enxerto versus hospedeiro. A descoberta do complexo principal de histocompatibilidade, que inclui antígenos leucocitários humanos (HbA), e o aprimoramento de seus métodos de tipagem tornaram possível aumentar significativamente a sobrevida após o transplante de medula óssea, o que levou ao uso generalizado desse método de tratamento em oncohematologia. Uma década depois, foram realizados os primeiros transplantes de células-tronco hematopoiéticas (CTHs) obtidas de sangue periférico por leucaférese. Em 1988, o sangue do cordão umbilical foi usado pela primeira vez como fonte de HSCs na França para tratar uma criança com anemia de Fanconi e, desde o final de 2000, relatos têm aparecido na imprensa sobre a capacidade das HSCs de se diferenciarem em células de vários tipos de tecido, o que potencialmente expande o escopo de sua aplicação clínica. No entanto, descobriu-se que o material de transplante, juntamente com as HSCs, contém um número significativo de impurezas celulares não hematopoiéticas de várias naturezas e propriedades. Nesse sentido, métodos para purificação do transplante e critérios para avaliar sua pureza celular estão sendo desenvolvidos. Em particular, a imunosseleção positiva de células CD34+ é usada, o que permite o isolamento de HSCs usando anticorpos monoclonais.

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Complicações da terapia com células-tronco

As complicações no transplante de medula óssea são, na maioria das vezes, hematológicas e associadas a um longo período de pancitopenia iatrogênica. Complicações infecciosas, anemia e hemorragias se desenvolvem com mais frequência. Nesse sentido, é extremamente importante selecionar o modo ideal de coleta, processamento e armazenamento da medula óssea para a máxima preservação das células-tronco, o que garantirá a restauração rápida e estável da hematopoiese. Ao caracterizar um transplante, os seguintes parâmetros são atualmente comumente avaliados: o número de células mononucleares e/ou nucleadas, unidades formadoras de colônias e o conteúdo de células CD34 positivas. Infelizmente, esses indicadores fornecem apenas uma avaliação indireta da real capacidade hematopoiética da população de células-tronco do transplante. Atualmente, não existem parâmetros absolutamente precisos para determinar a suficiência de um transplante para a restauração a longo prazo da hematopoiese em pacientes, mesmo com transplante autólogo de medula óssea. O desenvolvimento de critérios gerais é extremamente difícil devido à falta de padrões rigorosos para processamento, criopreservação e testes do transplante. Além disso, é necessário levar em consideração toda a variedade de fatores que influenciam os parâmetros do restabelecimento bem-sucedido da hematopoiese em cada paciente. No transplante autólogo de medula óssea, os mais importantes são o número de ciclos de quimioterapia anteriores, as características do regime de condicionamento, o período da doença em que a medula óssea foi coletada e os esquemas de uso de fatores estimuladores de colônias no período pós-transplante. Além disso, não se deve esquecer que a quimioterapia que antecede a coleta do transplante pode ter um efeito negativo sobre as células-tronco da medula óssea.

A incidência de complicações tóxicas graves aumenta significativamente durante o transplante alogênico de medula óssea. Nesse sentido, dados estatísticos sobre o transplante alogênico de medula óssea na talassemia são de interesse. Os relatórios do Grupo Europeu de Transplante de Medula Óssea registraram cerca de 800 transplantes de medula óssea em pacientes com talassemia major. O transplante alogênico na talassemia é realizado na grande maioria dos casos a partir de irmãos HLA-idênticos, o que está associado a complicações graves e alta mortalidade durante o transplante de material de células-tronco de doadores parcialmente compatíveis, aparentados ou não aparentados. Para minimizar o risco de complicações infecciosas fatais, os pacientes são colocados em caixas assépticas isoladas com fluxo de ar laminar e recebem uma dieta hipobacteriana ou abacteriana. Para a descontaminação bacteriana do intestino, formas não reabsorvíveis de antibióticos e antifúngicos são prescritas por via oral. Para profilaxia, a anfotericina B é administrada por via intravenosa. A prevenção de infecções sistêmicas é reforçada com amicacina e ceftazidima, prescritas na véspera do transplante, continuando o tratamento até a alta do paciente. Todos os hemoderivados são irradiados a uma dose de 30 Gy antes da transfusão. A nutrição parenteral durante o transplante é uma condição necessária e inicia-se imediatamente após a restrição alimentar natural.

Uma série de complicações está associada à alta toxicidade dos medicamentos imunossupressores, que frequentemente causam náuseas, vômitos e mucosite, danos renais e pneumonia intersticial. Uma das complicações mais graves da quimioterapia é a doença veno-oclusiva do fígado, que leva à morte no período pós-transplante precoce. Os fatores de risco para trombose das veias do sistema porta do fígado incluem a idade dos pacientes, a presença de hepatite e fibrose hepática, bem como a terapia imunossupressora após o transplante de medula óssea. A doença veno-oclusiva é especialmente perigosa na talassemia, que é acompanhada por hemossiderose hepática, hepatite e fibrose – acompanhantes frequentes da terapia transfusional. A trombose das veias do sistema porta do fígado se desenvolve 1 a 2 semanas após o transplante e é caracterizada por um rápido aumento no conteúdo de bilirrubina e atividade das transaminases no sangue, progressão da hepatomegalia, ascite, encefalopatia e dor na parte superior do abdômen. Histologicamente, o material da autópsia revela dano endotelial, hemorragias subendoteliais, dano aos hepatócitos centrolobulares e obstrução trombótica das vênulas e veias centrais do fígado. Casos de parada cardíaca fatal associados aos efeitos tóxicos de citostáticos foram descritos em pacientes com talassemia.

Durante o período pré-transplante, a ciclofosfamida e o bussulfano frequentemente causam cistite tóxico-hemorrágica com alterações patológicas nas células uroepiteliais. O uso de ciclosporina A no transplante de medula óssea é frequentemente acompanhado de nefrotoxicidade e neurotoxicidade, síndrome hipertensiva, retenção de líquidos e citólise de hepatócitos. Disfunções sexuais e reprodutivas são mais frequentemente observadas em mulheres. Em crianças pequenas, o desenvolvimento puberal geralmente não é afetado após o transplante, mas em crianças mais velhas, a patologia do desenvolvimento da área genital pode ser muito grave, chegando à esterilidade. Complicações diretamente relacionadas ao transplante em si incluem rejeição de células alogênicas da medula óssea, incompatibilidade ABO e formas agudas e crônicas da doença do enxerto contra o hospedeiro.

Em pacientes com transplante de medula óssea ABO-incompatível, as isoaglutininas do doador ABO versus hospedeiro são produzidas por 330 a 605 dias após o transplante, o que pode levar à hemólise prolongada e aumentar drasticamente a necessidade de transfusões de sangue. Essa complicação é prevenida pela transfusão apenas de hemácias tipo 0. Após o transplante, alguns pacientes apresentam neutropenia autoimune, trombocitopenia ou pancitopenia, que requerem esplenectomia para correção.

Em 35-40% dos receptores, a doença enxerto versus hospedeiro aguda se desenvolve dentro de 100 dias após o transplante alogênico de medula óssea HLA-idêntica. O grau de envolvimento da pele, fígado e intestino varia de erupção cutânea, diarreia e hiperbilirrubinemia moderada a descamação da pele, obstrução intestinal e insuficiência hepática aguda. Em pacientes com talassemia, a incidência de doença enxerto versus hospedeiro aguda grau I após o transplante de medula óssea é de 75%, e de grau II e superior é de 11-53%. A doença enxerto versus hospedeiro crônica como uma síndrome sistêmica de múltiplos órgãos geralmente se desenvolve dentro de 100-500 dias após o transplante alogênico de medula óssea em 30-50% dos pacientes. A pele, a cavidade oral, o fígado, os olhos, o esôfago e o trato respiratório superior são afetados. É feita uma distinção entre uma forma limitada de doença enxerto versus hospedeiro crônica, quando a pele e/ou o fígado são afetados, e uma forma disseminada, quando lesões cutâneas generalizadas são combinadas com hepatite crônica agressiva, lesões nos olhos, glândulas salivares ou qualquer outro órgão. A morte é frequentemente causada por complicações infecciosas resultantes de imunodeficiência grave. Na talassemia, uma forma leve de doença enxerto versus hospedeiro crônica ocorre em 12%, uma forma moderada em 3% e uma forma grave em 0,9% dos receptores de medula óssea alogênica compatível com HLA. Uma complicação grave do transplante de medula óssea é a rejeição do enxerto, que se desenvolve de 50 a 130 dias após a cirurgia. A frequência da rejeição depende do regime de condicionamento. Em particular, em pacientes com talassemia que receberam apenas metotrexato durante o período de preparação, a rejeição do transplante de medula óssea foi observada em 26% dos casos, com uma combinação de metotrexato com ciclosporina A - em 9% dos casos, e com a administração apenas de ciclosporina A - em 8% dos casos (Gaziev et al., 1995).

As complicações infecciosas após o transplante de medula óssea são causadas por vírus, bactérias e fungos. Seu desenvolvimento está associado à neutropenia profunda induzida por quimioterápicos durante o período de condicionamento, danos às barreiras mucosas por citostáticos e à reação enxerto versus hospedeiro. Dependendo do tempo de desenvolvimento, distinguem-se três fases de complicações infecciosas. Na primeira fase (que se desenvolve no primeiro mês após o transplante), predominam os danos às barreiras mucosas e a neutropenia, frequentemente acompanhadas de infecções virais (herpes, vírus Epstein-Barr, citomegalovírus, varicela-zóster), bem como infecções causadas por bactérias gram-positivas e gram-negativas, fungos Candida e aspergilose. No período pós-transplante inicial (segundo e terceiro meses após o transplante), a infecção mais grave é a por citomegalovírus, que frequentemente leva à morte dos pacientes na segunda fase de complicações infecciosas. Na talassemia, a infecção por citomegalovírus após o transplante de medula óssea se desenvolve em 1,7% a 4,4% dos receptores. A terceira fase é observada no período pós-transplante tardio (três meses após a operação) e é caracterizada por imunodeficiência combinada grave. Infecções causadas por varicela-zóster, estreptococos, Pneumocystis carinii, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae e vírus hepatotrópicos são comuns durante esse período. Na talassemia, a mortalidade em pacientes após transplante de medula óssea está associada a sepse bacteriana e fúngica, pneumonia intersticial idiopática e pneumonia por citomegalovírus, síndrome do desconforto respiratório agudo, insuficiência cardíaca aguda, tamponamento cardíaco, hemorragia cerebral, doença hepática veno-oclusiva e doença enxerto versus hospedeiro aguda.

Atualmente, alguns sucessos foram alcançados no desenvolvimento de métodos para isolar populações puras de células-tronco hematopoiéticas da medula óssea. A técnica para obter sangue fetal do cordão umbilical foi aprimorada e métodos para isolar células hematopoiéticas do sangue do cordão umbilical foram criados. Há relatos na imprensa científica de que células-tronco hematopoiéticas são capazes de se multiplicar quando cultivadas em meios com citocinas. Ao utilizar biorreatores especialmente projetados para a expansão de células-tronco hematopoiéticas, a biomassa de células-tronco hematopoiéticas isoladas da medula óssea, sangue periférico ou do cordão umbilical aumenta significativamente. A possibilidade de expandir células-tronco hematopoiéticas é um passo importante para o desenvolvimento clínico do transplante de células.

No entanto, antes da propagação in vitro de células-tronco hematopoiéticas, é necessário isolar uma população homogênea de células-tronco hematopoiéticas. Isso geralmente é obtido usando marcadores que permitem a marcação seletiva de células-tronco hematopoiéticas com anticorpos monoclonais covalentemente ligados a um marcador fluorescente ou magnético e seu isolamento usando um classificador de células apropriado. Ao mesmo tempo, a questão das características fenotípicas das células-tronco hematopoiéticas não foi definitivamente resolvida. A. Petrenko e V. Grishchenko (2003) consideram células com antígenos CD34, AC133 e Thyl em sua superfície e sem CD38, HLA-DR ou outros marcadores de diferenciação (células com o fenótipo CD34+Liir) como candidatas a células-tronco hematopoiéticas. Os marcadores de linhagem (Lin) incluem glicoforina A (GPA), CD3, CD4, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19 e CD20 (Muench, 2001). Células com fenótipo CD34+CD45RalüW CD71low, bem como fenótipo CD34+Thyl+CD38low/c-kit/low, são consideradas promissoras para transplante.

A questão do número de células-tronco hematopoiéticas suficiente para um transplante eficaz permanece problemática. Atualmente, as fontes de células-tronco hematopoiéticas são a medula óssea, o sangue periférico e do cordão umbilical e o fígado embrionário. A expansão das células-tronco hematopoiéticas é alcançada cultivando-as na presença de células endoteliais e fatores de crescimento hematopoiéticos. Em vários protocolos, mieloproteínas, SCF, eritropoietina, fatores de crescimento semelhantes à insulina, corticosteroides e estrogênios são usados para induzir a proliferação de HSC. Ao usar combinações de citocinas in vitro, é possível obter um aumento significativo no pool de HSC, com um pico em sua produção ao final da segunda semana de cultivo.

Tradicionalmente, o transplante de células-tronco hematopoiéticas do sangue de cordão umbilical é utilizado principalmente para hemoblastoses. No entanto, a dose mínima de células hematopoiéticas necessária para o sucesso do transplante de células do sangue de cordão umbilical é de 3,7 x 107 ^células nucleadas por 1 kg de peso corporal do receptor. O uso de um número menor de células-tronco hematopoiéticas do sangue de cordão umbilical aumenta significativamente o risco de falha do enxerto e recidiva da doença. Portanto, o transplante de células-tronco hematopoiéticas do sangue de cordão umbilical é utilizado principalmente para tratar hemoblastoses em crianças.

Infelizmente, ainda não existem padrões para a aquisição ou protocolos padronizados para o uso clínico de células hematopoiéticas do sangue de cordão umbilical. Consequentemente, as células-tronco do sangue de cordão umbilical em si não são uma fonte legalmente reconhecida de células hematopoiéticas para transplante. Além disso, não existem normas éticas ou legais que regem as atividades e a organização dos bancos de sangue de cordão umbilical, existentes no exterior. Enquanto isso, para um transplante seguro, todas as amostras de sangue de cordão umbilical devem ser cuidadosamente monitoradas. Antes da coleta de sangue de uma gestante, seu consentimento deve ser obtido. Cada gestante deve ser examinada para verificar a presença de HBsAg, a presença de anticorpos contra os vírus da hepatite C, HIV e sífilis. Cada amostra de sangue de cordão umbilical deve ser testada como padrão para o número de células nucleadas, CD34+ e capacidade de formação de colônias. Além disso, são realizadas a tipagem de HbA, a determinação do grupo sanguíneo por ABO e sua pertença pelo fator Rh. Os procedimentos de teste necessários são cultura bacteriológica para esterilidade, testes sorológicos para infecções por HIV-1 e HIV-2, HBsAg, hepatite viral C, infecção por citomegalovírus, HTLY-1 e HTLY-II, sífilis e toxoplasmose. Além disso, a reação em cadeia da polimerase é realizada para detectar infecções por citomegalovírus e HIV. Parece aconselhável complementar os protocolos de teste com uma análise de células-tronco hematopoiéticas (GSC) do sangue do cordão umbilical para detectar doenças genéticas como a-talassemia, anemia falciforme, deficiência de adenosina desaminase, agamaglobulinemia de Bruton, doenças de Hurler e Ponter.

A próxima etapa da preparação para o transplante é a preservação das células-tronco hematopoiéticas. Os procedimentos mais perigosos para a viabilidade das células durante o preparo são o congelamento e o descongelamento. Ao congelar células hematopoiéticas, uma parte significativa delas pode ser destruída devido à formação de cristais. Substâncias especiais – crioprotetores – são utilizadas para reduzir a porcentagem de morte celular. Na maioria das vezes, o DMSO é utilizado como crioprotetor na concentração final de 10%. No entanto, o DMSO nessa concentração é caracterizado por um efeito citotóxico direto, que se manifesta mesmo em condições de exposição mínima. A redução do efeito citotóxico é alcançada pela manutenção rigorosa da temperatura zero do modo de exposição, bem como pelo cumprimento das normas de processamento do material durante e após o descongelamento (velocidade de todas as manipulações, uso de múltiplos procedimentos de lavagem). Concentrações de DMSO inferiores a 5% não devem ser utilizadas, pois isso causa morte maciça de células hematopoiéticas durante o período de congelamento.

A presença de impurezas eritrocitárias na mistura de suspensão de células-tronco hematopoiéticas cria um risco de desenvolvimento de uma reação de incompatibilidade para antígenos eritrocitários. Ao mesmo tempo, quando os eritrócitos são removidos, a perda de células hematopoiéticas aumenta significativamente. Nesse sentido, foi proposto um método de isolamento não fracionado de células-tronco hematopoiéticas. Nesse caso, uma solução de DMSO a 10% e resfriamento a taxa constante (GS/min) a -80 °C são usados para proteger as células nucleadas dos efeitos nocivos de baixas temperaturas, após o que a suspensão celular é congelada em nitrogênio líquido. Acredita-se que esse método de criopreservação resulta em lise parcial dos eritrócitos, portanto, as amostras de sangue não requerem fracionamento. Antes do transplante, a suspensão celular é descongelada, lavada da hemoglobina livre e do DMSO em uma solução de albumina humana ou em soro sanguíneo. A preservação de precursores hematopoiéticos usando este método é de fato maior do que após o fracionamento do sangue do cordão umbilical, mas o risco de complicações transfusionais devido à transfusão de eritrócitos ABO-incompatíveis permanece.

A criação de um sistema de armazenamento de amostras de CTH testadas e tipadas para HLA poderia solucionar os problemas mencionados. No entanto, isso requer o desenvolvimento de normas éticas e legais, que atualmente estão apenas sendo discutidas. Antes da criação de uma rede de armazenamento, é necessário adotar uma série de regulamentos e documentos sobre a padronização dos procedimentos de coleta, fracionamento, teste e tipagem, bem como a criopreservação de CTH. Uma condição obrigatória para o funcionamento eficaz dos bancos de CTH é a organização de uma base de dados informatizada para interação com os registros da Associação Mundial de Doadores de Medula Óssea (WMDA) e do Programa Nacional de Doadores de Medula Óssea dos Estados Unidos (NMDP).

Além disso, é necessário otimizar e padronizar os métodos de expansão in vitro de células-tronco hematopoiéticas (CTHs), principalmente de células hematopoiéticas do sangue de cordão umbilical. A expansão de CTHs do sangue de cordão umbilical é necessária para aumentar o número de potenciais receptores compatíveis com o sistema HLA. Devido aos pequenos volumes de sangue de cordão umbilical, o número de CTHs nele contido geralmente não é suficiente para garantir a repopulação da medula óssea em pacientes adultos. Ao mesmo tempo, para realizar transplantes não relacionados, é necessário ter acesso a um número suficiente de amostras de CTHs tipificadas (de 10.000 a 1.500.000 por receptor).

O transplante de células-tronco hematopoiéticas não elimina as complicações que acompanham o transplante de medula óssea. Análises mostram que, com o transplante de células-tronco do sangue do cordão umbilical, formas graves de doença aguda do enxerto contra o hospedeiro se desenvolvem em 23% dos receptores e formas crônicas em 25% dos receptores. Em pacientes oncohematológicos, recidivas de leucemia aguda durante o primeiro ano após o transplante de células-tronco do sangue do cordão umbilical são observadas em 26% dos casos.

Nos últimos anos, métodos de transplante de células-tronco hematopoiéticas periféricas têm se desenvolvido intensamente. O conteúdo de células-tronco hematopoiéticas (CTH) no sangue periférico é tão pequeno (1 CTH por 100.000 células sanguíneas) que seu isolamento sem preparação especial não faz sentido. Portanto, o doador recebe inicialmente um tratamento medicamentoso para estimular a liberação de células hematopoiéticas da medula óssea no sangue. Para isso, são utilizados medicamentos nada inofensivos, como a ciclofosfamida e o fator estimulador de colônias de granulócitos. Mesmo após o procedimento de mobilização das CTH para o sangue periférico, o conteúdo de células CD34+ não ultrapassa 1,6%.

Para a mobilização de células-tronco hematopoiéticas na clínica, o método mais utilizado é o S-SEC, que se caracteriza por uma tolerância relativamente boa, com exceção da ocorrência quase natural de dor óssea. Deve-se notar que o uso de separadores de sangue modernos permite o isolamento eficaz de células-tronco hematopoiéticas. No entanto, em condições normais de hematopoiese, pelo menos 6 procedimentos devem ser realizados para obter um número suficiente de células-tronco hematopoiéticas com capacidade de repovoamento comparável à suspensão de medula óssea. Cada procedimento requer 10 a 12 litros de sangue para serem processados no separador, o que pode causar trombocitopenia e leucopenia. O procedimento de separação envolve a introdução de um anticoagulante (citrato de sódio) no doador, o que não exclui, no entanto, a ativação de contato das plaquetas durante a centrifugação extracorpórea. Esses fatores criam condições para o desenvolvimento de complicações infecciosas e hemorrágicas. Outra desvantagem do método é a variabilidade significativa da resposta de mobilização, o que requer o monitoramento do conteúdo de HSCs no sangue periférico dos doadores, necessário para determinar seu nível máximo.

O transplante autógeno de células-tronco hematopoiéticas, diferentemente do transplante alogênico, elimina completamente o desenvolvimento de reação de rejeição. No entanto, uma desvantagem significativa do autotransplante de células-tronco hematopoiéticas, que limita o leque de indicações para sua implementação, é a alta probabilidade de reinfusão de células clonais leucêmicas com o transplante. Além disso, a ausência do efeito imunomediado "enxerto versus tumor" aumenta significativamente a frequência de recidivas de doenças hematológicas malignas. Portanto, o único método radical para eliminar a hematopoiese clonal neoplásica e restaurar a hematopoiese policlonal normal nas síndromes mielodisplásicas continua sendo a poliquimioterapia intensiva com transplante de hematopoiese alogênica.

Mas mesmo neste caso, o tratamento para a maioria das hemoblastoses visa apenas aumentar o tempo de sobrevivência dos pacientes e melhorar sua qualidade de vida. De acordo com vários estudos de grande porte, a sobrevivência livre de recidiva a longo prazo após o alotransplante de HSCs é alcançada em 40% dos pacientes oncohematológicos. Ao utilizar células-tronco de um irmão HLA compatível, os melhores resultados são observados em pacientes jovens com um curto histórico da doença, uma contagem de células blásticas de até 10% e citogenética favorável. Infelizmente, a mortalidade associada ao procedimento de alotransplante de HSCs em pacientes com doenças mielodisplásicas permanece alta (na maioria dos relatos - cerca de 40%). Os resultados do trabalho de 10 anos do Programa Nacional de Doadores de Medula Óssea nos EUA (510 pacientes, idade mediana - 38 anos) indicam que a sobrevivência livre de recidiva por dois anos é de 29%, com uma probabilidade relativamente baixa de recidiva (14%). No entanto, a mortalidade associada ao procedimento de alotransplante de células-tronco hematopoiéticas (CTHs) de um doador não aparentado é extremamente alta, chegando a 54% em um período de dois anos. Resultados semelhantes foram obtidos em um estudo europeu (118 pacientes, idade mediana de 24 anos, sobrevida livre de recidiva em dois anos de 28%, recidiva de 35% e mortalidade de 58%).

Durante os tratamentos intensivos de quimioterapia com subsequente restauração da hematopoiese com células hematopoiéticas alogênicas, ocorrem frequentemente complicações imuno-hematológicas e transfusionais. Essas complicações se devem, em grande parte, ao fato de os grupos sanguíneos humanos serem herdados independentemente das moléculas do MHC. Portanto, mesmo que o doador e o receptor sejam compatíveis para os principais antígenos HLA, seus eritrócitos podem apresentar fenótipos diferentes. Distingue-se entre incompatibilidade "maior", quando o receptor possui anticorpos preexistentes contra os antígenos eritrocitários do doador, e incompatibilidade "menor", quando o doador possui anticorpos contra os antígenos eritrocitários do receptor. São possíveis casos de combinação de incompatibilidade "maior" e "menor".

Os resultados de uma análise comparativa da eficácia clínica do alotransplante de células-tronco hematopoiéticas da medula óssea e do sangue do cordão umbilical em hemoblastoses indicam que, em crianças após o alotransplante de células-tronco hematopoiéticas do sangue do cordão umbilical, o risco de desenvolver uma reação enxerto versus hospedeiro é significativamente reduzido, mas um período mais longo de recuperação do número de neutrófilos e plaquetas é observado com uma maior incidência de mortalidade em 100 dias após o transplante.

O estudo das causas de mortalidade precoce permitiu esclarecer as contraindicações ao transplante alogênico de CTH, entre as quais se destacam:

• a presença de testes positivos para infecção por citomegalovírus no receptor ou doador (sem tratamento preventivo);
• doença aguda por radiação;
• a presença ou mesmo suspeita da presença de uma infecção micótica em um paciente (sem realizar profilaxia sistêmica precoce com medicamentos fungicidas);
• hemoblastoses, nas quais os pacientes receberam tratamento de longo prazo com citostáticos (devido à alta probabilidade de parada cardíaca súbita e falência de múltiplos órgãos);
• transplante de doadores HLA não idênticos (sem profilaxia da reação aguda enxerto versus hospedeiro com ciclosporina A);
• hepatite viral crônica C (devido ao alto risco de desenvolver doença veno-oclusiva do fígado).

Assim, o transplante de células-tronco hematopoiéticas (CTH) pode causar complicações graves, que frequentemente levam à morte. No período inicial (até 100 dias após o transplante), estas incluem complicações infecciosas, doença enxerto versus hospedeiro aguda, rejeição do enxerto (falha das CTH do doador), doença hepática veno-oclusiva, bem como danos teciduais causados pela toxicidade do regime de condicionamento, que se caracteriza por uma alta taxa de remodelação (pele, endotélio vascular, epitélio intestinal). As complicações do período pós-transplante tardio incluem doença enxerto versus hospedeiro crônica, recidivas da doença subjacente, retardo de crescimento em crianças, disfunção do sistema reprodutor e da glândula tireoide, e lesões oculares.

Recentemente, em conexão com as publicações sobre a plasticidade das células da medula óssea, surgiu a ideia de usar células-tronco hematopoiéticas (CTHs) para tratar ataques cardíacos e outras doenças. Embora alguns experimentos com animais sustentem essa possibilidade, as conclusões sobre a plasticidade das células da medula óssea precisam ser confirmadas. Essa circunstância deve ser levada em consideração por pesquisadores que acreditam que células de medula óssea humana transplantadas são facilmente transformadas em células do músculo esquelético, do miocárdio ou do SNC. A hipótese de que as CTHs sejam uma fonte celular natural de regeneração desses órgãos requer evidências sólidas.

Em particular, foram publicados os primeiros resultados de um estudo randomizado aberto conduzido por V. Belenkov (2003). Seu objetivo era estudar o efeito da C-SvK (ou seja, mobilização de HSCs autólogas para o sangue) no estado clínico, hemodinâmico e neuro-humoral de pacientes com insuficiência cardíaca crônica moderada a grave, bem como avaliar sua segurança em relação à terapia padrão (inibidores da enzima conversora de angiotensina, betabloqueadores, diuréticos, glicosídeos cardíacos). Na primeira publicação dos resultados do estudo, os autores do programa observam que o único argumento a favor da O-SvK são os resultados do tratamento de um paciente, que apresentou melhora indiscutível em todos os parâmetros clínicos e hemodinâmicos em relação à terapia com este medicamento. Entretanto, a teoria da mobilização de HSC na corrente sanguínea com subsequente regeneração miocárdica na zona pós-infarto não foi confirmada - mesmo em um paciente com dinâmica clínica positiva, a ecocardiografia de estresse com dobutamina não revelou o aparecimento de zonas de miocárdio viável na área da cicatriz.

É importante ressaltar que, atualmente, há dados claramente insuficientes para recomendar a terapia celular de substituição para ampla implementação na prática clínica diária. Estudos clínicos bem delineados e de alta qualidade são necessários para determinar a eficácia de diversas opções de terapia celular regenerativa, desenvolver indicações e contraindicações para a mesma, bem como diretrizes para o uso combinado de terapia regenerativa-plástica e tratamento cirúrgico tradicional ou conservador. Ainda não há resposta para a questão de qual população específica de células da medula óssea (hematopoiéticas-tronco ou estromais) pode dar origem a neurônios e cardiomiócitos, e também não está claro quais condições contribuem para isso in vivo.

Trabalhos nessas áreas estão sendo realizados em muitos países. No resumo do simpósio sobre insuficiência hepática aguda do Instituto Nacional de Saúde dos EUA, entre os métodos promissores de tratamento, além do transplante de fígado, estão o transplante de hepatócitos xenogênicos ou alogênicos e a conexão extracorpórea de biorreatores com células hepáticas. Há evidências diretas de que apenas hepatócitos estranhos funcionalmente ativos são capazes de fornecer suporte eficaz ao fígado do receptor. Para o uso clínico de hepatócitos isolados, é necessário criar um banco de células, o que reduzirá significativamente o tempo entre o isolamento das células e seu uso. O método mais aceitável para criar um banco de hepatócitos isolados é a criopreservação de células hepáticas em nitrogênio líquido. Ao usar essas células na clínica em pacientes com insuficiência hepática aguda e crônica, um efeito terapêutico bastante alto foi demonstrado.

Apesar dos resultados otimistas e encorajadores do transplante de células hepáticas em experimentos e na prática clínica, ainda existem muitos problemas que estão longe de serem resolvidos. Estes incluem um número limitado de órgãos adequados para a obtenção de hepatócitos isolados, métodos insuficientemente eficazes para o seu isolamento, a ausência de métodos padronizados para a preservação de células hepáticas, ideias pouco claras sobre os mecanismos de regulação do crescimento e da proliferação de células transplantadas, a ausência de métodos adequados para avaliar a enxertia ou rejeição de hepatócitos alogênicos. Isso também inclui a presença de imunidade ao transplante ao utilizar células alogênicas e xenogênicas, embora menor do que no transplante hepático ortotópico, mas exigindo o uso de imunossupressores, encapsulamento de hepatócitos isolados ou seu tratamento especial com enzimas. O transplante de hepatócitos frequentemente leva a um conflito imunológico entre o receptor e o doador na forma de uma reação de rejeição, que requer o uso de citostáticos. Uma solução para esse problema pode ser o uso de carreadores microporosos poliméricos para isolar as células hepáticas, o que aumentará sua sobrevivência, uma vez que a membrana da cápsula protege eficazmente os hepatócitos, apesar da imunização do hospedeiro.

No entanto, na insuficiência hepática aguda, esse transplante de hepatócitos é ineficaz devido ao tempo relativamente longo necessário para que as células hepáticas se enxertem em um novo ambiente e atinjam o estágio de funcionamento ideal. Uma possível limitação é a secreção de bile durante o transplante ectópico de hepatócitos isolados e, ao utilizar biorreatores, uma barreira fisiológica significativa é a incompatibilidade de espécies entre as proteínas humanas e as proteínas produzidas por hepatócitos xenogênicos.

Há relatos na literatura de que o transplante local de células-tronco estromais da medula óssea facilita a correção eficaz de defeitos ósseos, e a restauração do tecido ósseo, neste caso, ocorre de forma mais intensiva do que com a regeneração reparadora espontânea. Vários estudos pré-clínicos em modelos experimentais demonstram de forma convincente a possibilidade de usar transplantes de células estromais da medula óssea em ortopedia, embora mais trabalho seja necessário para otimizar esses métodos, mesmo nos casos mais simples. Em particular, as condições ideais para a expansão de células estromais osteogênicas ex vivo ainda não foram encontradas, e a estrutura e a composição de seu transportador ideal (matriz) permanecem indeterminadas. O número mínimo de células necessárias para a regeneração óssea volumétrica não foi determinado.

Foi comprovado que as células-tronco mesenquimais apresentam plasticidade transgermânica, ou seja, a capacidade de se diferenciar em tipos celulares fenotipicamente não relacionados às células da linhagem original. Sob condições ótimas de cultivo, as linhagens policlonais de células-tronco estromais da medula óssea podem suportar mais de 50 divisões in vitro, o que torna possível obter bilhões de células estromais a partir de 1 ml de aspirado de medula óssea. No entanto, a população de células-tronco mesenquimais é heterogênea, o que se manifesta tanto pela variabilidade no tamanho das colônias, diferentes taxas de sua formação, quanto pela diversidade morfológica dos tipos celulares, desde células fusiformes semelhantes a fibroblastos até grandes células planas. A heterogeneidade fenotípica é observada após apenas 3 semanas de cultivo de células-tronco estromais: algumas colônias formam nódulos de tecido ósseo, outras formam aglomerados de adipócitos e outras, mais raras, formam ilhas de tecido cartilaginoso.

O transplante de tecido nervoso embrionário foi inicialmente utilizado para tratar doenças degenerativas do sistema nervoso central. Nos últimos anos, elementos celulares de neuroesferas obtidos de células-tronco neurais têm sido transplantados em vez de tecido cerebral embrionário (Poltavtseva, 2001). As neuroesferas contêm precursores comprometidos de neurônios e neuroglia, o que traz esperança para a restauração de funções cerebrais perdidas após o transplante. Após o transplante de células de neuroesferas dispersas na região estriada do cérebro de ratos, observou-se sua proliferação e diferenciação em neurônios dopaminérgicos, o que eliminou a assimetria motora em ratos com hemiparkinsonismo experimental. No entanto, em alguns casos, tumores se desenvolveram a partir das células de neuroesferas, o que levou à morte dos animais (Bjorklund, 2002).

Na clínica, estudos cuidadosos de dois grupos de pacientes, nos quais nem os pacientes nem os médicos que os observavam sabiam (estudo duplo-cego), que um grupo de pacientes foi transplantado com tecido embrionário com neurônios produtores de dopamina, e o segundo grupo de pacientes foi submetido a uma operação simulada, deram resultados inesperados. Os pacientes que foram transplantados com tecido nervoso embrionário não se sentiram melhor do que os pacientes no grupo de controle. Além disso, 5 de 33 pacientes desenvolveram discinesia persistente 2 anos após o transplante de tecido nervoso embrionário, o que não estava presente nos pacientes do grupo de controle (Stem cells: scientific progress and future research directions. Nat. Inst, of Health. EUA). Um dos problemas não resolvidos da pesquisa clínica de células-tronco neurais do cérebro continua sendo a análise das reais perspectivas e limitações do transplante de seus derivados para a correção de distúrbios do SNC. É possível que a neuronogênese no hipocampo induzida por atividade convulsiva prolongada, levando à sua reorganização estrutural e funcional, possa ser um fator no desenvolvimento progressivo da epilepsia. Essa conclusão merece atenção especial, pois aponta para possíveis consequências negativas da geração de novos neurônios no cérebro maduro e da formação de conexões sinápticas aberrantes por eles.

Não se deve esquecer que o cultivo em meios com citocinas (mitógenos) aproxima as características das células-tronco das células tumorais, visto que nelas ocorrem alterações semelhantes na regulação do ciclo celular, determinando a capacidade de divisão ilimitada. É imprudente transplantar derivados precoces de células-tronco embrionárias em uma pessoa, pois, nesse caso, o risco de desenvolver neoplasias malignas é muito alto. É muito mais seguro utilizar sua progênie mais comprometida, ou seja, células precursoras de linhagens diferenciadas. No entanto, até o momento, ainda não foi desenvolvida uma técnica confiável para obter linhagens estáveis de células humanas que se diferenciem na direção desejada.

O uso de tecnologias de biologia molecular para a correção de patologias hereditárias e doenças humanas por meio da modificação de células-tronco é de grande interesse para a medicina prática. As características do genoma das células-tronco possibilitam o desenvolvimento de esquemas de transplante exclusivos para a correção de doenças genéticas. No entanto, há uma série de limitações nessa área que precisam ser superadas antes da aplicação prática da engenharia genética de células-tronco. Primeiramente, é necessário otimizar o processo de modificação do genoma de células-tronco ex vivo. Sabe-se que a proliferação de células-tronco a longo prazo (3 a 4 semanas) reduz sua transfecção, sendo necessários vários ciclos de transfecção para atingir um alto nível de sua modificação genética. No entanto, o principal problema está associado à duração da expressão gênica terapêutica. Até o momento, em nenhum estudo o período de expressão efetiva após o transplante de células modificadas ultrapassou quatro meses. Em 100% dos casos, ao longo do tempo, a expressão dos genes transfectados diminui devido à inativação de promotores e/ou morte de células com genoma modificado.

Uma questão importante é o custo do uso de tecnologias celulares na medicina. Por exemplo, a necessidade anual estimada para financiar apenas as despesas médicas de uma unidade de transplante de medula óssea projetada para realizar 50 transplantes por ano é de cerca de US$ 900.000.

O desenvolvimento de tecnologias celulares na medicina clínica é um processo complexo e multifásico que envolve a cooperação construtiva entre centros científicos e clínicos multidisciplinares e a comunidade internacional. Ao mesmo tempo, questões de organização científica da pesquisa na área de terapia celular requerem atenção especial. As mais importantes são o desenvolvimento de protocolos de pesquisa clínica, o controle da confiabilidade dos dados clínicos, a formação de um registro nacional de estudos, a integração em programas internacionais de estudos clínicos multicêntricos e a implementação dos resultados na prática clínica.

Concluindo a introdução aos problemas da transplantologia celular, gostaria de expressar a esperança de que a unificação dos esforços dos principais especialistas ucranianos de vários campos da ciência garanta um progresso significativo na pesquisa experimental e clínica e torne possível, nos próximos anos, encontrar maneiras eficazes de fornecer assistência a pessoas gravemente doentes que precisam de transplante de órgãos, tecidos e células.

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