Células estaminais hematopoiéticas

As células-tronco hematopoiéticas (CTHs), assim como as células progenitoras mesenquimais, são caracterizadas pela multipotência e dão origem a linhagens celulares, cujos elementos finais formam os elementos figurados do sangue, bem como uma série de células teciduais especializadas do sistema imunológico.

A hipótese da existência de um precursor comum a todas as células sanguíneas, bem como o próprio termo "célula-tronco", pertence a A. Maksimov (1909). O potencial para a formação de massa celular em células-tronco hematopoiéticas é enorme – células-tronco da medula óssea produzem diariamente 10 células que compõem os elementos figurados do sangue periférico. A própria existência de células-tronco hematopoiéticas foi estabelecida em 1961 em experimentos sobre a restauração da hematopoiese em camundongos que receberam uma dose letal de radiação radioativa que destrói células-tronco da medula óssea. Após o transplante de células singênicas da medula óssea para esses animais irradiados letalmente, focos discretos de hematopoiese foram encontrados no baço dos receptores, cuja fonte eram células precursoras clonogênicas únicas.

Foi então comprovada a capacidade das células-tronco hematopoiéticas de se automanterem, desempenhando a função de hematopoiese no processo de ontogênese. No processo de desenvolvimento embrionário, as células-tronco hematopoiéticas (CTHs) se distinguem pela alta atividade migratória, necessária para seu deslocamento para as zonas de formação dos órgãos hematopoiéticos. Essa propriedade das CTHs também é preservada na ontogênese – devido à sua migração constante, ocorre uma renovação permanente do conjunto de células imunocompetentes. A capacidade das CTHs de migrar, penetrar barreiras histohemáticas, implantar-se em tecidos e promover o crescimento clonogênico serviu de base para o transplante de células da medula óssea em diversas doenças associadas à patologia do sistema hematopoiético.

Como todos os recursos de células-tronco, as células-tronco hematopoiéticas estão presentes em seu nicho (medula óssea) em quantidades muito pequenas, o que causa certas dificuldades em seu isolamento. Imunofenotipicamente, as HSCs humanas são caracterizadas como células NK CD34+ capazes de migrar para a corrente sanguínea e povoar os órgãos do sistema imunológico ou repovoar o estroma da medula óssea. Deve ficar claro que as HSCs não são as células mais imaturas da medula óssea, mas se originam de precursores, que incluem células CD34-negativas semelhantes a fibroblastos dormentes. Foi estabelecido que células com o fenótipo CD34 são capazes de entrar na corrente sanguínea geral, onde mudam seu fenótipo para CD34+, mas após a migração reversa para a medula óssea, sob a influência do microambiente, elas novamente se tornam elementos de células-tronco CD34-negativas. No estado de repouso, as células CD34~ não respondem aos sinais regulatórios parácrinos do estroma (fatores de crescimento, citocinas). No entanto, em situações que exigem maior intensidade de hematopoiese, células-tronco com o fenótipo CD34 respondem a sinais de diferenciação formando células progenitoras hematopoiéticas e mesenquimais. A hematopoiese ocorre pelo contato direto das HSCs com elementos celulares do estroma da medula óssea, representado por uma rede complexa de macrófagos, células endoteliais reticulares, osteoblastos, fibroblastos estromais e matriz extracelular. A base estromal da medula óssea não é apenas uma matriz ou "esqueleto" para o tecido hematopoiético; ela realiza a regulação fina da hematopoiese devido a sinais regulatórios parácrinos de fatores de crescimento, citocinas e quimiocinas, e também fornece interações adesivas necessárias para a formação de células sanguíneas.

Assim, o sistema de hematopoiese, em constante renovação, baseia-se em uma célula-tronco hematopoiética polipotente (do ponto de vista da hematopoiese), capaz de automanutenção a longo prazo. No processo de comprometimento, as células-tronco hematopoiéticas (HSCs) passam por diferenciação primária e formam clones de células que diferem em características citomorfológicas e imunofenotípicas. A formação sequencial de células progenitoras primitivas e comprometidas culmina na formação de células progenitoras morfologicamente identificáveis de diferentes linhagens hematopoiéticas. O resultado das etapas subsequentes do complexo processo multiestágio da hematopoiese é a maturação celular e a liberação de elementos figurados maduros no sangue periférico – eritrócitos, leucócitos, linfócitos e trombócitos.

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Fontes de células-tronco hematopoiéticas

As células-tronco hematopoiéticas são consideradas a fonte de células-tronco mais estudada, o que se deve, em grande parte, ao seu uso clínico no transplante de medula óssea. À primeira vista, sabe-se muito sobre essas células. Até certo ponto, isso é verdade, uma vez que descendentes intermediários e maduros de HSCs são os elementos celulares mais acessíveis, cada um dos quais (eritrócitos, leucócitos, linfócitos, monócitos/macrófagos e plaquetas) tem sido cuidadosamente estudado em todos os níveis - da microscopia óptica à eletrônica, das características bioquímicas e imunofenotípicas à identificação por métodos de análise de PCR. No entanto, o monitoramento de parâmetros morfológicos, ultraestruturais, bioquímicos, imunofenotípicos, biofísicos e genômicos de HSCs não forneceu respostas para muitas questões problemáticas, cuja solução é necessária para o desenvolvimento da transplantologia celular. Os mecanismos de estabilização das células-tronco hematopoiéticas em estado dormente, sua ativação, entrada no estágio de divisão simétrica ou assimétrica e, mais importante, comprometimento com a formação de elementos sanguíneos funcionalmente diferentes, como eritrócitos, leucócitos, linfócitos e plaquetas, ainda não foram estabelecidos.

A presença na medula óssea de células com o fenótipo CD34, que são as progenitoras das células-tronco mesenquimais e hematopoiéticas, levantou a questão da existência dos primeiros precursores da diferenciação celular em linhagens estromais e hematopoiéticas, próximas às células CD34-negativas. A chamada célula iniciadora de cultura de longo prazo (LTC-IC) foi obtida usando o método de cultivo de longo prazo. A vida útil dessas células precursoras com atividade formadora de colônias na base estromal da medula óssea com uma certa combinação de fatores de crescimento excede 5 semanas, enquanto a viabilidade de unidades formadoras de colônias (UFC) comprometidas em cultura é de apenas 3 semanas. Atualmente, a LTC-IC é considerada um análogo funcional das HSCs, uma vez que, com alto potencial de repovoamento, cerca de 20% das LTC-IC são caracterizadas pelo fenótipo CD34+CD38- e exibem alta capacidade de autorrenovação. Essas células são encontradas na medula óssea humana com uma frequência de 1:50.000. No entanto, as células iniciadoras mieloides-linfoides, obtidas em condições de cultivo de longo prazo (15 semanas), devem ser reconhecidas como as mais próximas das HSCs. Essas células, designadas como LTC, estão entre as células da medula óssea do cérebro humano, são encontradas 10 vezes menos frequentemente do que as LTC-IC e formam linhagens celulares de linhagens hematopoiéticas mieloides e linfoides.

Embora a marcação de células-tronco hematopoiéticas com anticorpos monoclonais, seguida de identificação imunofenotípica, seja o principal método para reconhecimento e triagem seletiva de células-tronco hematopoiéticas com potencial tronco, a aplicação clínica das HSCs assim isoladas é limitada. O bloqueio do receptor CD34 ou de outros antígenos marcadores com anticorpos durante a triagem imunopositiva altera inevitavelmente as propriedades da célula isolada com sua ajuda. O isolamento imunonegativo de HSCs em colunas magnéticas é considerado mais preferível. No entanto, neste caso, anticorpos monoclonais fixados em um carreador metálico são geralmente usados para triagem. Além disso, o que é importante, ambos os métodos de isolamento de HSCs são baseados em características fenotípicas e não funcionais. Portanto, muitos pesquisadores preferem usar a análise de parâmetros clonogênicos de HSCs, o que permite determinar o grau de maturidade e a direção da diferenciação das células progenitoras pelo tamanho e composição das colônias. Sabe-se que, durante o processo de comprometimento, o número de células e seus tipos na colônia diminuem. A célula-tronco hematopoiética e sua célula-filha inicial, denominada "unidade formadora de colônias de granulócitos-eritrócitos-monócitos-megacariócitos" (UFC-GEMM), criam grandes colônias multilinhagens em cultura contendo granulócitos, eritrócitos, monócitos e megacariócitos, respectivamente. A unidade formadora de colônias de granulócitos-monócitos (UFC-GM), localizada a jusante da linha de comprometimento, forma colônias de granulócitos e macrófagos, e a unidade formadora de colônias de granulócitos (UFC-G) forma apenas uma pequena colônia de granulócitos maduros. O precursor eritrocitário inicial, a unidade formadora de eritrócitos em explosão (UFC-E), é a fonte de grandes colônias eritrocitárias, e a unidade formadora de colônias de eritrócitos mais madura (UFC-E) é a fonte de pequenas colônias eritrocitárias. Em geral, quando as células crescem em meios semissólidos, é possível identificar células que formam seis tipos de colônias mieloides: CFU-GEMM, CFU-GM, CFU-G, CFU-M, BFU-E e CFU-E).

No entanto, além dos derivados hematopoiéticos, qualquer material de origem para o isolamento de HSCs contém um número significativo de células associadas. Nesse sentido, a purificação preliminar do transplante é necessária, em primeiro lugar, a partir de células ativas do sistema imunológico do doador. Normalmente, a imunosseleção é utilizada para esse fim, com base na expressão de antígenos específicos por linfócitos, o que permite isolá-los e removê-los usando anticorpos monoclonais. Além disso, foi desenvolvido um método de imunoroseta para depleção de linfócitos T de transplantes de medula óssea, que se baseia na formação de complexos de linfócitos CD4+ e anticorpos monoclonais específicos, efetivamente removidos por aférese. Esse método garante a produção de material celular purificado com 40-60% de conteúdo de células-tronco hematopoiéticas.

O aumento do número de células progenitoras devido à remoção de elementos formados maduros do sangue do produto da leucaférese é obtido por centrifugação em contracorrente seguida de filtração (na presença de um quelante - citrato trissódico) através de colunas contendo fibras de náilon revestidas com imunoglobulina humana. O uso sequencial desses dois métodos garante a purificação completa do transplante de plaquetas, 89% de eritrócitos e 91% de leucócitos. Devido a uma redução significativa na perda de células-tronco hematopoiéticas (HSCs), o nível de células CD34+ na massa celular total pode ser aumentado para 50%.

A capacidade das células-tronco hematopoiéticas isoladas de formar colônias de células sanguíneas maduras em cultura é utilizada para a caracterização funcional das células. A análise das colônias formadas permite identificar e quantificar os tipos de células progenitoras, o grau de seu comprometimento e estabelecer a direção de sua diferenciação. A atividade clonogênica é determinada em meios semissólidos em metilcelulose, ágar, plasma ou gel de fibrina, que reduzem a atividade migratória das células, impedindo sua fixação à superfície de vidro ou plástico. Em condições ideais de cultivo, os clones se desenvolvem a partir de uma única célula em 7 a 18 dias. Se um clone contiver menos de 50 células, ele é identificado como um único cluster; se o número de células exceder 50, ele é identificado como uma colônia. O número de células capazes de formar uma colônia é levado em consideração (unidades formadoras de colônias - UFC ou células formadoras de colônias - COC). Deve-se notar que os parâmetros de UFC e COC não correspondem ao número de HSCs na suspensão celular, embora se correlacionem com ele, o que mais uma vez enfatiza a necessidade de determinar a atividade funcional (formadora de colônias) das HSCs in vitro.

Entre as células da medula óssea, as células-tronco hematopoiéticas apresentam o maior potencial proliferativo, razão pela qual formam as maiores colônias em cultura. O número dessas colônias é proposto para determinar indiretamente o número de células-tronco. Após a formação in vitro de colônias com diâmetro superior a 0,5 mm e contagem celular superior a 1.000, os autores testaram a resistência dessas células a doses subletais de 5-fluorouracil e estudaram sua capacidade de repovoar a medula óssea de animais irradiados letalmente. De acordo com os parâmetros especificados, as células isoladas eram quase indistinguíveis das células-tronco hematopoiéticas (HSCs) e receberam a sigla HPP-CFC - células formadoras de colônias com alto potencial proliferativo.

A busca por isolamento de células-tronco hematopoiéticas de melhor qualidade continua. No entanto, as células-tronco hematopoiéticas são morfologicamente semelhantes aos linfócitos e representam um conjunto relativamente homogêneo de células com núcleos quase redondos, cromatina finamente dispersa e uma pequena quantidade de citoplasma fracamente basofílico. Seu número exato também é difícil de determinar. Supõe-se que as CTHs na medula óssea humana ocorram com uma frequência de 1 para 106 células nucleadas.

Identificação de células-tronco hematopoiéticas

Para melhorar a qualidade da identificação de células-tronco hematopoiéticas, é realizado um estudo sequencial ou simultâneo (em um classificador multicanal) do espectro de antígenos ligados à membrana, e em HSCs o fenótipo CD34+CD38 deve ser combinado com a ausência de marcadores de diferenciação linear, especialmente antígenos de células imunocompetentes, como CD4, imunoglobulinas de superfície e glicoforina.

Quase todos os esquemas de fenotipagem de células-tronco hematopoiéticas incluem a determinação do antígeno CD34. Essa glicoproteína, com peso molecular de cerca de 110 kDa, contendo diversos sítios de glicosilação, é expressa na membrana plasmática após a ativação do gene correspondente localizado no cromossomo 1. A função da molécula CD34 está associada à interação mediada por L-selectina das células progenitoras hematopoiéticas iniciais com a base estromal da medula óssea. No entanto, deve-se lembrar que a presença do antígeno CD34 na superfície celular permite apenas uma avaliação preliminar do conteúdo de HSC na suspensão celular, uma vez que também é expressa por outras células progenitoras hematopoiéticas, bem como por células estromais da medula óssea e células endoteliais.

Durante a diferenciação das células progenitoras hematopoiéticas, a expressão de CD34 é permanentemente reduzida. Eritrócitos, granulócitos e células progenitoras monocíticas comprometidas expressam fracamente o antígeno CD34 ou não o expressam em sua superfície (fenótipo CD34). O antígeno CD34 não é detectado na membrana superficial de células diferenciadas da medula óssea e de células sanguíneas maduras.

Deve-se notar que na dinâmica de diferenciação das células progenitoras hematopoiéticas não apenas o nível de expressão de CD34 diminui, mas também a expressão do antígeno CD38, uma glicoproteína integral de membrana com peso molecular de 46 kDa, que possui atividade de NAD-glicoidrolase e ADP-ribosil ciclase, aumenta progressivamente, o que sugere sua participação no transporte e síntese de ADP-ribose. Assim, surge a possibilidade de duplo controle do grau de comprometimento das células progenitoras hematopoiéticas. A população de células com o fenótipo CD34+CD38+, que constitui de 90 a 99% das células da medula óssea CD34-positivas, contém células progenitoras com potencial proliferativo e de diferenciação limitado, enquanto células com o fenótipo CD34+CD38 podem reivindicar o papel de HSC.

De fato, a população de células da medula óssea descrita pela fórmula CD34+CD38- contém um número relativamente grande de células-tronco primitivas capazes de se diferenciar nas direções mieloide e linfoide. Em condições de cultivo prolongado de células com o fenótipo CD34+CD38-, é possível obter todos os elementos figurados maduros do sangue: neutrófilos, eosinófilos, basófilos, monócitos, megacariócitos, eritrócitos e linfócitos.

Foi estabelecido há relativamente pouco tempo que células CD34 positivas expressam mais dois marcadores, AC133 e CD90 (Thy-1), que também são usados para identificar células-tronco hematopoiéticas. O antígeno Thy-1 é coexpresso com o receptor CD117 (c-kit) em células CD34+ da medula óssea, cordão umbilical e sangue periférico. É uma glicoproteína de superfície de ligação ao fosfatidilinositol com peso molecular de 25-35 kDa, que participa de processos de adesão celular. Alguns autores acreditam que o antígeno Thy-1 seja um marcador das células CD34 positivas mais imaturas. Células autorreprodutoras com o fenótipo CD34+Thy-1+ dão origem a linhagens cultivadas de longo prazo com a formação de células-filhas. Supõe-se que o antígeno Thy-1 bloqueie os sinais regulatórios que causam a parada da divisão celular. Apesar de as células CD34+Thy1+ serem capazes de autorreprodução e criação de linhagens cultivadas de longo prazo, seu fenótipo não pode ser atribuído exclusivamente às HSCs, uma vez que o conteúdo de Thy-1+ na massa total de elementos celulares CD34-positivos é de cerca de 50%, o que excede significativamente o número de células hematopoiéticas.

Mais promissor para a identificação de células-tronco hematopoiéticas deve ser o AC133, um marcador antigênico de células progenitoras hematopoiéticas, cuja expressão foi detectada pela primeira vez em células hepáticas embrionárias. O AC133 é uma glicoproteína transmembrana que aparece na superfície da membrana celular nos estágios iniciais da maturação das células-tronco hematopoiéticas (HSCs) – possivelmente até antes do antígeno CD34. Nos estudos de A. Petrenko e V. Grishchenko (2003), foi estabelecido que o AC133 é expresso em até 30% das células hepáticas embrionárias CD34-positivas.

Assim, o perfil fenotípico ideal das células-tronco hematopoiéticas, segundo os conceitos atuais, consiste em um contorno celular, cujos contornos devem incluir configurações dos antígenos CD34, AC133 e Thy-1, mas não há espaço para as projeções moleculares de CD38, HLA-DR e os marcadores de diferenciação linear GPA, CD3, CD4, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20.

Uma variação do retrato fenotípico das HSCs pode ser a combinação CD34+CD45RalowCD71low, uma vez que as propriedades das células descritas por esta fórmula não diferem dos parâmetros funcionais das células com o fenótipo CD34+CD38. Além disso, as HSCs humanas podem ser identificadas pelas características fenotípicas CD34+Thy-l+CD38Iow/'c-kit/low – apenas 30 dessas células restauram completamente a hematopoiese em camundongos irradiados letalmente.

O período de 40 anos de pesquisa intensiva sobre células-tronco hematopoiéticas (CTHs), capazes tanto de autorreprodução quanto de diferenciação em outros elementos celulares, começou com a análise das características fenotípicas gerais das células da medula óssea, o que possibilitou justificar o uso do transplante de medula óssea para o tratamento de diversas patologias do sistema hematopoiético. Novos tipos de células-tronco descobertos posteriormente ainda não foram amplamente utilizados na prática clínica. Ao mesmo tempo, células-tronco do sangue do cordão umbilical e do fígado embrionário são capazes de expandir significativamente a escala do transplante de células não apenas em hematologia, mas também em outras áreas da medicina, uma vez que diferem das CTHs da medula óssea tanto em características quantitativas quanto qualitativas.

O volume de massa de células-tronco hematopoiéticas necessário para transplante é geralmente obtido da medula óssea, sangue periférico e do cordão umbilical e fígado embrionário. Além disso, células progenitoras hematopoiéticas podem ser obtidas in vitro pela multiplicação de CTEs com sua subsequente diferenciação direcionada em elementos celulares hematopoiéticos. A. Petrenko e V. Grishchenko (2003) observam, com razão, diferenças significativas nas propriedades imunológicas e na capacidade de restaurar a hematopoiese de CTHs de diferentes origens, o que se deve à proporção desigual de células progenitoras pluripotentes precoces e tardiamente comprometidas contidas em suas fontes. Além disso, células-tronco hematopoiéticas obtidas de diferentes fontes-tronco são caracterizadas por associações quantitativa e qualitativamente completamente diferentes de células não hematopoiéticas.

A medula óssea já se tornou uma fonte tradicional de células-tronco hematopoiéticas. A suspensão de células da medula óssea é obtida do ílio ou do esterno por lavagem sob anestesia local. A suspensão obtida dessa forma é heterogênea e contém uma mistura de células-tronco hematopoiéticas (CTHs), elementos de células estromais, células progenitoras comprometidas de linhagens mieloides e linfoides, bem como elementos figurados maduros do sangue. O número de células com os fenótipos CD34+ e CD34+CD38 entre as células mononucleares da medula óssea é de 0,5% a 3,6% e 0% a 0,5%, respectivamente. O sangue periférico após a mobilização de CTHs induzida por G-CSF contém 0,4% a 1,6% de CD34+ e 0% a 0,4% de CD34+CD38.

A porcentagem de células com os imunofenótipos CD34+CD38 e CD34+ é maior no sangue do cordão umbilical - 0-0,6 e 1-2,6%, e seu número máximo é detectado entre as células hematopoiéticas do fígado embrionário - 0,2-12,5 e 2,3-35,8%, respectivamente.

No entanto, a qualidade do material transplantado depende não apenas do número de células CD34+ que ele contém, mas também de sua atividade funcional, que pode ser avaliada pelo nível de formação de colônias in vivo (repovoamento da medula óssea em animais irradiados letalmente) e in vitro - pelo crescimento de colônias em meio semilíquido. Descobriu-se que a atividade formadora de colônias e proliferativa de células progenitoras hematopoiéticas com o fenótipo CD34+CD38 HLA-DR isoladas do fígado embrionário, medula óssea fetal e sangue do cordão umbilical excede significativamente o potencial proliferativo e formador de colônias de células hematopoiéticas da medula óssea e do sangue periférico de um adulto. A análise quantitativa e qualitativa de HSCs de várias origens revelou diferenças significativas tanto em seu conteúdo relativo na suspensão celular quanto em suas capacidades funcionais. O número máximo de células CD34+ (24,6%) foi encontrado no material transplantado obtido da medula óssea fetal. A medula óssea de um adulto contém 2,1% de elementos celulares CD34-positivos. Entre as células mononucleares do sangue periférico de um adulto, apenas 0,5% apresentam o fenótipo CD34+, enquanto no sangue do cordão umbilical esse número chega a 2%. Ao mesmo tempo, a capacidade de formação de colônias das células CD34+ da medula óssea fetal é 2,7 vezes maior do que a capacidade de crescimento clonal das células hematopoiéticas da medula óssea de um adulto, e as células do sangue do cordão umbilical formam significativamente mais colônias do que os elementos hematopoiéticos isolados do sangue periférico de adultos: 65,5 e 40,8 colônias/105 células, respectivamente.

As diferenças na atividade proliferativa e na capacidade de formação de colônias das células-tronco hematopoiéticas estão associadas não apenas aos diferentes graus de maturidade, mas também ao seu microambiente natural. Sabe-se que a intensidade da proliferação e a taxa de diferenciação das células-tronco são determinadas pelo efeito regulatório integral de um sistema multicomponente de fatores de crescimento e citocinas, produzidos tanto pelas próprias células-tronco quanto pelos elementos celulares de seu microambiente matriz-estromal. O uso de populações celulares purificadas e meios isentos de soro para o cultivo celular possibilitou a caracterização de fatores de crescimento que exercem efeito estimulante e inibitório sobre células-tronco de vários níveis, células progenitoras e células comprometidas em uma ou outra direção linear. Os resultados dos estudos indicam de forma convincente que as HSCs obtidas de fontes com diferentes níveis de desenvolvimento ontogenético diferem tanto fenotipicamente quanto funcionalmente. As HSCs em estágios iniciais da ontogênese são caracterizadas por alto potencial de autorreprodução e alta atividade proliferativa. Essas células se distinguem por telômeros mais longos e passam por comprometimento para formar todas as linhagens celulares hematopoiéticas. A resposta do sistema imunológico às HSCs de origem embrionária é retardada, visto que tais células expressam fracamente moléculas HLA. Há uma gradação clara do conteúdo relativo de HSCs, sua capacidade de autorrenovação e o número de tipos de linhas de comprometimento que formam: células CD34+ do fígado embrionário > células CD34+ do sangue do cordão umbilical > células CD34+ da medula óssea. É importante que tais diferenças sejam inerentes não apenas aos períodos intra, neo e pós-natal inicial do desenvolvimento humano, mas também a toda a ontogênese – a atividade proliferativa e formadora de colônias das HSCs obtidas da medula óssea ou do sangue periférico de um adulto é inversamente proporcional à idade do doador.