Células-tronco hematopoiéticas

As células estaminais hematopoéticas (HSCs), como as células progenitoras mesenquimatosas, são caracterizadas por multipotência e dão origem a linhas celulares, cujos elementos finais formam células sanguíneas, bem como várias células de tecido especializadas do sistema imunológico.

A hipótese da existência de um ancestral comum de todas as células sanguíneas, bem como o termo "células-tronco", de propriedade de A. Maximov (1909) A formação potencial de massa celular da GSK enorme -. Células estaminais da medula óssea produzir as células 10 dias que compõem glóbulos do próprio periférico. O fato da existência de células-tronco hematopoiéticas foi estabelecido em 1961 em experimentos de restauração da hemopoiese em camundongos que receberam uma dose letal de irradiação radioativa que destrói as células-tronco da medula óssea. Células progenitoras clonogénicas simples - ou seja, o transplante de culas de medula sea singicas de modo letalmente animais focos discretos de hematopoiese foram detectados no baço de receptores cuja fonte irradiadas.

Em seguida, demonstrou-se a capacidade das células-tronco hematopoiéticas para auto-suporte, que fornece a função da hematopoiese durante a ontogênese. No processo de desenvolvimento embrionário, os HSCs são caracterizados por uma alta atividade migratória, que é necessária para a migração para os sítios dos órgãos hematopoiéticos. Esta propriedade dos HSCs é retida também na ontogênese - devido à sua migração constante, ocorre uma renovação permanente do grupo de células imunocompetentes. A capacidade da GSK para migrar, penetrar através das barreiras hematológicas, a implantação em tecidos e o crescimento clonogênico serviram de base para o transplante de medula óssea em várias doenças associadas à patologia do sistema hematopoiese.

Como todos os recursos de células estaminais, as células estaminais hematopoiéticas estão presentes em seu nicho (medula óssea) em quantidades muito pequenas, o que causa certas dificuldades em sua alocação. Immunophenotypically, humanos HSCs são caracterizados como CD34 + NK células capazes de migrar para a corrente sanguínea e povoar os órgãos do sistema imunológico ou repovoar o estroma da medula óssea. É necessário perceber claramente que os HSCs não são as células mais imaturas da medula óssea, mas provêm de predecessores, que incluem as células SB34-negativas semelhantes a fibroblastos dormentes. Foi estabelecido que as células com o fenótipo CD34 são capazes de atingir o fluxo sangüíneo geral, onde eles mudam seu fenótipo em CD34 +, mas quando retornam à medula óssea sob a influência do microambiente, eles se tornam elementos de células-tronco negativos para CD34. Em repouso, as células CD34 não respondem aos sinais estromáticos reguladores paracrinos (fatores de crescimento, citocinas). No entanto, em situações que requerem intensificação da hematopoiese, as células-tronco com o fenótipo CD34 respondem a sinais de diferenciação pela formação de células progenitoras hematopoiéticas e mesenquimatosas. O encapuzamento é realizado por contato direto de HSC com elementos celulares do estroma da medula óssea, representados por uma rede complexa de macrófagos, células endoteliais reticulares, osteoblastos, fibroblastos estromais e matriz extracelular. Osso estrutura do estroma da medula - não apenas uma matriz ou "esqueleto" de tecido hematopoiético, que transporta regulação fina da hematopoiese devido a sinais reguladores parácrinos de factores de crescimento, citocinas e quimiocinas, e também fornece interacções adesivas necessárias para a formação de células sanguíneas.

Assim, a base do sistema de hemopoiese constantemente atualizado é uma célula-tronco hemopoiética, que é capaz de auto-manutenção prolongada. Durante o processo de cometer, os HSCs são submetidos a diferenciação primária e formam clones de células que diferem em suas características citomorfológicas e imunofenotípicas. A formação consecutiva de células progenitoras primitivas e comprometidas é completada pela formação de células ancestrais morfologicamente identificáveis de várias linhas hematopoiéticas. O resultado das etapas subseqüentes de um processo complexo de hematopoiese de múltiplos estágios é a maturação de células e a liberação no sangue periférico de elementos maduros - eritrócitos, leucócitos, linfócitos e plaquetas.

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Fontes de células estaminais hematopoiéticas

As células estaminais hematopoéticas são consideradas a fonte do caule mais estudada, o que é em grande parte devido à sua utilização na clínica para transplante de medula óssea. À primeira vista, muito é sabido sobre essas células. Até certo ponto, isso é verdade, porque os descendentes intermediários e maduros de HSC são os elementos celulares mais acessíveis, cada um dos quais (glóbulos vermelhos, leucócitos, linfócitos, monócitos / macrófagos e plaquetas) tem sido cuidadosamente estudado em todos os níveis - de microscopia de luz para elétron, de características bioquímicas e imunofenotípicas antes da identificação por análise de PCR. No entanto, o monitoramento de parâmetros morfológicos, ultraestruturais, bioquímicos, imunofenotípicos, biofísicos e genômicos de HSC não permitiu obter respostas para muitas questões problemáticas, cuja solução é necessária para o desenvolvimento de transplantologia celular. Ainda não está estabelecido mecanismos de estabilização GSK em estado dormente, eles são ativados, entrar na fase da divisão simétrica ou assimétrica, e mais importante - de compromisso com a educação como funcionalmente diferentes células sanguíneas, eritrócitos, leucócitos, linfócitos e plaquetas.

A presença nas células da medula óssea com o fenótipo de células CD34, que são os antepassados de células estaminais tanto mesenquimais e hematopoiéticas levantou a questão da existência dos primeiros perto de células CD34-negativo na diferenciação de células progenitoras e a linha do estroma hematopoiético. Pelo método de cultura a longo prazo, obteve-se uma chamada célula iniciadora de cultura a longo prazo (LTC-IC). O tempo de vida de tais células progenitoras em colónias de actividade de estroma da medula óssea com base em uma combinação de factores de crescimento de formação é mais de 5 semanas, enquanto que a viabilidade das unidades formadoras de colónias comprometidos (UFC) em cultura de apenas 3 semanas. Actualmente acredita-se que o LTC-IC - análogo funcional GCW como repopulyatsionnom a um elevado potencial de cerca de 20% de LTC-IC são caracterizados por um fenótipo de células CD34 + CD38 e exibem uma elevada capacidade de auto-renovação. Tais células encontradas na medula óssea humana com a frequência de 1:50 000. No entanto, deve-se reconhecer células limfoidoinitsiiruyuschie-mielóide mais próximas da HSC que são obtidos em condições de longo prazo (15 semanas) da cultura. Tais células, designadas como LTC, são encontradas 10 vezes menos freqüentemente em células de medula óssea humana do que LTC-IC e formam as linhas celulares de ambos os crescimentos hematopoiéticos mielóides e linfóides.

Embora as células-tronco hematopoiéticas marcação com anticorpos monoclonais, seguido de identificação dos imunofenotípicas é o método principal para a identificação e separação selectiva de células-tronco hematopoiéticas com a potencial utilização clínica de GSK dedicado assim limitada. O bloqueio com anticorpos do receptor CD34 ou de outros antígenos marcantes no processo de triagem imunopositiva muda inevitavelmente as propriedades da célula isolada com ele. Mais preferível é a secreção imuno-negativa de HSC em colunas magnéticas. No entanto, neste caso, como regra, os anticorpos monoclonais fixados em um transportador metálico são utilizados para a triagem. Além disso, o que é importante, ambos os métodos de isolamento de HSC são baseados em características fenotípicas e não funcionais. Portanto, muitos pesquisadores preferem usar a análise de parâmetros clonogênicos de HSC, que permite o tamanho e a composição das colônias para determinar o grau de maturidade e a direção da diferenciação de células progenitoras. Sabe-se que no processo de cometer o número de células eo número de seus tipos na colônia diminui. Células-tronco hematopoiéticas e a sua célula filha precoce, chamada "unidade de monócitos-megakariotsitokolonieobrazuyuschaya de granulócitos-eritrócitos" (SFU-GEMM), criar uma cultura multilinear grandes colónias que contêm, respectivamente, granulócitos, eritrócitos, monócitos e megacariócitos. Localizado por baixo da unidade de linha de granulócitos-linhagem compromisso monotsitokolonieobrazuyuschaya (SFU-GM) gera colónias de granulócitos e macrófagos, e as unidades formadoras de colónias de granulócitos (G-SFU) - apenas pequenas colónias de granulócitos maduros. Cedo antecessor de eritrócitos - unidade burstoobrazuyuschaya de células vermelhas do sangue (SFU-E) - é uma fonte de grande e mais madura unidade de formação de colónias de células vermelhas do sangue (SFU-E) - colónias de células vermelhas do sangue pequenas. Na população em geral, com o crescimento das células em meios semi-sólidos podem identificar células que formam seis tipos de colónias mielóides: SFU-GEMM, GM-SFU, SFU-G, M-SFU, VFU-E e E-SFU).

No entanto, além de derivados hematopoiéticos, qualquer material de origem para a separação de HSC contém um número significativo de células concomitantes. A este respeito, é necessária uma purificação preliminar do transplante, antes de tudo, das células ativas do sistema imunológico do doador. Geralmente, é utilizada a imunossecção baseada na expressão de linfócitos de antígenos específicos para isso, o que permite isolá-los e removê-los usando anticorpos monoclonais. Além disso, desenvolveu-se a técnica imunof ódica de depleção linfocítica T do transplante de medula óssea, que se baseia na formação de complexos de linfócitos CD4 + e anticorpos monoclonais específicos que são efetivamente removidos por aférese. Esta técnica fornece um material celular purificado com 40-60% de células estaminais hematopoiéticas.

O aumento do número de células progenitoras, devido à remoção de células sanguíneas maduras a partir de um produto de leucaferese é alcançado por centrifugação contrafluxo, seguido por filtração (na presença do agente quelante - citrato trissódico) através de uma coluna que contém fibras de nylon revestidas com imunoglobulina humana. A aplicação consistente destas duas técnicas garante uma limpeza completa do transplante de plaquetas, 89% de eritrócitos e 91% de glóbulos brancos. Devido a uma redução significativa nas perdas de HSC, o nível de células CD34 + na massa celular total pode ser aumentado para 50%.

Para as características funcionais das células estaminais hematopoiéticas isoladas, sua capacidade de criar colônias de elementos sanguíneos maduros em cultura é utilizada. A análise das colônias formadas permite identificar e quantificar os tipos de células progenitoras, o grau de sua conformidade e também estabelecer a direção de sua diferenciação. A atividade clonogênica é determinada em meio semi-sólido em metilcelulose, ágar, plasma ou gel de fibrina, o que reduz a atividade de migração das células, o que impede sua fixação na superfície do vidro ou plástico. Sob melhores condições de cultura, os clones de uma única célula se desenvolvem dentro de 7 a 18 dias. Se houver menos de 50 células no clone, ele é identificado como um único cluster, se o número de células exceder 50 - como colônia. O número de células capazes de formar uma colônia (unidades formadoras de colônias - CFU ou células formadoras de colônias - COCs) é levado em consideração. Deve notar-se que os parâmetros de CFU e COC não correspondem à quantidade de HSC na suspensão celular, embora correlata com ela, o que novamente ressalta a necessidade de determinar a atividade funcional (colonia-formadora) de HSC in vitro.

Entre as células da medula óssea, as células estaminais hematopoiéticas possuem o maior potencial proliferativo, devido ao qual as maiores colônias são formadas em cultura. Pelo número dessas colônias, propõe-se determinar indiretamente o número de células-tronco. Após a formação de colônias in vitro com mais de 0,5 mm de diâmetro e com um número de células de mais de 1000, os autores testaram essas células para resistência a doses sublatórias de 5-fluorouracilo e estudaram sua capacidade de repovoar a medula óssea de animais irradiados. De acordo com esses parâmetros, as células isoladas não diferiram muito do HSC e receberam o símbolo de abreviatura HPP-CFC - células formadoras de colônias com alto potencial de proliferação.

A busca da possibilidade de uma seleção mais qualitativa de células estaminais hematopoiéticas continua. No entanto, as células hematopoiéticas do caule são morfologicamente semelhantes aos linfócitos e representam um conjunto relativamente homogêneo de células com núcleos quase redondos, cromatina finamente dispersa e uma pequena quantidade de citoplasma fracamente basofílico. O número exato também é difícil de determinar. Supõe-se que GSK na medula óssea de uma pessoa ocorra com uma frequência de 1 por cada 106 células contendo núcleo.

Identificação de células estaminais hematopoiéticas

Para melhorar a identificação de células-tronco hematopoiéticas é levada a cabo sequencialmente ou simultaneamente (num tere sorbitano multicanal) Espectro membrannosvyazannyh investigação de antigénios, em que a GSK fenipo CD34 + CD38 deve ser combinada com a falta de marcadores de diferenciao linear, particularmente antigénios de células imunocompetentes, tais como CD4, e as imunoglobulinas de superfície glicophorina.

Praticamente todos os esquemas de fenotipagem de células-tronco hematopoiéticas incluem a determinação do antígeno CD34. Esta glicoproteína com um peso molecular de cerca de 110 kDa, que transporta vários locais de glicosilação, é expressa na membrana celular plasmática após a ativação do gene correspondente localizado no 1º cromossomo. A função da molécula CD34 está associada à interação mediada por L-selectina de células precursoras hematopoiéticas precoces com a base estromal da medula óssea. No entanto, deve-se lembrar que a presença de antígeno CD34 na superfície celular permite apenas uma avaliação preliminar do conteúdo de HSC na suspensão celular, uma vez que é expressa por outras células precursoras da hemopoiese, bem como células estomatais da medula óssea e células endoteliais.

Durante a diferenciação de células progenitoras hematopoiéticas, a expressão de CD34 é permanentemente reduzida. As células progenitoras cometidas por eritrócitos, granulócitos e monócitos expressam expressivamente o antígeno CD34, ou estão ausentes na sua superfície (fenotipo CD34). Na membrana superficial de células diferenciadas da medula óssea e células sanguíneas maduras, o antígeno CD34 não é detectado.

Deve notar-se que na dinâmica da diferenciação de células progenitoras hematopoiéticas não só reduz o nível de CD34 expressão, mas paralelamente aumentou progressivamente a expressão do antigénio CD38 - glicoproteína integral de membrana com peso molecular de 46 kDa tendo NAD-glikogidrolaznoy e actividade ciclase ADP-ribosilo, sugerindo o seu envolvimento no transporte e síntese de ADP-ribose. Assim, existe a possibilidade de um duplo controle do grau de comprometimento das células progenitoras hematopoiéticas. População de células com o fenótipo de células CD34 + CD38 +, a partir de células de medula óssea CD34-positivas 90 a 99% compreende as células progenitoras, com limitado potencial proliferativo diferenciação e, ao passo que com o fenótipo de células CD34 + CD38 pode reivindicar o papel GSK.

De fato, a população de células da medula óssea descrita pela fórmula CD34 + CD38- contém um número relativamente grande de células estaminais primitivas que podem se diferenciar nas direções mieloides e linfóides. Nas condições de cultivo prolongado de células com o fenótipo CD34 + CD38-, é possível obter todos os elementos sanguíneos maduros: neutrófilos, eosinófilos, basófilos, monócitos, megacariócitos, eritrócitos e linfócitos.

Relativamente recentemente, as células CD34-positivas expressam mais dois marcadores - AC133 e CD90 (Thy-1), que também são usados para identificar células estaminais hematopoiéticas. O antígeno Thy-1 é co-expresso com o receptor CD117 (kit c) em células CD34 + de medula óssea, cordão umbilical e sangue periférico. Esta é uma glicoproteína de ligação à superfície de fosfatidilinositol com um peso molecular de 25-35 kDa, que faz parte dos processos de adesão celular. Alguns autores acreditam que o antígeno Thy-1 é o marcador das células CD34-positivas mais imaturas. As células auto-reproduzidas com o fenótipo CD34 + Thy-1 + dão origem a linhas de cultivo longo com a formação de células filhas. Sugere-se que o antígeno Thy-1 bloqueie os sinais regulatórios que fazem com que a divisão celular pare. Apesar do facto de que as células CD34 + TU1 + são capazes de auto-renovação e a criação de linhas de cultura de longo prazo, o seu fenótipo não pode dizer respeito apenas à HSC, como Thy-1 + teor em peso total dos elementos de células positivas para CD34 é cerca de 50%, excedendo em muito o o número de células hematopoiéticas.

Mais promissor para a identificação de células estaminais hematopoiéticas é AC133, um marcador de antígeno de células progenitoras hematopoiéticas, cuja expressão foi detectada pela primeira vez em células embrionárias do fígado. AC133 é uma glicoproteína transmembranar que aparece na superfície da membrana celular nos primeiros estágios da maturação GSK - é possível que mesmo antes do antígeno CD34. Nos estudos de A. Petrenko e V. Grichchenko (2003), descobriu-se que o AC133 expressa até 30% das células CD34-positivas do fígado embrionário.

Assim, o perfil ideal fenotípica de células-tronco hematopoiéticas por conceitos actuais, a soma do contorno da célula, nos circuitos que deve estar presente CD34 antigénios configuração, AC133 e de Thy-1, mas não há lugar para projecções CD38 molecular, HLA-DR e marcadores de diferenciação linear GPA CD3, CD4, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20.

A variação do retrato fenotípico de HSC pode ser uma combinação de CD34 + CD45RalowCD71low, uma vez que as propriedades das células descritas por esta fórmula não diferem dos parâmetros funcionais das células com o fenótipo CD34 + CD38. Além disso, a GSK humana pode ser identificada pelos sinais fenotípicos de CD34 + Thy-1 + CD38Iow / 'c-kit / low - apenas 30 dessas células restauram completamente a hematopoiese em ratos irradiados letalmente.

A partir da análise das características gerais fenotípicas de células da medula óssea, na verdade, começou 40 anos de investigação intensiva GSK simultaneamente capaz de tanto a auto-renovação e diferenciação para outros elementos celulares, permitindo a justificar a utilização do transplante de medula óssea para o tratamento de várias patologias do sistema hematopoiético. Os novos tipos de células-tronco recentemente descobertos ainda não foram amplamente utilizados na prática clínica. Ao mesmo tempo, as células-tronco do sangue do cordão umbilical e do fígado embrionário podem expandir significativamente a escala de transplante celular, não apenas em hematologia, mas também em outros campos da medicina, uma vez que diferem do HSC da medula óssea, tanto por características quantitativas como características qualitativas.

O volume de massa celular hematopoiética do tronco requerido para o transplante geralmente é obtido a partir da medula óssea, sangue periférico e do cordão umbilical, e também do fígado embrionário. Além disso, as células progenitoras da hematopoiese podem ser obtidas in vitro pela propagação de ESCs seguida de sua diferenciação direcional em elementos de células hematopoiéticas. A. Petrenko, V. Grishchenko (2003) observam com razão diferenças significativas nas propriedades imunológicas e a capacidade de restaurar a hematopoiese de HSC de origem diferente, devido à correlação desigual das células precursoras precárias precoce e tardia contidas em suas fontes. Além disso, as células estaminais hematopoiéticas derivadas de diferentes fontes de caule têm associações completamente diferentes de células não hematopoiéticas de forma quantitativa e qualitativa.

Uma fonte tradicional de células estaminais hematopoiéticas é a medula óssea. Uma suspensão de células da medula óssea é obtida a partir do osso abdominal ou esterno por lixiviação sob anestesia local. A suspensão assim obtida é heterogênea e contém uma mistura de HSC, elementos de células estromais, células progenitoras comprometidas das linhas mielóides e linfóides, bem como elementos sanguíneos maduros. O número de células com os fenótipos CD34 + e CD34 + CD38 entre células mononucleares da medula óssea é de 0,5 a 3,6 e 0 a 0,5%, respectivamente. O sangue periférico após a mobilização induzida por G-CSF de HSC contém 0,4-1,6% de CD34 + e 0-0,4% de CD34 + CD38.

A porcentagem de células com imunofenotipos CD34 + CD38 e CD34 + no sangue do cordão umbilical é maior - 0-0,6 e OD-2,6%, e seu número máximo é detectado entre as células hematopoiéticas do fígado embrionário - 0,2-12,5 e 2,3 -35,8%, respectivamente.

No entanto, a qualidade do material de enxerto depende não só da quantidade contida nele de células CD34 +, mas também sobre a sua actividade funcional, que pode ser estimada pelo nível de formação de colónias in vivo (repovoamento da medula em animais irradiados letalmente) e in vitro - do crescimento de colónias em meios semi-sólidos . Verificou-se que a formação de colónias e actividade proliferativa de células progenitoras hematopoiéticos com o fenótipo de células CD34 + CD38 HLA-DR, isolado a partir de fígado fetal, medula óssea fetal e sangue do cordão umbilical, e excede em muito a capacidade proliferativa das células formadoras de colónias hematopoiéticas da medula óssea e do sangue periférico de um adulto. A análise quantitativa e qualitativa de HSC de várias origens revelou diferenças significativas, tanto no seu conteúdo relativo na suspensão celular quanto nas suas capacidades funcionais. O número máximo de células CD34 + (24,6%) foi encontrado no material de transplante obtido a partir da medula óssea fetal. A medula óssea de um humano adulto contém 2,1% de elementos celulares positivos para CD34. Entre as células mononucleares do sangue periférico de um humano adulto, apenas 0,5% têm um fenótipo CD34 +, enquanto que no sangue do cordão umbilical, seu número atinge 2%. Assim colónia capacidade de formação de células CD34 + de medula óssea fetal em 2,7 vezes excede a capacidade de crescimento clonal de medula óssea hematopoiéticas de células humanas adultas e células de sangue de cordão formar colónias consideravelmente maiores do que os elementos hematopoiicas isoladas a partir de sangue periférico de adultos: 65,5 a 40 e , 8 colônias / 105 células, respectivamente.

As diferenças na atividade proliferativa e na capacidade de formação de colônias de células-tronco hematopoiéticas estão associadas não apenas a diferentes graus de sua maturidade, mas também ao seu microambiente natural. Sabe-se que a intensidade da proliferação e a taxa de diferenciação de células estaminais é determinada pelo efeito regulatório integral de um sistema multicomponente de fatores de crescimento e citoquinas que são produzidos tanto pelas próprias células-tronco como pelos elementos celulares de seu microambiente matricial-estromal. O uso de populações de células purificadas e meios sem soro para fins de cultura celular permitiu caracterizar fatores de crescimento que exercem um efeito estimulante e inibitório sobre células-tronco de diferentes níveis, células progenitoras e células comprometidas em uma direção linear particular. Os resultados dos estudos realizados demonstram de forma convincente que a GSK, obtida de fontes com diferentes níveis de desenvolvimento ontogenético, diferem tanto fenotípica como funcionalmente. Para GSK, permanecendo em estágios iniciais de ontogenia, caracterizados por um alto potencial de auto-reprodução e alta atividade proliferativa. Tais células são distinguidas por um comprimento de telómero mais longo e estão sujeitas a comprometer-se com a formação de todas as linhas celulares hematopoiéticas. A reação do sistema imune à origem embrionária HSC está atrasada, uma vez que essas células expressam ligeiramente moléculas de HLA. Existe uma clara gradação do conteúdo relativo de HSC, sua capacidade de auto-renovação e o número de tipos de linhas de comprometimento que geram: CD34 + - células do fígado embrionário> células de sangue do cordão CD34 +> células de medula de células CD34 +. É importante que estas diferenças não são únicos para intra- e neo postanatalnomu período inicial de desenvolvimento humano, mas também ao longo da ontogenia - proliferativa e de formação de colónias actividade de HSC derivadas de medula óssea ou de sangue periférico de um adulto, inversamente proporcional à idade do dador.