Diagnóstico laboratorial de tuberculose

A tuberculose é uma doença que é fácil de diagnosticar em condições modernas e realizações científicas. O diagnóstico laboratorial de tuberculose é central para outros métodos de diagnóstico, segundo apenas os métodos de pesquisa de raios-X.

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Teste de sangue clínico

Em pacientes com tuberculose, as alterações na análise geral do sangue não são patognomônicas. Com formas limitadas e inativas de tuberculose, o eritrócito é hipocrômico em quantidade normal. Com infiltrados maciços ou pneumonia caseosa, com linfadenite caseosa generalizada, lesões intestinais específicas, bem como com grandes sangramentos pulmonares ou pós-operatórios, eritropenia e microcitose, oligochromasia e policromasia. A macrocitose, e especialmente o poikilotsitoz, encontram-se muito menos frequentemente, geralmente com anemia grave. O número de reticulócitos com estágio compensado da tuberculose varia de 0,1 a 0,6%, com um subcompensado - de 0,6 a 1,0%, e o descompensado é caracterizado por 1% dos reticulócitos.

Quando a tuberculose, em alguns casos, pode haver uma leucocitose moderada (até 15000 de leucócitos.), Menos radiação, que ocorre em 2-7% de pacientes com as formas de processo ocorrem limitados e fáceis e em 12,5% - por tuberculose pulmonar destrutiva e progressiva .

As mudanças mais freqüentes ocorrem na fórmula de leucócitos. Marcar a neutrofilia relativa e absoluta, uma mudança moderada da fórmula leucocitária para a esquerda antes dos promielócitos. Os mielípos são muito raros no caso de tuberculose não complicada. Um aumento no número de neutrófilos com granularidade patológica no hemograma de um paciente com tuberculose sempre indica a duração do processo: em pacientes com tuberculose grave, quase todos os neutrófilos contêm granularidade patológica. Quando o surto tuberculoso cessa, o deslocamento nuclear comparativamente rápido se aproxima do normal. A granularidade patológica dos neutrófilos geralmente persiste mais do que outras alterações no hemograma.

O conteúdo de eosinófilos no sangue periférico também varia dependendo da fase do processo e do estado alérgico do organismo. Sua quantidade diminui até a anesinofilia em surtos graves e prolongados da doença e, inversamente, aumenta com a reabsorção de infiltrados e derrames pleurais, bem como nas formas iniciais de tuberculose primária.

A maioria das formas de tuberculose primária é acompanhada por linfopenia, que às vezes é observada por vários anos, mesmo após a cicatrização de mudanças específicas. A tuberculose secundária na fase de exacerbação, dependendo da gravidade do processo, pode ser acompanhada por um número normal de linfócitos ou linfopenia.

Entre os testes para avaliar o processo de tuberculose, a determinação da taxa de sedimentação de eritrócitos (ESR), que é importante para avaliar o curso do processo de tuberculose e identificar suas formas ativas, ocupa um lugar especial. O aumento da ESR indica a presença de um processo patológico (infeccioso-inflamatório, purulento, séptico, hemoblastose, linfogranulomatose, etc.) e serve como um indicador de sua gravidade, no entanto, os índices ESR normais nem sempre indicam a ausência de patologia. A aceleração da sedimentação de eritrócitos é facilitada pelo aumento do conteúdo de globulinas, fibrinogênio, colesterol no sangue e uma diminuição da viscosidade do sangue. Desacelerar a sedimentação de eritrócitos é característico de estados acompanhados de hemoconcentração, aumento do conteúdo de albuminas e ácidos biliares.

O hemograma em pacientes com tuberculose muda durante o tratamento. As mudanças hematológicas desaparecem mais rápido, mais bem sucedida a intervenção terapêutica. No entanto, deve-se ter em mente o efeito sobre a hemopoiese de vários antibacterianos. Eles geralmente causam eosinofilia, em alguns casos - leucocitose e, mais frequentemente, leucopenia até agranulocitose e reação reticular linfóide. O controle hematológico sistemático e a análise correta dos dados obtidos são essenciais para avaliar o estado clínico do paciente, a dinâmica do processo e a eficácia do tratamento utilizado.

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Análise clínica da urina

Com a tuberculose do sistema urinário, a análise de urina é o principal método de diagnóstico laboratorial. Você pode observar leucocitúria, eritrocitúria, proteinúria, hipertensão, micobactéria tuberculosa, bacteriúria inespecífica.

A leucocitria é o sintoma mais freqüente de tuberculose do sistema urinário antes da realização de quimioterapia específica e está ausente somente em casos excepcionais, por exemplo, com obliteração completa do lúmen ureteral. O teste de Nechiporenko (determinação do número de leucócitos em 1 ml de urina) ajuda a avaliar mais objetivamente o grau de leucocitúria na nefrotuberculose e, em alguns casos, a revelá-la em uma análise geral normal da urina. No entanto, deve ser levado em consideração que a leucocitria pode ocorrer em pielonefrite aguda e crônica, cistite, uretrite, cálculos renais e ureterais.

Erythrocyturia. Bem como a leucocitúria. São considerados um dos sinais laboratoriais mais frequentes de tuberculose do sistema genitourinário. A freqüência de hematúria depende da prevalência do processo, aumenta à medida que o processo de tuberculose destrutiva se desenvolve no rim. A erritrocturia sem leucocitúria é mais típica para os estágios iniciais da tuberculose renal. Hematuria, que predomina sobre a leucocitria, é um argumento importante a favor da tuberculose renal em sua diferenciação com pielonefrite não específica.

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Teste de sangue bioquímico

Com a tuberculose, mudanças em alguns parâmetros bioquímicos dependem principalmente da fase do processo, complicações e várias doenças concomitantes. Em pacientes com tuberculose inativa dos pulmões e outros órgãos, as frações proteicas e protéicas totais do soro sanguíneo são inalteradas e determinam seu conteúdo normal.

Nas formas agudas da doença, bem como com exacerbação e progressão de formas crônicas de tuberculose, o coeficiente albumina-globulina diminui.

A determinação da bilirrubina direta e total, aspartato aminotransferase (ACT), alanina aminotransferase (ALT) no soro de sangue é essencial na avaliação do estado funcional e do dano hepático orgânico na tuberculose e suas complicações. Determinação dinâmica do nível de aminotransferases. A bilirrubina no tratamento de pacientes com tuberculose, especialmente em formas graves, é um componente obrigatório de um exame bioquímico de pacientes com tuberculose e é realizada mensalmente.

A avaliação do estado funcional dos rins inclui a determinação da creatinina sérica e o cálculo da taxa de filtração glomerular de acordo com a fórmula Cockcroft-Gault. O cálculo da taxa de filtração glomerular utilizando a amostra de Reberg dá resultados menos precisos.

O principal objetivo dos estudos bioquímicos dinâmicos de pacientes com tuberculose é monitorar o curso do processo, detecção atempada de efeitos colaterais de drogas e correção adequada dos distúrbios homeostáticos resultantes.

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Aplicação de métodos bioquímicos de investigação em tuberculose extrapulmonar

O indicador mais informativo é o conteúdo de ácido tuberculostárico em fluidos biológicos, mas sua definição está associada a dificuldades técnicas (a necessidade de cromatografia gasosa e espectrometria de massa).

Medição prospectiva da atividade da adenosina desaminase - uma enzima, determinada em líquidos: sinovial, pericárdico, ascitico ou espinhal. Os principais produtores de adenosina desaminase são linfócitos e monócitos. A determinação da atividade da adenosina desaminase em fluidos biológicos facilita o diagnóstico de sinovite tuberculosa, tuberculose de linfonodos, meningite tuberculose, serosite tuberculosa.

Alguns indicadores bioquímicos devido à sua não especificidade são determinados apenas em fluidos biológicos, perto do foco da lesão. Medir o nível de indicadores em resposta à injeção subcutânea ou intradérmica de tuberculina (geralmente antes e 48 e 72 horas após). Depois disso, o grau de incremento do nível do marcador (em%) é calculado em relação ao nível inicial.

Determinação ótima na urina da atividade de uma enzima específica de órgão da transamnidase, cuja aparência é observada quando os rins de várias naturezas são afetados. O estudo da transamidinasa é justificado apenas em condições de injeção subcutânea de tuberculina, a fim de exacerbar o processo inflamatório local. Determine a atividade da transamidina na urina inicialmente e 24-72 horas após a introdução da tuberculina TE 50 TE. A ampliação da fermentação em 2 vezes e mais permite que 82% dos casos diferenciem a tuberculose ativa dos rins da exacerbação da pielonefrite crônica.

Com a tuberculose dos órgãos genitais femininos, as concentrações de haptoglobina e dialeto de malonato no sangue são determinadas em condições de teste provocador de tuberculina. A tuberculina injectada subcutaneamente em uma dose de 50 TE e 72 horas depois realizou um segundo estudo bioquímico. No caso da etiologia da tuberculose, o grau de aumento no nível de haptoglobina não é inferior a 28% eo nível de malondialdeído é de 39% ou mais. A determinação da atividade da adenosina desaminase em um fluido peritoneal obtido a partir do espaço Douglas também é utilizada. O punctate é reexaminado 72 horas após a injeção intradérmica de tuberculina em doses de 0,1 TE e 0,01 TE na projeção dos órgãos genitais internos na parede abdominal anterior. A favor do processo de tuberculose, um aumento na atividade da adenosina desaminase é de 10% ou mais em relação ao inicial.

Quando o olho é afetado, a reação focal que ocorre no olho em resposta à estimulação antigênica é examinada. Não é desejável desenvolver uma resposta pronunciada, acompanhada de uma diminuição das funções visuais. Uma vez que a avaliação das reações focais mínimas é muitas vezes difícil, para a objetivação da conclusão recomenda-se orientar em paralelo e no grau de crescimento no soro sanguíneo de haptoglobina ou adenosina desaminase.

Todos os estudos bioquímicos devem ser realizados em conjunto com outros métodos.

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Pesquisa do sistema de coagulação do sangue

A relevância do estudo do estado do sistema de coagulação do sangue em fisiologia deve-se à presença de hemoptise ou hemorragia pulmonar em vários pacientes com tuberculose, além de complicações de hemocoagulação no tratamento cirúrgico da tuberculose. Além disso, o fluxo latente de hemocoagulação intravascular que acompanha naturalmente a tuberculose afeta o curso da doença e a eficácia da quimioterapia.

Em pacientes com tuberculose pulmonar com predominância do componente exsudatório da inflamação, observa-se uma diminuição da atividade sanguínea anticoagulante. Em pacientes com baixa prevalência de lesão específica nos pulmões com predominância do componente produtivo da inflamação, a hemocoagulação intravascular não é significativamente expressa. Em pacientes com tuberculose pulmonar com hemoptise e sistema de coagulação do sangue estado hemorragia pulmonar é diferente: em doentes com baixa perda de sangue no gemoptoe altura ou imediatamente após a sua terminação, há um aumento acentuado da capacidade de coagulação do sangue devido à intensificação grave de trombinoobrazovaniya mantendo ao mesmo tempo aumento da coagulação "estrutural". Em pacientes com perda de sangue massiva, observa-se uma diminuição do potencial de coagulação devido a uma diminuição da concentração de fibrinogênio. Actividade do Fator XIII, contagem de plaquetas. Na fase de tratamento cirúrgico, pacientes com formas limitadas de tuberculose não apresentam distúrbios leves e significativos com o sistema homeostático. Em pacientes com processos avançados na realização de pneumon ou pleuropneumonectomia, uma síndrome de ICD geralmente se desenvolve, o que pode adquirir as formas de uma "segunda doença".

Para monitorar o estado do sistema de coagulação em pacientes com tuberculose pulmonar, é necessário determinar o tempo de tromboplastina parcial ativado (APTT), fibrinogênio, tempo de trombina, índice de protrombina e tempo de sangramento e tempo de coagulação sanguínea.

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Pesquisa hormonal

As observações experimentais e clínicas modernas indicam a presença de alterações no estado hormonal em uma inflamação pulmonar tuberculosa específica. Está provado que a correção da disfunção hipofisária-adrenal, hipofisária-tireóide e função pancreática em combinação com terapia anti-tuberculose promove a ativação da fibrogênese e reparo no foco da inflamação específica.

O estado funcional do sistema hipofisário-tireoideiro é avaliado pelo conteúdo de triiodotironina (T ₃ ), tiroxina (T ₄ ), hormônio estimulante da tireóide da pituitária (TSH) no soro sanguíneo . Está estabelecido que o hipotireoidismo subclínico é detectado em 38-45% dos pacientes com tuberculose pulmonar, e na maioria das vezes é diagnosticado com formas disseminadas e fibroso-cavernosas do processo. Sob estas mesmas formas mais dramaticamente reduzidos níveis de ambos T ₃ e T ₄, e chega um desequilíbrio destas hormonas na forma de aumentar a proporção de T ₄ / T _s.

A função do córtex adrenal é avaliada pelo nível de cortisol no soro sanguíneo e a função incremental do pâncreas pela concentração da insulina reativa. Na fase aguda da doença infecciosa, aumenta a necessidade de cortisol e insulina endógenos. A hiperinsulinemia também atesta a resistência à insulina dos tecidos do corpo, que é típica de qualquer processo inflamatório ativo, em particular, específico. A determinação da função glucocorticóide das glândulas supra-renais com tuberculose pulmonar ativa permite revelar a presença de hipercorticismo na maioria dos pacientes. As concentrações normais de cortisol no sangue de um paciente com inflamação infecciosa no período agudo devem ser consideradas como uma deficiência relativa da função glucocorticóide do córtex adrenal, que pode servir como base para a realização de terapia de substituição com doses adequadas de glucocorticóides.

Quase um terço dos pacientes com tuberculose pulmonar pode estabelecer que o nível de insulinemia neles é bastante baixo e se aproxima do limite inferior da norma, enquanto que 13-20% observam hiperinsulinismo significativo. Ambos hipo e hiperinsulinismo relativo são fatores de alto risco para o desenvolvimento de violações do metabolismo de carboidratos de graus variados. Essas mudanças na atividade funcional das células B do pâncreas requerem monitoramento regular da glicemia em pacientes com tuberculose e prevenção atempada do diabetes mellitus. Além disso. Isso serve como uma justificativa adicional para a conveniência de usar doses fisiológicas de insulina na terapia complexa da tuberculose.

Em geral, a redução dos níveis de hormônio tireoidiano, seu desequilíbrio, hipercortisolemia e hiperinsulinismo é maior em pacientes com tuberculose grave, com extensas lesões pulmonares e sintomas graves de intoxicação tuberculosa.

Diagnóstico microbiológico da tuberculose

Estudos microbiológicos são necessários na identificação de pacientes com tuberculose, verificando o diagnóstico, monitorando e corrigindo a quimioterapia, avaliando os resultados do tratamento, ou seja, a partir do momento em que o paciente está registrado com tuberculose antes de retirá-lo.

Todos os programas e projetos epidemiológicos são baseados em uma avaliação do número de excretores bacterianos, que não podem ser feitos sem o uso de métodos laboratoriais para detectar a micobactéria da tuberculose. Em uma pesquisa sobre a chamada população não organizada, a porcentagem de invasores bacterianos atinge 70 ou mais, o que torna os métodos de laboratório um meio suficientemente efetivo para identificar os pacientes com tuberculose entre esse grupo populacional.

Métodos microbiológicos tradicionais para diagnosticar tuberculose são estudos bacterioscópicos e culturais. Métodos modernos consideram o cultivo de mycobacterium tuberculosis em sistemas automatizados, a definição de PCR. No entanto, todos estes métodos necessariamente se combinam com métodos bacteriológicos clássicos.

Coleção de material de diagnóstico

A eficácia dos estudos laboratoriais depende em grande medida da qualidade do material de diagnóstico. O cumprimento das regras para a coleta, armazenamento e transporte de material de diagnóstico e a implementação exata do algoritmo de avaliação do paciente afetam diretamente o resultado e asseguram a segurança biológica.

Para testar a tuberculose, é utilizada uma variedade de materiais. Devido ao fato de que a tuberculose pulmonar é a forma mais comum de tuberculose, o principal material para o estudo é o escarro e outros tipos de árvores traqueobrônquicas a serem separadas: o desprendimento do trato respiratório superior obtido após inalação de aerossol: rubor brônquico; enxaguamentos broncoalveolares; material obtido por broncoscopia, biopsia transtraqueira e intrapulmonar: aspiração dos brônquios, derrames laríngeos, exsudatos, esfregaços de feridas, etc.

A eficácia da pesquisa aumenta se uma coleção controlada de material de um paciente for realizada. Para este fim, uma sala especialmente equipada é alocada ou são comprados táxis especiais. A coleção de material é um procedimento perigoso, portanto, é necessário coletar material para pesquisa, observando as regras de segurança infecciosa.

O material para teste em mycobacterium tuberculosis é coletado em garrafas estéreis com tampas bem ferradas para evitar a contaminação do meio ambiente e proteger o material coletado da contaminação.

Os frascos para recolha de material de diagnóstico devem satisfazer os seguintes requisitos:

• deve ser feito de material resistente ao impacto;
• deve derreter facilmente durante o autoclave;
• seja de volume suficiente (40-50 ml):
• têm uma ampla abertura para coleta de escarro (diâmetro não inferior a 30 mm);
• seja fácil de manusear, transparente ou translúcido, para que você possa avaliar a quantidade e a qualidade da amostra coletada sem abrir a tampa.

Para obter resultados de pesquisa ótimos, as seguintes condições devem ser observadas:

• Recolher o material antes do início da quimioterapia;
• O material para o estudo deve ser coletado antes da ingestão matinal de alimentos e remédios;
• Para pesquisa, é desejável coletar pelo menos 3 amostras de fleuma da manhã. Reúna o escarro por 3 dias consecutivos;
• o material coletado deve ser entregue ao laboratório o mais rápido possível:
• no caso em que é imediatamente impossível entregar o material ao laboratório, é armazenado no frigorífico a uma temperatura do ar de 4 ° C por não mais de 48 horas;
• Ao transportar o material, é necessário acompanhar de perto a integridade dos frascos.

O escarro corretamente coletado é mucoso ou mucopurulento. O volume ideal do escarro testado é de 3-5 ml.

O escarro é coletado sob a supervisão de um profissional médico. As pessoas responsáveis pela coleta de escarro devem seguir a implementação de certas regras:

• é necessário explicar ao paciente o propósito do estudo e a necessidade de tosse não saliva ou muco nasofaríngeo, mas o conteúdo do trato respiratório profundo. Isso pode ser conseguido como resultado de uma tosse produtiva que ocorre após várias respirações profundas (2-3). Também é necessário avisar o paciente que ele deve enxaguar a boca com água fervida, para remover a parte principal da microflora crescendo na cavidade oral e resíduos alimentares que impedem o exame de escarro;
• um trabalhador médico que participa na coleta de escarro, além de um roupão de banho e um chapéu, deve usar uma máscara, luvas de borracha e um avental de borracha;
• ficando de costas para o paciente, ele é recomendado para manter a garrafa o mais perto possível dos lábios e imediatamente separa-a na fleuma enquanto tossa, e deve ser providenciado que o fluxo de ar seja dirigido para longe do trabalhador de saúde:
• Após a conclusão da coleta de escarro, o trabalhador de saúde deve fechar cuidadosamente o frasco com uma tampa e avaliar a quantidade e a qualidade do escarro coletado. Em seguida, o frasco é rotulado e colocado em um bix especial para transporte para o laboratório.

Se o paciente não produz catarro, na noite anterior e no início da manhã no dia da coleta do material necessário para dar-lhe um expectorante :. Um extrato das raízes de marshmallow (mukaltin), bromexina, ambroxol, etc. - ou aplicar uma inalação irritante usando o equipamento instalado na sala de recolher fleuma. O material coletado desta forma não está sujeito à conservação e deve ser examinado no dia da coleta. Para evitar o "abate" no laboratório na direção deve fazer uma marca especial.

Se os estudos microbiológicos não forem realizados nesta instalação, o material de diagnóstico coletado deve ser entregue centralmente ao laboratório, desde que o material seja preservado nos intervalos entre as entregas na geladeira ou com o uso de conservantes. Entregue material ao laboratório em caixas de transporte, que podem ser facilmente desinfectadas. Cada amostra deve ser fornecida com o rótulo apropriado, e todo o lote deve ser preenchido com um formulário de acompanhamento.

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Modos e frequência de exame de pacientes

No inicial, o chamado diagnóstico, exame do paciente para tuberculose, é necessário examinar pelo menos 3 porções de escarro por 2 ou 3 dias. Coletados sob a supervisão do pessoal médico, o que aumenta a eficácia da microscopia.

O rastreio primário da tuberculose deve ser realizado por todas as instituições de diagnóstico médico do sistema de saúde. Recentemente, os chamados centros de microscopia, equipados com microscópios modernos e equipamentos para segurança epidêmica, foram organizados com base em laboratórios de diagnóstico clínico para melhorar a eficiência do exame inicial.

Nas instalações anti-TB, é utilizado um teste de triagem que inclui exame de escarro ou outro material de diagnóstico pelo menos 3 vezes por 3 dias. Durante o tratamento, os estudos microbiológicos são realizados regularmente pelo menos uma vez por mês durante a fase de quimioterapia intensiva. Na transição para a fase de tratamento, os estudos são realizados menos frequentemente - com um intervalo de 2-3 meses, enquanto a freqüência do estudo é reduzida para dois.

Características da coleção de material de diagnóstico para tuberculose extrapulmonar

A peculiaridade do material patológico em formas extrapulmonares de tuberculose é a baixa concentração de mycobacterium tuberculosis nele, que requer métodos mais sensíveis de exame microbiológico, em primeiro lugar, os métodos de semeadura no meio nutriente.

Com a tuberculose do sistema genitourinário, a urina é o material de estudo mais acessível. A coleta de urina deve ser feita por uma enfermeira especialmente treinada.

Os órgãos genitais externos são lavados com água com sabão ou com uma fraca solução de permanganato de potássio. A abertura externa da uretra é cuidadosamente tratada. Em um frasco estéril, uma porção média da urina da manhã é coletada: nos homens, naturalmente, nas mulheres, usando um cateter. A urina da pelve renal é coletada em tubos estéreis com cateterização de um ou dois rins, no último caso - necessariamente separada de cada rim. Uma pequena quantidade dessa urina é centrifugada, o sedimento é examinado.

Nos homens, os espermatozóides, os testículos pontuais, o secreto da próstata é submetido a centrifugação para obter um precipitado. Com qualquer localização de um processo específico na área genital em homens, a massagem da próstata pode promover a secreção de secreções contendo mycobacterium tuberculosis.

O sangue menstrual nas mulheres é coletado sugando ou usando um boné Kafka. O material obtido é liberado dos glóbulos vermelhos, lavando-o com água destilada seguido de centrifugação. O precipitado é examinado.

As alocações do canal cervical do útero são coletadas em alguma capacidade ou tampa de Kafka, ou seja, é desejável acumular 1-2 ml de material patológico.

Material obtido a partir de intervenções operacionais nos rins, órgãos genitais. Com biópsias, raspas do endométrio, homogeneizar. Para fazer isso, é colocado em uma argamassa esterilizada e completamente esmagado com tesoura esterilizada. Para a suspensão obtida, adicione areia de rio estéril em uma quantidade igual à sua massa, adicione 0,5-1,0 ml de solução isotônica de cloreto de sódio e depois mole tudo para a formação de uma massa semelhante a gruela com a adição de solução isotônica de cloreto de sódio (4-5 ml). Em seguida, a massa é deixada sedimentar durante 1-1,5 minutos, o sobrenadante é examinado.

Tuberculose de ossos e articulações. O punteado (pus de abscessos) obtido com uma seringa estéril é colocado em pratos estéreis e imediatamente entregue ao laboratório. A pipeta estéril, previamente humedecida com solução isotônica estéril de cloreto de sódio, leva 2-5 ml de pus, transfira-a para uma garrafa de grânulos e adicione mais 2-3 ml de solução isotônica de cloreto de sódio. A garrafa é fechada com uma cortiça e agitada em um aparelho de palhaça por 8 a 10 minutos. A suspensão homogeneizada é examinada.

Em formas fistulosas de tuberculose osteoarticular, é retirado do fístula. A descarga copiosa é coletada diretamente em um tubo de ensaio. Em casos de excreção escassa de pus, a fístula é lavada com uma solução esterilizada de cloreto de sódio isotônico e a água de lavagem coletada em um tubo de ensaio ou um pedaço de um tampão impregnado com pus é enviada para o estudo.

O material cirúrgico obtido durante intervenções cirúrgicas nos ossos e articulações pode consistir em massas necróticas purulentas, granulações, tecido cicatricial, tecido ósseo, tecido da membrana sinovial e outros substratos. Seu tratamento é realizado, como na tuberculose dos rins.

Estudo microbiológico do líquido sinovial em solução de citrato de sódio a 3% (razão 1: 1) para prevenir a coagulação é realizada imediatamente após a punção.

Tuberculose dos gânglios linfáticos. O pus, extraído durante a punção dos gânglios, também é examinado. Como o pus dos abscessos. Os tecidos dos gânglios linfáticos obtidos durante intervenções cirúrgicas, biópsias, são examinados, assim como outras formas de tuberculose.

O estudo das massas de fezes no mycobacterium tuberculosis é extremamente raro, devido à quase total falta de resultados positivos.

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Microscopia de Mycobacterium

A microscopia de escarro é um método relativamente rápido, simples e barato que deve ser usado em todos os casos com suspeita de tuberculose. Além disso, este estudo é conduzido para avaliar a eficácia da quimioterapia e verificar a recuperação ou falha no tratamento se não houver teste de cultura.

São utilizados dois métodos de exame microscópico:

• método de microscopia direta, quando um esfregaço é preparado diretamente do material de diagnóstico;
• Método de microscopia de um sedimento preparado a partir de material tratado com descontaminante para cultura.

O primeiro método é utilizado nos laboratórios onde apenas são realizados estudos microscópicos (laboratórios clínicos e de diagnóstico da rede médica geral).

Os melhores resultados do exame microscópico são obtidos concentrando o material de diagnóstico (por exemplo, por centrifugação).

Para detectar mycobacterium tuberculosis com uma probabilidade de 50% ao realizar a microscopia, 1 ml de escarro deve conter mais de 5000 células microbianas. O escarro de pacientes com formas pulmonares de tuberculose geralmente contém uma quantidade significativa de bactérias ácidas-rápidas, o que permite que elas sejam detectadas de forma confiável pela bacterioscopia. A sensibilidade diagnóstica deste método pode ser melhorada examinando várias amostras de escarro de um paciente. Um resultado negativo de um exame bacterioscópico não exclui o diagnóstico de tuberculose, pois o escarro de alguns pacientes contém menos micobactérias do que pode ser detectado com microscopia. A má preparação do esfregaço de escarro também pode causar um resultado negativo de um exame bacterioscópico.

O método mais comum para a detecção de micobactérias ácidas no esfregaço é a cor de acordo com Tsiol-Nelsen. O método baseia-se na penetração de fuchsina carbólica em uma célula microbiana através de uma membrana que inclui uma camada de lípido ceroso, ao mesmo tempo que aquece e forte ação de corrosão do fenol. A descoloração subsequente do esfregaço com uma solução a 25% de ácido sulfúrico ou ácido clorídrico a 3% conduz a uma descoloração de todas as estruturas não ácidas-rápidas. Os elementos descoloridos do esfregaço são corados com uma solução a 0,3% de azul de metileno. As micobactérias não percebem os corantes de anilina usuais, como resultado das quais as micobactérias ácidas são manchadas de vermelho-vermelho e outros micróbios e elementos celulares - em azul.

Para estudar os esfregaços corados por Tsilyu-Nelsen, use um microscópio binocular leve com um objetivo de imersão (ampliação de 90 ou 100 vezes) e uma ocular com uma ampliação de 7 ou 10 vezes. Explore 100 campos de visão, o que é suficiente para identificar micobactérias únicas no esfregaço. No caso de o resultado desse estudo ser negativo, para confirmação, é recomendável visualizar outros 200 campos de visão. Registre os resultados, indicando o número de bacilos ácido-rápidos detectados (KUM).

Além desta técnica, os fluorocromos de cor são usados para microscopia luminescente, o que permite alcançar os melhores resultados. O uso deste método aumenta a eficiência da microscopia em 10-15%. Ao tratar micobactérias com corantes luminescentes (auramina, rodamina, etc.), essas substâncias também se ligam às estruturas semelhantes à cera da célula microbiana. Ao irradiar células coloridas com uma fonte de luz excitante (um certo espectro de radiação ultravioleta), eles começam a brilhar com laranja ou luz vermelha brilhante em um fundo preto ou verde escuro. Devido ao alto brilho e contraste da imagem visível, a ampliação geral do microscópio pode ser reduzida 4-10 vezes, o campo de visão se alarga e o tempo de visualização da preparação diminui. Juntamente com isso, devido à profundidade de campo muito maior, você pode aumentar o conforto do estudo.

Quando o microscópio de fluorescência é usado para ver a mesma área, o esfregaço gasta significativamente menos tempo do que com microscopia de luz da coloração com Tsiol-Nelsen. Se, durante um dia útil, um microscópio examina cerca de 20-25 desses esfregaços, então, com a ajuda de microscopia de fluorescência, ele pode examinar mais de 60 a 80 amostras ao mesmo tempo. Os microscopistas experientes sabem que a coloração das células com uma mistura de auramina e rodamina é, de alguma forma, específica para os bacilos ácido-rápidos, que neste caso se parecem com palitos dourados. Os saprofitos são pintados em uma cor esverdeada.

Outra vantagem importante do método de microscopia de fluorescência - a capacidade de detectar Mycobacterium alterada, perdeu sob a influência de factores negativos, incluindo quimioterapia intensiva, propriedade kislotousotoychivosti e não é detectado em conexão com esta coloração de Ziehl-Nelsenu.

As desvantagens do método de microscopia de fluorescência incluem o custo relativamente alto do microscópio e sua operação. No entanto, em laboratórios centralizados ou de grande porte, onde a carga excede a norma de 3 técnicos de laboratório que trabalham com três microscópios convencionais, é mais barato usar um microscópio fluorescente em vez disso.

Os métodos bacterioscópicos têm especificidade bastante alta (89-100%). Cerca de 97% dos resultados positivos obtidos por qualquer método de microscopia são inequivocamente confirmados pelos resultados da semeadura.

Deve notar-se que, quando o exame microscópico do esfregaço de material patológico, é impossível determinar as espécies pertencentes às micobactérias ácidas rápidas identificadas. O método de microscopia nos permite apenas concluir sobre a presença ou ausência de microorganismos ácido-rápidos na preparação, o que é explicado pela existência, na natureza, de um grande número de microorganismos resistentes à tuberculose que são morfologicamente semelhantes às micobactérias.

Os resultados da microscopia são avaliados em unidades semi-quantitativas.

Para poder comparar os resultados de diferentes métodos de microscopia, são introduzidos coeficientes empíricos. Por exemplo, para comparar os resultados de esfregaços corados com corantes fluorescentes, a microscopia de luz de pesquisa de dados (1000 vezes de ampliação), é necessário dividir o número de bacilos ido-rápido detectado por um microscópio de fluorescência, o coeficiente correspondente na ampliação de 250 vezes - a 10, 450 vezes - para 4, com 630 vezes - para 2.

Características da microscopia para tuberculose extrapulmonar

A microscopia direta é realizada, bem como a microscopia de esfregaços preparados após o enriquecimento, seguido de coloração com Tsiol-Nelsen ou corantes luminescentes. A microscopia direta de esfregaços é ineficaz devido a uma baixa concentração de micobactérias no material e, portanto, é mais racional usar métodos de enriquecimento. O mais eficaz é a centrifugação. Se o material biológico for viscoso, a centrifugação é utilizada com homogeneização simultânea e liquefação do material, que é realizada usando centrífugas de alta velocidade com uma força de centrifugação de 3000 g e soluções de hipoclorito. Outros métodos de enriquecimento, como a micro-flotação, não são usados atualmente devido à formação de aerossóis biologicamente perigosos.

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O método cultural de diagnóstico de tuberculose

O método de semeadura, ou o método de cultura, é mais sensível do que o microscópio de esfregaço, e tem uma série de vantagens sobre o último. Ele permite detectar várias dúzias de micobactérias viáveis no material de teste e tem ótimo valor diagnóstico. Isto é especialmente importante quando se examina um material de pacientes recentemente diagnosticados ou tratados que liberam uma pequena quantidade de micobactérias.

Em comparação com a microscopia, a pesquisa de cultura permite aumentar o número de pacientes com TB diagnosticados em mais de 15-25%, bem como verificar a tuberculose em estágios iniciais, quando a doença ainda é passível de tratamento. Uma vantagem muito importante do teste de cultura é a possibilidade de obter uma cultura excitadora que possa ser identificada e estudada em relação à sensibilidade ao fármaco, a virulência e outras propriedades biológicas.

As desvantagens dos métodos de cultivo incluem a duração (o tempo de espera dos materiais chega a 10 semanas). Maior custo, complexidade do processamento de material de diagnóstico.

Princípios de tratamento prévio de material de diagnóstico

Métodos microbiológicos convencionais não podem ser utilizados na realização de estudos sobre tuberculose. Isso é devido ao fato. Que mycobacterium tuberculosis cresce muito devagar, e a maioria das amostras clínicas contém microorganismos piogênicos e putrefativos de crescimento rápido, fungos. O seu rápido crescimento em meios nutrientes ricos interfere no desenvolvimento de micobactérias e não permite isolar o agente causador da tuberculose, pelo que o material de diagnóstico deve ser pré-tratado antes da semeadura. Além disso, as micobactérias liberadas das vias aéreas do paciente são geralmente cercadas por uma grande quantidade de muco, dificultando a concentração. A este respeito, antes de plantar escarro e outros materiais similares, é necessária a sua liquefação, descontaminação.

Todos os detergentes e descontaminas têm um efeito tóxico mais ou menos pronunciado sobre as micobactérias. Como resultado do processamento, até 90% das micobactérias podem morrer. Para manter uma porção suficiente da população de micobacterianos, é necessário usar métodos de processamento suaves que, por um lado, possam suprimir microrganismos pirogênicos e putrefativos de crescimento rápido e, por outro lado, maximizar a sobrevivência das micobactérias presentes no material.

Dependendo do material, o seu grau de homogeneidade e de poluição para o pré-processamento usando várias descontaminante: Expectoração - solução de hidróxido de sódio a 4%, as soluções trohzameschonnogo fosfato de sódio a 10%, cloreto de benzalcónio, fosfato trissódico, NALC-NaOH (N-acetil-L-cisteína hidróxido de sódio) com uma concentração final de NaOH de 1%, para urina e outros materiais líquidos - solução de ácido sulfúrico a 3%, para amostras contaminadas, materiais contendo gordura - solução de ácido oxálico até 5%. Além disso, em alguns casos, são utilizadas enzimas, surfactantes (detergentes). O uso de Tween e alguns outros detergentes é acompanhado por uma morte menor de células micobacterianas (40-50% sobrevivem). No entanto, eles só podem ser usados para materiais líquidos. A maior distribuição do mundo foi o NALC-NaOH. Produzido em conjuntos. Este método permite alocar mais de 85% da população de células micobacterianas. A descontaminação de materiais sólidos contendo tecido é mais difícil, pois é difícil adivinhar o grau de dispersão do material durante o processo de homogeneização. Por exemplo, o tratamento de biópsias de gânglios linfáticos é freqüentemente acompanhado de uma maior freqüência de contaminação por flora estranha. Neste caso, pode-se usar 1% de etonium.

O material não homogêneo é homogeneizado com esferas de vidro na presença de descontaminantes. Os materiais líquidos são pré-centrifugados e apenas um precipitado é tratado.

Técnicas de semeadura e incubação

Após o pré-tratamento, o material é centrifugado, precipitando as micobactérias e aumentando o seu conteúdo no sedimento ("enriquecimento de lodo"). O precipitado resultante é neutralizado e inoculado (inoculado) com meios nutrientes densos ou tubos com meios líquidos (semilíquidos). Do resto do sedimento, esfregaços são preparados para exame microscópico. A técnica de semeadura deve evitar a contaminação cruzada do material de diagnóstico.

Para uma interpretação clínica confiável dos resultados de um estudo microbiológico, deve observar-se a seguinte regra: estudos microscópicos e culturais devem ser realizados em paralelo a partir da mesma amostra do material de diagnóstico.

Os tubos inoculados são colocados em um termostato a 37 ^° C durante 2 dias em posição horizontal. Isso garante uma absorção mais uniforme do material no meio de cultura. Após 2 dias, os tubos são transferidos para uma posição vertical e selados hermeticamente com tampas de borracha ou silicone para evitar a secagem da mídia semeada.

As culturas são incubadas a 37 ^sobre C durante 10-12 semanas com visualização semanal regular. Para cada visualização, os seguintes parâmetros são gravados:

• o período observado visualmente a partir do dia do crescimento da semeadura;
• taxa de crescimento (número de UFC);
• contaminação da cultura por uma flora microbiana estranha ou fungos (tais tubos são removidos);
• falta de crescimento visível. Os tubos são deixados no termostato até a próxima visualização.

Meios de nutrientes

Vários meios nutritivos são utilizados para o cultivo de micobactérias; denso, semi-líquido, líquido. No entanto, nenhum dos meios nutrientes conhecidos tem propriedades que garantem o crescimento de todas as células micobacterianas. Em conexão com isso, recomenda-se que 2-3 meios nutrientes de diferentes composições sejam utilizados simultaneamente para aumentar a eficácia.

A OMS recomenda o ambiente de Levenstein-Jensen como meio padrão para o isolamento primário do agente causador da tuberculose e para a determinação da sua sensibilidade ao fármaco. Este é um ambiente de ovo denso em que o crescimento de micobactérias é obtido nos dias 20 a 25 após a semeadura de um material bacterioscopicamente positivo. Culturas de material bacterioscopicamente negativo requerem um período de incubação mais longo (até 10-12 semanas).

Em nosso país, o E.R. Finn ovo ambiente Finn-II. Difere em que, em vez de L-asparagina, usa glutamato de sódio, o que desencadeia outras formas de sintetizar os aminoácidos das micobactérias. O crescimento aparece nesse meio um pouco antes, e a freqüência de alocação de micobactérias é 6-8% maior que no meio de Lowenstein-Jensen.

Para melhorar a eficácia do diagnóstico bacteriológico de tuberculose extrapulmonar, é aconselhável incluir meios modificados de Finn-II no complexo de meio nutritivo. Para acelerar o crescimento, adiciona-se adicionalmente ao meio nutriente Finn-II um glicolato de sódio 0,05%, que reduz a concentração de oxigênio. Para proteger os sistemas enzimáticos de micobactérias de produtos tóxicos de peroxidação lipídica no meio nutriente Finn-II, adiciona-se acetato de a-tocoferol antioxidante a uma concentração de 0,001 μg / ml. A semeadura do material de diagnóstico é realizada de acordo com um procedimento padrão.

Nos laboratórios anti-tuberculose da Rússia, outras modificações de meios nutrientes densos também são usadas; proposto G.G. Meio Nutricional Mordoviano "Novo", desenvolvido por V.A. Meios nutritivos anti-ácidos A-6 e A-9, etc.

Devido ao dano a vários sistemas metabólicos da célula microbiana durante a quimioterapia, parte da população de micobacterianos perde sua capacidade de se desenvolver normalmente em meios nutrientes normais e requer meios nutrientes osmoticamente equilibrados (semi-líquidos ou líquidos).

Avaliação e registro de resultados de semeadura de material de diagnóstico

Algumas cepas e espécies de micobactérias crescem lentamente, o crescimento pode aparecer mesmo no 90º dia. O número dessas culturas é pequeno, mas isso permite suportar culturas em um termostato por 2,5-3 meses.

As culturas virulentas de mycobacterium tuberculosis geralmente crescem em ambientes de ovos densos na forma de colônias de formas R de vários tamanhos e espécies. Colonias secas, enrugadas, marfim, ligeiramente pigmentadas. Em outras mídias, a colônia de mycobacterium tuberculosis pode ser mais úmida. Após um curso de quimioterapia ou durante o tratamento, colônias lisas com crescimento úmido (formas S) podem ser alocadas.

Ao isolar culturas, um conjunto de estudos especiais é usado para distinguir Mycobacterium tuberculosis de micobactérias não-tuberculose e saprófitos resistentes a ácidos.

Uma resposta positiva é dada após um exame microscópico obrigatório do esfregaço de Tsiol-Nelsen corado das colônias cultivadas. No caso de crescimento de micobactérias em esfregaços, são encontrados bastões vermelhos brilhantes que se encontram isoladamente ou em grupos formando clusters na forma de feltro ou trança. Em culturas jovens, especialmente aquelas isoladas de drogas quimioterápicas de longa duração, as micobactérias são distinguidas por polimorfismo pronunciado, até a presença de variantes curtas, quase cocócidas ou alongadas que se assemelham a fungos miceliais, juntamente com formas parecidas a bastões.

A taxa de crescimento das micobactérias é indicada pelo seguinte esquema: (+) - 1-20 cfu in vitro (excreção bacteriana escassa); (++) - 20-100 CFU in vitro (excreção bacteriana moderada); (+++) -> 100 CFU in vitro (abundante excreção bacteriana). No diagnóstico laboratorial de tuberculose, não é suficiente responder se a micobactéria é detectada por um ou outro método. Tem uma compreensão detalhada da extensão e natureza da população de micobacterianos, sua composição e propriedades. São esses dados que nos permitem interpretar corretamente o estado do processo, planejar táticas e corrigir o tratamento oportunamente.

Nos últimos anos, para acelerar o crescimento de micobactérias, foram propostos meios nutrientes em uma base de ágar com vários aditivos de crescimento e o uso de uma mistura de gás especial. Para obter o crescimento de micobactérias nesses meios, durante o cultivo, é criada uma atmosfera com alto teor de dióxido de carbono (4-7%). Incubadoras especiais de CO ₂ são utilizadas para este fim . No entanto, os sistemas automatizados mais desenvolvidos para o cultivo de micobactérias: MGIT-BACTEC-960 e MB / Bact.

Um desses sistemas é o sistema MGIT (tubo de indicação de crescimento de micobactérias), que pertence ao desenvolvimento de altas tecnologias e destina-se ao diagnóstico bacteriológico acelerado da tuberculose e à determinação da sensibilidade das micobactérias aos medicamentos de primeira linha e a certos medicamentos de segunda linha. O MGIT está focado em usá-lo como parte do dispositivo VASTES-960. Os microorganismos são cultivados em tubos especiais com um meio nutriente líquido com base no meio Middlebrook-7H9 modificado. Para estimular o crescimento de micobactérias e suprimir o crescimento de microflora estranha, utiliza-se MGIT Growth Supplement e uma mistura de medicamentos antibacterianos PANTA.

O crescimento de microorganismos é registrado de forma óptica. Baseia-se na fluorescência, que ocorre quando o oxigênio é consumido por micobactérias durante o crescimento. O corante fluorocromico dependente de oxigênio é encontrado na parte inferior de um tubo de ensaio especial e coberto com uma camada de silicone. A propagação de micobactérias leva a uma diminuição da quantidade de oxigênio no tubo e a uma diminuição da sua concentração, o que provoca um aumento da fluorescência, que se torna visível quando o tubo é irradiado com luz ultravioleta e é gravado automaticamente por fotossensores incorporados no dispositivo VASTES-960. A intensidade da luminescência é registrada em unidades de crescimento (unidades de crescimento GU). Os dados de crescimento são gravados no computador, onde eles podem ser salvos automaticamente. A análise computacional das curvas de crescimento pode fornecer informações sobre a presença de vários grupos de micobactérias, incluindo não tuberculose, e também ajuda a avaliar as propriedades de crescimento das micobactérias.

Como resultado da introdução de tais sistemas, o tempo para o crescimento de micobactérias diminuiu significativamente, com média de 11 dias em VASTES-960 e 19 dias em MB / Bact versus 33 dias em um meio nutriente denso padrão. Deve-se notar que esses sistemas requerem pessoal altamente qualificado. A semeadura do material em mídia líquida é necessariamente acompanhada por semeadura no meio Levenstein-Jensen, que desempenha o papel de um backup nos casos em que a micobacteria tuberculose não dá origem a outros meios de comunicação.

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Determinação da sensibilidade ao fármaco das micobactérias

A determinação do espectro e o grau de sensibilidade das micobactérias aos medicamentos antituberculosos é de grande importância clínica, bem como a avaliação epidemiológica da propagação da tuberculose com resistência aos medicamentos. Além disso, o monitoramento da resistência aos medicamentos permite avaliar a eficácia do programa de tuberculose como um todo, sendo um indicador integral do desempenho de todos os componentes das atividades antituberculosas.

Multiplicidade e tempo de sensibilidade à droga:

• antes do início do tratamento, uma vez para determinar a estratégia e as táticas de tratamento:
• quando isolados de culturas doentes de vários materiais (escarro, fluido BAL, urina, exsudados, licor, etc.), todas as cepas isoladas são examinadas:
• no final da fase intensiva de tratamento na ausência de dinâmicas clínicas e radiológicas:
• Se for necessário alterar o regime de tratamento nos seguintes casos:
  • ausência de esfregaço de escarro;
  • re-isolamento da cultura após o esfregaço negativo;
  • um aumento drástico no número de CMB no cotonete após o declínio inicial. Sabe-se que as cepas de mycobacterium tuberculosis, que são heterogêneas em termos de sensibilidade ao fármaco, são isoladas do material de um paciente com tuberculose. A sensibilidade das cepas aos fármacos anti-tuberculose pode diferir na gama de fármacos, grau, frequência e taxa de ocorrência de resistência.

O grau de resistência à droga da mycobacterium tuberculosis é determinado de acordo com critérios estabelecidos que são orientados para o significado clínico da resistência e dependem da atividade antituberculosa do fármaco, sua farmacocinética, concentração no foco da lesão. A dose terapêutica máxima e assim por diante.

A determinação da sensibilidade à droga das micobactérias é atualmente realizada por métodos microbiológicos:

• Concentrações absolutas (método de diluição em meios nutrientes densos ou líquidos),
• proporções
• coeficiente de resistência.

Geralmente, a resistência é manifestada sob a forma de crescimento visual observado das colônias de mycobacterium tuberculosis, mas existem métodos que induzem crescimento nos estágios iniciais da divisão celular de micobactérias na forma de reações de cor. Estes métodos reduzem o tempo de teste de 3-4 a 2 semanas.

Como um padrão na Rússia, o método de concentrações absolutas recomendado pelo Comitê de Quimioterapia da OMS tem sido amplamente difundido, o que é o mais simples do ponto de vista metodológico, mas requer alta padronização e precisão dos procedimentos laboratoriais. O teste de susceptibilidade à droga consiste num conjunto de tubos de ensaio com um meio nutriente modificado com fármacos anti-TB. O kit consiste em 2-3 tubos com diferentes concentrações de cada um dos fármacos utilizados, um tubo de controle com meio sem preparação e um tubo contendo 1000 μg / ml de ácido salicílico ou 500 μg / ml de ácido paranitrobenzóico para detectar o crescimento de micobactérias não tuberculosas.

Para preparar um conjunto de meios com preparações, é utilizado um meio Levenstein-Jensen modificado (sem amido), que é vertido em frascos. Em cada um dos frascos, é adicionado um volume específico de diluição apropriada da preparação antitubercula. O conteúdo dos frascos é completamente misturado, derramado em tubos e dobrado numa posição inclinada durante 40 minutos a uma temperatura de 85 ° C. Recomenda-se a bobina do meio em um rebobinador elétrico com controle automático de temperatura. Quarta-feira com medicamentos anti-TB

As séries da 1ª série podem ser armazenadas no frigorífico a 2-4 ° C durante 1 mês, com preparações da segunda fila - não mais de 2 semanas. O armazenamento de meios com preparações à temperatura ambiente é inaceitável. Ao preparar soluções de medicamentos antituberculosos, sua atividade é levada em consideração, calculando a concentração ajustada para o peso molecular da parte não específica da preparação, pureza, etc. Para determinar a sensibilidade ao fármaco, apenas são utilizadas substâncias quimicamente puras.

O princípio do método é determinar a concentração de um medicamento antituberculoso que inibe o crescimento de uma parte significativa da população de micobacterianos. Se for feito corretamente, esse método possui boa confiabilidade.

Antes do teste, é necessário garantir que a cultura isolada de mycobacterium tuberculosis não tenha microflora estranha. A partir da cultura de micobactérias em solução de cloreto de sódio a 0,9%, prepara-se uma suspensão homogênea contendo 500 milhões de corpos microbianos por ml (padrão de turbidez óptica de 5 unidades). A pasta resultante é diluída com solução de cloreto de sódio a 0,9% (1:10) e adiciona-se 0,2 ml de pasta em cada tubo do conjunto de meios de cultura. Os tubos semeados são colocados num termostato a 37 ° C e mantidos numa posição horizontal durante 2-3 dias, de modo que a superfície inclinada do meio de cultura seja uniformemente inoculada com a suspensão de Mycobacterium tuberculosis. Os tubos são então transferidos para uma posição vertical e incubados por 3-4 semanas. Os resultados são registrados após 3-4 semanas.

Uma vez que o tempo de excreção excrecionante do material clínico em meio nutriente é de pelo menos 1-1,5 meses, os resultados da determinação da sensibilidade ao fármaco por este método podem ser obtidos não antes de 2-2,5 meses após a semeadura do material. Esta é uma das principais desvantagens do método.

Interprete os resultados da determinação da sensibilidade à droga das micobactérias com base em determinados critérios. Em meios densos, a cultura é considerada sensível à concentração do fármaco que está contida no meio se o número de colônias de micobactérias cultivadas neste tubo com o medicamento não exceder 20, com crescimento abundante em um tubo de controle sem drogas. Somente na presença de mais de 20 colônias, a cultura é considerada resistente a essa concentração. Na prática, ao obter resultados de crescimento em tubos de ensaio cerca de 20 cfu. é necessário notificar a unidade clínica de que a sensibilidade ou resistência neste caso é limítrofe, uma vez que às vezes pode explicar a dinâmica difusa dos indicadores clínicos.

Para vários medicamentos, é estabelecida uma certa concentração, na qual é observada a reprodução da proporção crítica da população de micobacterianos. Essas concentrações são chamadas de "críticas". Como critério de estabilidade, é utilizada a magnitude do crescimento da população de micobacterianos em meio nutriente com uma preparação em uma concentração crítica.

Na prática doméstica de TB, na determinação da resistência aos medicamentos, eles não se limitam a determinar apenas concentrações críticas. Isso é devido ao fato. Que uma definição expandida do nível de resistência ao fármaco do patógeno permite ao clínico formular mais corretamente as táticas de quimioterapia, utilizando o conhecimento sobre os efeitos potenciadores das combinações de drogas, antecipar a resistência cruzada ou usar medicamentos mais eficazes do grupo de medicamentos antituberculosos utilizados.

O método de concentração absoluta é o mais simples, mas também é o mais sensível aos erros cometidos quando é executado. Mais confiável, especialmente na determinação da sensibilidade aos medicamentos de segunda linha, e comum fora da Rússia é o método das proporções. Ele leva em conta as deficiências do método de concentrações absolutas, mas em execução é mais laborioso.

O método é muito semelhante ao método de concentração absoluta. A preparação de tubos de ensaio com medicamentos é realizada da mesma maneira. Como no método de concentração absoluta. No entanto, a dose de semente da suspensão de mycobacterium tuberculosis é reduzida em um factor de 10. Que elimina a freqüência de resistência espontânea de certas cepas de mycobacterium tuberculosis a medicamentos como Etambutol, protionamida, capreomicina. Como controle, são utilizados 2 ou 3 tubos com uma dose de semente igual nos tubos de ensaio, sucessivamente diluídos 10 e 100 vezes. O critério de estabilidade é a proporção de crescimento visualmente observado de mycobacterium tuberculosis. Para os medicamentos da 1ª série, o critério de estabilidade é o excesso de crescimento de 1% da população inicial, para os medicamentos da segunda linha - um aumento de 1 ou mais de 10% da inicial, dependendo da concentração crítica escolhida.

Em 1997, um grupo de trabalho da OMS e da União Internacional da Tuberculose sobre a detecção de resistência à drogas antituberculosas fez ajustes nesses critérios, sugerindo que as micobactérias que crescem no meio de ovo denso de Levenshtein-Jensen são estáveis nas seguintes concentrações:

• dihidrostreptomicina - 4 μg / ml;
• isoniazida 0,2 μg / ml:
• rifampicina 40 μg / ml:
• Ethambutol - 2 μg / ml.

Em 2001, foram propostas concentrações críticas para os seguintes medicamentos de segunda linha (para uma proporção crítica de 1%):

• capreomicina - 40 mcg / ml;
• protionamida - 40 mcg / ml;
• kanamicina - 30 μg / ml;
• viomicina - 30 mcg / ml;
• cicloserina 40 μg / ml;
• ácido aminosalicílico - 0,5 μg / ml;
• ofloxacina - 2 μg / ml.

Os resultados de crescimento são avaliados após 4 semanas como preliminares e após 6 semanas de cultivo - como o final.

Para determinar a sensibilidade do medicamento à pirazinamida, que é amplamente utilizada na quimioterapia moderna para tuberculose, a concentração crítica recomendada é de 200 μg / ml. No entanto, até agora não existe um método geralmente aceito para determinar a resistência a esse medicamento em meios nutrientes sólidos, uma vez que sua atividade antibacteriana se manifesta apenas em meio ácido (pH <6), o que é tecnicamente difícil de sustentar. Além disso, muitas culturas clínicas de micobactérias tuberculose crescem relutantemente em ambientes de ovos com um ambiente ácido.

Para avaliar a qualidade dos resultados da determinação da sensibilidade ao fármaco das micobactérias, recomenda-se que cada novo lote do meio Levenstein-Jensen seja monitorado por uma determinação paralela da sensibilidade da linhagem padrão H37Rv do museu. Além disso, existem certos critérios microbiológicos que devem ser mantidos para que as técnicas dêem um resultado bem reproduzível e corretamente interpretado. Estes incluem a viabilidade da cultura de mycobacterium tuberculosis, as regras para a obtenção de suspensão e suspensão homogêneas, as regras para a seleção de culturas de mycobacterium tuberculosis, a representatividade da massa bacteriana selecionada. A confiabilidade da determinação da resistência aos medicamentos diminui com uma liberação bacteriana extremamente escassa.

Recentemente, um método para determinar a sensibilidade ao fármaco usando sistemas automatizados tem sido considerado promissor. O mais perfeito nesta área são desenvolvimentos baseados em VASTES MGIT-960. Neste caso, a sensibilidade à droga da mycobacterium tuberculosis é determinada com base em um método modificado de proporções. No processo de determinação, a taxa de crescimento de mycobacterium tuberculosis em um tubo de controle e em tubos de ensaio com drogas é comparada. Para determinar a sensibilidade à estreptomicina, isoniazida, rifamp-picina e etambutol, são utilizados suplementos de enriquecimento e antibióticos incluídos no kit SIRE. Para determinar a sensibilidade à pirazinamida, use o kit PZA. No decorrer do teste, o inóculo de suspensão de micobactéria de tuberculose é inoculado com tubos de ensaio contendo drogas, bem como tubos de controle com diluição da suspensão 100 vezes para todas as preparações, exceto pirazinamida, onde a diluição da suspensão é 10 vezes. O critério de estabilidade é o indicador de crescimento de micobactérias de 100 GU quando o crescimento é alcançado no tubo de controle 400 GU (ver "Métodos culturais para isolar micobactérias"). A contabilização e interpretação dos resultados são realizadas automaticamente e são definidas pela entrada ou o programa selecionado.

Como concentrações críticas, as concentrações finais são utilizadas em um tubo de ensaio com um meio líquido nutriente. Atualmente, concentrações críticas foram desenvolvidas para drogas de primeira linha e de segunda linha. Deve notar-se que a sensibilidade das micobactérias tuberculose à ciclosserina e ao ácido aminosalicílico é determinada apenas em meio nutritivo do ovo.

Um protocolo detalhado de trabalho sobre o sistema descrito possibilita estudar a susceptibilidade a fármacos tanto em uma cultura isolada (com um meio nutriente denso) quanto usando o crescimento primário da micobactéria em um tubo MGIT. A última opção reduz significativamente o tempo dos estudos culturais, permitindo obter resultados completos sobre a cultura de mycobacterium tuberculosis (incluindo informações sobre a suscetibilidade a fármacos) apenas 3 semanas a partir do momento da coleta, enquanto o método tradicional só pode atingir isso no 3º mês. Com o tempo, os resultados obtidos, quando o paciente está em uma fase intensiva de tratamento, podem compensar o custo relativamente alto da pesquisa.

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Diferenciação de micobactérias

Levando em consideração que os meios nutrientes usados não são estritamente seletivos. A diferenciação subsequente das micobactérias isoladas é reconhecida como obrigatória. A necessidade de diferenciação de micobactérias deve-se a uma série de características de processos patológicos causados por representantes do gênero: o curso e resultado diferentes de tuberculose e micobacteriose, a presença de resistência natural a medicamentos contra a tuberculose.

Reconhece-se que a identificação primária das micobactérias do complexo de M. Tuberculosis a partir de micobactérias não tuberculose é realizada de acordo com as seguintes características: taxa de crescimento em meios nutrientes densos, pigmentação, morfologia das colônias, resistência ao ácido e temperatura otimizada de crescimento.

Infelizmente, não há um único método de laboratório para diferenciar de forma fiável M. Tuberculosis micobactérias complexo de outros bacilos ido-rápida, no entanto, a combinação das características descritas acima, com os resultados a seguir indicados de um número de testes bioquímicos permite a identificação do complexo Mycobacterium tuberculosis com M. Susceptível de 95%.

Para a diferenciação de Mycobacterium complexo M. Tuberculosis (M. Tuberculosis, M. Bovis, M. BovisBCG, M. Africanum, M. Microti, M. Canettii e outros) a partir do micobactérias de crescimento lento utilizados exames bioquímicos básicos nontubercular que detectam a presença dos seguintes sintomas:

• A capacidade de produzir ácido nicotínico (teste de niacina):
• atividade da nitrato redutase;
• catalase termostável;
• Crescimento em meio com salicilato de sódio (1 mg / ml).

Como testes adicionais, também pode ser utilizado o crescimento em meio contendo 500 μg / ml de ácido paranitrobenzóico ou 5% de cloreto de sódio.

Muitos laboratórios bacteriológicos identificam esses microorganismos apenas ao nível do complexo, devido às capacidades limitadas dos laboratórios e às capacidades metodológicas dos especialistas.

Na maioria dos casos, no entanto, na prática, para diferenciar M. Tuberculosis e M. Bovis é suficiente os seguintes testes: niacina, para a presença de nitrato, o registo presença e crescimento pirazinamidazy em meio contendo 2 ug / ml de hidrazida do ácido tiofeno-2-carboxílico. É levado em consideração que as micobactérias do complexo M. Tuberculosis são caracterizadas pelo seguinte conjunto de caracteres:

• crescimento lento (mais de 3 semanas);
• temperatura de crescimento na faixa de 35-37 ^o C;
• ausência de pigmentação (marfim);
• marcou cor ácida-rápida;
• um teste de niacina positivo;
• um teste de nitrato redutase positivo;
• ausência de catalase termostática (68 ^° C).
• A ausência de crescimento em um meio Levenstein-Jensen contendo:
  • 1000 μg / ml de salicilato de sódio,
  • 500 μg / ml de ácido paranitrobenzóico,
  • 5% de cloreto de sódio:
• crescimento na presença de 1-5 ug / ml de ácido tiofeno-2-carboxílico.

A relevância da diferenciação de micobactérias isoladas aumentará acentuadamente com o aumento da freqüência de registro de casos de HIV / AIDS associados a tuberculose ou micobacteriosis. Atualmente, não há certeza absoluta da prontidão dos laboratórios regionais práticos para executar corretamente esse volume de trabalho.

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Diagnóstico imunológico da tuberculose

Há uma série de fenômenos universais, drogas e exames imunológicos que originalmente foram encontrados precisamente com tuberculose ou no modelo da resposta imune a micobactérias. Estes incluem BCG e tuberculina, um fenômeno como o GZT cutâneo (testes de tuberculina - reações de Pirke e Mantoux), uma reação à injeção subcutânea de tuberculina em um animal sensibilizado (fenômeno de Koch). Um dos primeiros anticorpos em doenças infecciosas também foi detectado na tuberculose. É claro que, quanto mais profunda a compreensão dos mecanismos de imunidade antituberculosa e seu controle genético, maior poderá ser o uso de métodos imunológicos e drogas que afetam a imunidade para resolver os problemas práticos da fisiologia.

O problema prático mais importante e difícil atualmente é considerado a detecção de tuberculose no processo de triagem em massa da população. No entanto, apesar dos numerosos relatórios de "êxitos" (em material limitado), não existe um método imunológico adequado (reprodutível em "nenhum braço") e a droga.

Os métodos imunológicos, em particular estudos serológicos (determinação de antígenos, anticorpos) e testes provocadores de tuberculina são muito amplamente utilizados na prática clínica.

Em primeiro lugar, entre os estudos imunológicos utilizados no diagnóstico diferencial, existem métodos sorológicos - a determinação de antígenos e anticorpos em diferentes ambientes do corpo.

A especificidade dos anticorpos contra micobactérias tuberculose depende dos antígenos utilizados no imunoensaio. Uma quantidade significativa de antígenos é proposta, a primeira delas é a PPD da tuberculina:

• PAP e outras preparações complexas a partir do líquido de cultura;
• desintegração ultra-sônica;
• Extracto de Triton e outras preparações complexas de paredes celulares;
• 5-antígeno (Daniel);
• 60-antígeno (Coccito);
• lipoarabinomanano;
• factor de cordão (trehalose-6,6-di-mycollate);
• fenol e outros glicolípidos;
• lipopolisacarídeos;
• antigénio de ligação à fibronectina;
• proteínas (mais frequentemente recombinantes); 81,65,38,34,30,19,18,16,15,12 CDA, etc.

Como resultado de muitos anos de pesquisa por cientistas russos e estrangeiros, foram revelados os principais padrões de formação de anticorpos e a eficácia do diagnóstico serológico de tuberculose: quanto mais complexo o antígeno, maior a sensibilidade e menor especificidade dos testes. A especificidade varia de país para país, dependendo da infecção da população com M. Tuberculosis e micobactérias não tuberculose, da vacinação com BCG, etc. Em crianças, o valor informativo do serodiagnóstico é menor do que em adultos. Na tuberculose primária (mais frequentemente crianças), a definição de IgM é mais informativa. Com IgG secundária. Em pacientes infectados pelo HIV, o valor informativo do serodiagnóstico na determinação de anticorpos é reduzido. A eficácia da determinação de anticorpos depende de vários "momentos clínicos": a atividade do processo (presença ou ausência de "secreção" de micobactérias, presença de cáries de degradação, grau de infiltração), prevalência do processo, duração do curso.

A sensibilidade do método do imunoensaio enzimático (ELISA) é de cerca de 70%. A eficácia insuficiente do estudo deve-se à sua baixa especificidade. Anteriormente, foi considerada a possibilidade de usar rastreamento sorológico em grupos de alto risco, em particular entre pessoas com alterações pós-tuberculose nos pulmões.

Para aumentar a especificidade do ELISA, procura por antígenos mais específicos, incluindo aqueles obtidos pela engenharia genética: ESAT-6, etc. (veja acima). O uso de antígenos estritamente específicos (38 kDa, ESAT) aumenta a especificidade. Mas reduz significativamente a sensibilidade da análise. Junto com ELISA (sistemas experimentais de ensaios laboratoriais, p. Ex. Kit ELISA Pathozyme), foram também propostos kits imunocromatográficos com filtração lateral (Mycodot), bem como outros testes similares (teste de membrana pontilhada) com avaliação visual do resultado do estudo. Durante estes testes, a análise é realizada por 10 a 30 minutos; eles não requerem equipamentos especiais, eles exigem uma avaliação visual dos resultados, que está ligada a uma certa subjetividade. Esses métodos têm aproximadamente as mesmas características de sensibilidade e especificidade (70% e 90-93%, respectivamente) como o ELISA tradicional.

O uso de métodos de análise imune tem um valor definido como adicional, levado em consideração no complexo dos métodos utilizados, no diagnóstico diferencial da tuberculose, especialmente no diagnóstico de suas formas extrapulmonares. O método ELISA mais eficaz é o diagnóstico de meningite tuberculosa no estudo do líquido cefalorraquidiano. Nesse caso, a sensibilidade da análise é de 80-85%, e a especificidade é 97-98%. Existem dados sobre a efetividade da detecção de anticorpos contra micobacterias tuberculose no fluido lacrimal no diagnóstico de uveíte tuberculosa.

Indução de síntese de interferão gama in vitro

O interferão gama (IFN-γ) é um fator de defesa imune específico realizado pela ativação de sistemas de enzimas com macrófagos. A indução da síntese de IFN-γ por linfócitos T sensibilizados causa sua interação com antígenos de micobactérias.

Como antígenos utilizados como PPD de tuberculina. E antigénios específicos obtidos geneticamente manipulados, em particular os antígenos ESAT-6 (antígeno secreto precoce com um peso molecular de 6 kDa) e CFP-10 (um filtrado de proteína de cultura, 10 kDa). A engenharia genética ou antígenos recombinantes estão ausentes nas células da vacina BCG e outras micobactérias. Ao utilizar a tuberculina, os resultados do teste de indução IFN-γ são comparáveis aos resultados do teste cutâneo da tuberculina (correlação direta). Ao usar antígenos geneticamente modificados, os resultados do teste são mais específicos e não dependem da vacinação prévia do BCG. Ao testar pessoas vacinadas que não tiveram contato com a infecção por tuberculose, a especificidade do teste é de 99%. A sensibilidade do teste entre pacientes com tuberculose varia de 81 a 89%.

Testes e ferramentas de diagnóstico têm sido desenvolvidos com base na cultura de curto prazo das células ou células mononucleares de sangue total isolado a partir do sangue com antigénios de Mycobacterium tuberculosis in vitro com subsequente determinação da concentração de IFN-γ ou pela contagem do número de linfócitos T que sintetizam IFN-γ. A concentração de interferão sintetizada num tubo de ensaio é determinada por ELISA utilizando anticorpos monoclonais que se ligam IFN-γ. Então, ao calibrar o IFN-γ padrão, a sua concentração é determinada no tubo de ensaio ou nos poços da placa.

Ao realizar o teste Elispot, o número de linfócitos T que sintetizam IFN-γ. São contados na superfície de uma placa revestida com anticorpos contra IFN-γ.

Os desenvolvedores de diagnósticos com base na indução de IFN-γ in vitro, aprovado pela Agência dos EUA para Medicamentos e Produtos, argumentam que é impossível diferenciar a infecção por tuberculose latente da tuberculose ativa com a ajuda do teste. Portanto, em regiões com alto nível de infecção, o teste não é diretamente diagnóstico. No entanto, em nosso país, pode ser usado para diferenciar a infecção por tuberculose em crianças de alergia pós-vacinação e para avaliar o nível de imunidade específica no processo de tratamento.

Atualmente, está sendo estudado o sistema de teste doméstico para determinar a indução de síntese de IFN-γ por antígenos específicos de tuberculose in vitro.

Situação imune e curso de tuberculose, imunocorreção

No processo de tratamento da tuberculose em seres humanos, há alterações na antigeneemia e no estado do sistema imunológico.

Os dados sobre mudanças nos exsudatos e tecidos são em grande parte contraditórios. O único que pode ser notado com razão é que, em granulomas tuberculosos, em geral, um número significativo de linfócitos T ativados são detectados.

Faz sentido ocupar-se de mais duas disposições que são necessárias para entender o papel dos mecanismos imunológicos no tratamento da tuberculose em seres humanos:

• Os doentes com SIDA têm uma incidência particularmente elevada de resistência a múltiplos fármacos;
• com resistência a múltiplos fármacos (e na ausência de infecção por HIV), os distúrbios de imunidade (especialmente a ligação de células T) são particularmente significativos.

Com a tuberculose, vários métodos de imunocorreção são amplamente utilizados: estes são principalmente medicamentos que atuam principalmente na imunidade das células T e um sistema de fagócitos mononucleares (hormônios tímicos, isofono, licopeto, poloxidônio, etc.). Bem como micobactérias inteiras (atenuadas) e seus componentes.

Diagnóstico molecular-biológico da tuberculose

Para métodos de biologia moleculares para o diagnóstico de doenças infecciosas incluem, principalmente, métodos com base em manipular com o material genómico de agentes patogénicos bacterianos e virais para identificar o material genético específico - segmentos de ADN que possuem uma sequência de nucleótidos específica para um tipo ou patógeno em particular estirpes para analisar específico Seqüências de DNA em genes que determinam a sensibilidade do patógeno a certas substâncias medicinais e também para análise funcional atividade de certos genes do patógeno. Os métodos biológicos moleculares ganharam ampla aceitação na pesquisa científica e na aplicação prática no diagnóstico e controle de várias infecções bacterianas e virais após a descoberta em 1985 por Carrie Mullis (Prêmio Nobel, 1989) de uma reação em cadeia da polimerase.

Princípios e possibilidades do método de reação em cadeia da polimerase

O PCR permite amplificar (multiplicar) in vitro uma sequência de nucleotídeos (fragmento de DNA do patógeno) durante várias horas em milhões de vezes. A reação na presença de cadeias de ADN simples determina a sensibilidade extremamente alta do ensaio.

A sequência de nucleotídeos de certas regiões na cadeia de DNA determina a identidade genética do microorganismo, o que explica a alta especificidade da PCR.

A importância deste método para a detecção e investigação das características da micobactéria tuberculosa deve-se às características biológicas do microorganismo, que tem um crescimento muito lento: o tempo de dobrar o DNA do Mycobacterium tuberculosis durante o cultivo é de 12 a 24 horas.

O princípio do método de PCR consiste na amplificação - múltiplo, milhões de vezes. Multiplicando as seções de uma sequência de DNA específica em um microvolume de tubo durante uma recorrência cíclica dos seguintes três estágios de reação, cada um dos quais passa em um regime de temperatura diferente:

• Fase I - desnaturação do DNA de cadeia dupla após o aquecimento com uma divergência das suas correntes;
• Estágio II - ligação complementar (hibridação) de iniciadores (oligonucleótidos de iniciação) com seções terminais de cadeias estritamente específicas, escolhidas para a multiplicação do fragmento de DNA;
• Fase III - conclusão da cadeia do fragmento de DNA com a ajuda de uma polimerase de ADN termoestável.

Para amplificação in vitro, deve haver moléculas de DNA da matriz. Quatro tipos de desoxinucleósidos trifosfatos (nucleotídeos) contendo as bases nitrogenadas correspondentes: adenina (A), timina (T), guanina (D), citosina (C); oligonucleótidos de iniciação artificialmente sintetizados (primers) consistindo de 18-20 pares de bases; enzima ADN polimerase termoestável tendo uma temperatura óptima de 68-72 ^no C, e os iões de magnésio.

A especificidade da PCR depende da escolha do fragmento de DNA. De acordo com isso, os oligonucleótidos de semente de flanco são sintetizados. A especificidade da hibridação e a conclusão da cadeia de DNA deve-se ao princípio da complementaridade dos seguintes pares de bases nitrogenadas: adenina-timina, guanina-citosina.

Para determinar o genómico complexo tuberculosas amplificação alvo mais eficaz na maioria dos sistemas de ensaio escolhidas fragmento de ADN de IS6110, o que na maioria dos estirpes de genoma de Mycobacterium tuberculosis tem um número significativo (10-20) de repetições, o que proporciona, juntamente com a especificidade, alta sensibilidade do ensaio. Ao mesmo tempo, são descritas as estirpes de Mycobacterium tuberculosis com um pequeno número de repetições ou a ausência do fragmento IS6110.

Isolamento de moléculas de DNA de uma amostra biológica

Para a realização de PCR, as moléculas de DNA do patógeno devem ser isoladas do material biológico em um volume mínimo, com uma quantidade mínima de DNA não específico e vários inibidores da enzima-DNA polimerase.

A preparação das amostras deve ser realizada em condições que impeçam a contaminação cruzada das amostras pelas moléculas de DNA isoladas. Para fazer isso, o pré-tratamento da sala com ultravioleta, pisos e superfícies de trabalho de mesas e aparelhos é necessário com soluções contendo cloro. Também é obrigatório o uso de luvas limpas, tubos de ensaio descartáveis e pontas para pipetas automáticas.

Para isolar o ADN de Mycobacterium tuberculosis a partir de espécimes clínicos (fluido cefalorraquidiano, lavagem brônquica) não contendo um grande número de células, resíduos celulares, ou sais destes, suficiente para centrifugar a amostra a 3-4000. Rpm, adicionar à solução de lama 20-30 ul de 2% de triton X-100 e aqueceu-se a 90 ^sobre C durante 30 min.

Para a preparação de amostras de escarro, é necessária uma diluição eficaz, para a qual uma solução de hidróxido de sódio a 4% e N-acetil-L-cisteína (NALC) são usualmente utilizadas em uma quantidade de 50-80 mg por amostra, dependendo da viscosidade da amostra. A solução NALC deve ser preparada ex tempore ou o pó de NALC pode ser adicionado seco à amostra diretamente. Após a liquefação, as amostras devem ser centrifugadas durante 15 minutos a 3.5-4.000 rpm (3000 g) em frascos de 50 ml com tampas de rosca, i. E. Nas mesmas condições que são recomendadas para a preparação prévia de fleuma.

Para extrair o DNA do precipitado, um método baseado no uso de uma solução de 5-6 molar de isotiocianato de guanidina como reagente de lise e partículas de sílica microporosa ("terra de diatomáceas"), que absorve moléculas de DNA, é freqüentemente usado. Substâncias inespecíficas, incluindo possíveis inibidores, são então lavadas numa solução 2,5 molar de isotiocianato de guanidina e uma solução de etanol, após o que as moléculas de DNA são desossadas em água, e essas amostras são usadas para PCR. Para simplificar a tecnologia de extração de DNA, a "terra de diatomácea" é frequentemente substituída por micropartículas magnéticas revestidas com óxido de silício. Neste caso, é utilizado um suporte magnético especial para microtubos em vez de centrifugação para precipitar as partículas.

Na Rússia, foi desenvolvido um método original para a separação imunomagnética das micobactérias, seguido da extração do DNA do patógeno. Para a separação imunomagnética de mycobacterium tuberculosis, utilizam-se caminhos de ferro de 3-5 microns revestidos com óxido de silício, aos quais são anexados anticorpos policlonais (coelhos) quimicamente ligados a micobactérias de tuberculose. As amostras de escarro após a lise alcalina são neutralizadas com uma solução ácida de tris-HCl e incubadas com um sorvente imunomagnético. Em seguida, as imunoferropartículas são coletadas com uma haste magnética com uma ponta substituível, transferida para um microtube e precipitada. Adicionar 20-30 μl de uma solução de Triton X-100 a 2% e aquecer durante 30 minutos a 90 ^ºC. O sobrenadante é usado como um modelo de DNA para análise de PCR.

Um problema difícil é o isolamento do DNA de Mycobacterium tuberculosis a partir de espécimes de biópsia. Para a biópsia enzimática, a enzima proteinase K é utilizada numa concentração final de 200-500 mg / l a uma temperatura de 56 ^° C durante a noite. Além disso, um dos métodos conhecidos é usado. O excesso de DNA não específico na análise por PCR das biópsias causa frequentemente a inibição da reação, o que requer a extração repetida de DNA.

Métodos para detectar resultados

Após a conclusão da reação, os fragmentos de DNA amplificados do patógeno são identificados por vários métodos.

O método de eletroforese em gel é bem conhecido. O fragmento de ADN resultante é identificado por um controlo positivo contendo o fragmento de ADN específico desejado, ou de acordo com um tamanho conhecido (o número de pares de nucleótidos) do fragmento, que é determinado utilizando um marcador molecular padrão.

Na presença de um corante específico, o brometo de etidio está incluído no DNA de cadeia dupla. O fragmento de DNA sintetizado é detectado como uma banda luminosa sob a ação do ultravioleta.

O tamanho do fragmento de DNA, determinado por eletroforese a partir da distância desde o início, deve corresponder a um marcador conhecido de peso molecular ou controle positivo.

Outros métodos para determinar os resultados da PCR baseiam-se na hibridação de produtos de PCR de cadeia simples com uma sonda de oligonucleótido-ADN complementar marcada com biotina, seguida por detecção por uma reacção enzimática, por exemplo, por ligação à biotina do conjugado de estreptavidina-fosfatase alcalina.

Com base neste tipo de detecção, foram criados analisadores de PCR em que a detecção de resultados de PCR é realizada automaticamente como resultado da leitura da densidade óptica nas amostras após a manifestação da reação enzimática.

As desvantagens desses métodos são as possibilidades de contaminação intralaboratória por fragmentos bastante pequenos de moléculas de DNA. Quando as moléculas entram em novas amostras, elas se tornam uma matriz para PCR e conduzem a resultados falsos positivos.

A este respeito, para evitar resultados falso-positivos, são introduzidas regras rigorosas para a separação e isolamento de instalações: extrair DNA de amostras biológicas; instalações para a detecção de resultados (eletroforese) da zona limpa. Estas instalações são uma zona de provável contaminação. Outra área isolada é uma sala limpa para a introdução das amostras de DNA a serem testadas em tubos com uma mistura de reação para PCR. Finalmente, presume-se que o dispositivo principal - o amplificador de DNA - deve ser colocado em uma sala separada, possivelmente de escritório.

Para evitar a contaminação pelos produtos das reações anteriores - amp-lycones, alguns sistemas de teste de PCR em vez de desoxinucleósido-timidina contêm desoxinucleosiduridina, que, quando sintetizada in vitro, é inserida em seu lugar na posição correspondente, isto é, A base nitrogenada da timina presente no ADN nativo é substituída por uracilo. A glicosilase de Uracil-DNA, adicionada à mistura reaccional ao material em análise, destrói apenas os fragmentos de contaminantes com desoxiuridina, mas não o ADN nativo a ser analisado. Lt; / RTI & gt; O aquecimento subsequente a 94 ^° C inativa esta enzima e não interfere com a amplificação na PCR.

Existe um sistema de teste baseado na amplificação isotérmica de ARNr, para o qual a transcrição reversa e síntese de moléculas de DNA são realizadas primeiro. Que, por sua vez, é uma matriz para a subsequente síntese de moléculas de ARN. Os amplicões de ARN são detectados usando uma sonda de DNA manchada com acridina quando hibridizados em uma solução de tubo de reação. Este método, além de alta sensibilidade, tem a vantagem de analisar em um tubo, o que evita a contaminação. De acordo com os autores, a sensibilidade deste método em amostras respiratórias atinge 90% com uma especificidade de 99-100%.

Novos métodos de detecção são implementados em PCR em tempo real. Estes métodos diferem principalmente em que a PCR e a detecção de seus resultados são realizadas simultaneamente em um tubo fechado. Isso não só simplifica tecnicamente a técnica de análise, mas também evita a contaminação de salas de laboratório e amostras de teste com produtos de PCR anteriores.

Com PCR em tempo real, a detecção dos resultados é devida a fluorescência resultante da hibridação de uma sonda de DNA fluorogênico com um fragmento de DNA específico amplificado durante a PCR. A estrutura das sondas de ADN fluorogénico é construída de tal forma que o marcador fluorescente é liberado como resultado da reação enzimática ou distanciar-se da molécula do agente de extinção de fluorescência apenas em uma hibridação específica com a molécula de DNA desejada amplificada durante a PCR. Com o aumento do número de moléculas hibridizadas com a sonda, o aumento da fluorescência para o nível detectável é proporcional ao número de moléculas do produto amplificado. Uma vez que o número de moléculas do fragmento de DNA é duplicado durante cada ciclo de PCR, o número do ciclo do qual a fluorescência é determinada e aumenta é inversamente proporcional ao número de moléculas de DNA na amostra original. Se várias concentrações moleculares conhecidas do fragmento de DNA correspondente de mycobacterium tuberculosis forem introduzidas na reação como um calibrador, então, pelo programa de computador, o número de genomas de DNA no material de teste pode ser calculado.

Cada amostra padrão é duplicada. O critério quantitativo é o número mínimo de ciclos de PCR necessários para o início e crescimento da fluorescência determinada. Na abcissa - o número de ciclos; a ordenada é o valor de fluorescência. As concentrações de DNA são inversamente proporcionais ao número de ciclos necessários para o aparecimento da fluorescência. Na coluna da direita (21-32), os números do ciclo para as concentrações correspondentes são marcados. Diferenças entre 10 vezes as concentrações de fragmentos de DNA 10 ² -10 ⁶ ml - 3,2-3,4 ciclos. Para dois pacientes, as concentrações de fragmentos de IS6110 foram de cerca de 10 ³ / ml e 10 ⁴ / ml. Tendo em conta o número de repetições (6-20) dos fragmentos analisados no genoma de Mycobacterium tuberculosis, o número de micobacterias em amostras clínicas é de cerca de 100 e 1000 células, respectivamente.

O uso de PCR no diagnóstico de tuberculose

O método de PCR é mais utilizado para o diagnóstico acelerado de tuberculose - detecção de micobacterium tuberculosis em espécimes clínicos: escarro. Rubor brônquico, exsudato pleural, urina, líquido cefalorraquidiano, punção de osteólise, aspirados do tracto genital feminino e vários espécimes de biópsia. Ao estudar cerca de 500 amostras de escarro e escoamentos brônquicos de 340 pacientes com diagnóstico confirmado de tuberculose pulmonar na Holanda, estudou-se a sensibilidade comparativa de PCR, cultura e microscopia de esfregaço. A sensibilidade da análise foi de 92,6,88,9 e 52,4%, respectivamente. A especificidade de todos os métodos foi de cerca de 99%.

A eficácia da detecção de mycobacterium tuberculosis por microscopia de esfregaço, semeadura no meio de Levenstein-Jensen, sistema de teste VASTES e análise de PCR foi comparada. O PCR mostrou uma sensibilidade de 74,4%, microscopia - 33,8%, semeando em um meio denso - 48,9% e VASTES - 55,8%. O tempo médio de detecção para semeadura em meio Levenstein-Jensen é de 24 dias. VASES - 13 dias, PCR - 1 dia.

As possibilidades de utilizar a PCR como um método sensível e rápido para monitorar a eficácia do tratamento da tuberculose também são discutidas.

A detecção do DNA da micobactéria de tuberculose por PCR com quimioterapia eficaz é determinada por um período mais longo - uma média de 1,7 meses em comparação com a liberação bacteriana, determinada por microscopia de luminescência e 2,5 meses em comparação com o estudo bacteriológico.

Diagnóstico de formas extrapulmonares de tuberculose

O significado da PCR como método sensível é especialmente ótimo para formas extrapulmonares, pois é com essas formas que métodos clinico-radiológicos e métodos bacteriológicos tradicionais para determinar micobactérias da tuberculose em materiais de diagnóstico são ineficazes.

No estudo de amostras de urina, os resultados da análise de PCR foram positivos em 16 dos 17 pacientes com tuberculose ativa do sistema urinário e negativos em 4 pacientes com tuberculose renal inativa e 39 pacientes com doenças não tuberculosas do sistema urinário.

A eficácia da análise de PCR no estudo de aspirados de medula óssea em pacientes com febre de origem desconhecida foi demonstrada em casos de tuberculose suspeita. Para diagnosticar a linfadenite tuberculosa, foram estudadas 102 crianças com suspeita de linfadenitis tuberculosa em 102 pacientes com aspiração de punção e uma amostra de biópsia de 67 crianças. Foram obtidos resultados positivos: 71,6% de PCR em tempo real. Microscopia de fluorescência - 46,3%. Pesquisa em cultura - 41,8%. No estudo de 50 biópsias de linfonodos em pacientes com doença de "arranjo de gato", todos os resultados foram negativos. Assim, demonstrou-se 100% de especificidade da análise de PCR. No mesmo trabalho, com biópsia de punção dos gânglios linfáticos, demonstrou-se a possibilidade de detecção de M. Avium.

Diagnóstico de tuberculose na área genital feminina A infertilidade, como é sabido, é um dos problemas mais difíceis de diagnóstico. Em um estudo de PCR de biópsias endometriais, aspirados endometriais e amostras de fluidos do espaço Douglas, 14 (56%) de 25 pacientes examinados laparoscopicamente com suspeita de tuberculose receberam resultados positivos. Utilizando microscopia e cultura de esfregaço, obtiveram-se 1 e 2 resultados, respectivamente. Estes casos também foram positivos para PCR. A maioria dos resultados PCR positivos foram relacionados a casos com sinais característicos de tuberculose de acordo com o estudo histológico; um número menor - com suspeita de tuberculose de acordo com dados de laparoscopia. Apenas um resultado positivo da análise por PCR foi obtido na ausência de dados laparoscópicos para a tuberculose.

Ao diagnosticar formas extrapulmonares de tuberculose, os clínicos muitas vezes têm uma questão sobre a possibilidade de detectar um patógeno ao testar amostras de sangue com o método de PCR. Os dados literários indicam que a detecção de DNA da micobacterium tuberculosis a partir de amostras de sangue é possível com formas de longo alcance de infecção pelo HIV. O DNA de Mycobacterium tuberculosis foi detectado apenas com tuberculose generalizada de vários órgãos em pacientes com transplante de rim e imunossupressão.

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Identificação de espécies de micobactérias

O método de PCR pode ser bastante eficaz para a identificação rápida de micobactérias do complexo de tuberculose e certos tipos de micobactérias não tuberculosas após a obtenção de seu crescimento primário. Neste caso, o uso de PCR pode economizar 7 a 10 dias, necessário para a posterior identificação cultural de um resultado positivo. O teste de PCR é tecnicamente muito simples, uma vez que não requer preparação de amostras complicadas do material clínico para alcançar alta sensibilidade. No estudo de 80 culturas positivas neste sistema de teste (MB VaT de Organon) culturas, todos os resultados positivos da análise de PCR foram estritamente específicos e foram realizados por 1 dia. Para identificar outras espécies de micobactérias na preparação de DNA do patógeno cultura hibridados com sondas específicas de ADN marcadas com acridina e estirpes detectadas pelo aparecimento de quimioluminesccia via Chemiluminometer ou nitrocelulose tiras com uma avaliação visual, após a hibridação. Com a ajuda de tal conjunto, identifica-se um número limitado de espécies: o complexo mycobacterium tuberculosis. M. Avium, complexo M. Avium, M. Kansasii e M. Gordonae.

A.Telenti et al. Também desenvolveram um método relativamente simples e barato para a identificação de espécies de tipos de micobactérias clinicamente importantes com base em PCR e posterior tratamento com duas enzimas de restrição (enzimas com propriedades de dissecação da molécula de DNA em pontos específicos). O fragmento de DNA é amplificado. Que codifica uma proteína de choque térmico (65 kDa) e, em seguida, o fragmento de PCR de 439 pares de nucleótidos produzidos por PCR é tratado separadamente com duas enzimas, Bste II e Nae III. Em seguida, usando a eletroforese em gel de agarose, os dois produtos obtidos são analisados determinando seu tamanho (número de pares de nucleótidos) usando um conjunto de fragmentos de DNA padrão (marcadores de DNA molecular) com um comprimento de 100 a 1000 pares de nucleótidos. Em cada uma das espécies específicas (M. Tuberculosis, M. Avium, M. Intracellulare, M. Kansasii, M.fortuitum), são detectados 2 ou 3 fragmentos de DNA de tamanho diferente para cada enzima de restrição. A combinação de diferentes tamanhos de DNA obtidos permite diferenciar essas espécies entre elas.

A tecnologia de microarrays de DNA biológico está sendo desenvolvida. O que ajudará a identificar mais de 100 espécies de micobactérias em um estudo.

A identificação da espécie também pode ser realizada por amplificação por PCR da região variável do rRNA 16S seguida de sequenciação de amplicões quando comparada com a estrutura primária correspondente, o que permite identificar mais de 40 espécies de micobactérias.

Com a ajuda da PCR, também pode ser realizada uma identificação de espécies dentro do complexo mycobacterium tuberculosis, incluindo diferenciação de M. Bovis e M. Bovis BCG. Para isso, é analisada a presença ou ausência de alguns genes nas regiões genômicas de RD1. RD9 e RD10. RD1 está ausente em M. Bovis BCG, mas está presente em espécies virulentas, incluindo M. Bovis.

Determinação da sensibilidade ao fármaco de Mycobacterium tuberculosis por PCR

As tarefas de métodos genéticos moleculares para determinar a suscetibilidade ou resistência ao fármaco de Mycobacterium tuberculosis são reduzidas à detecção de mutações em certas sequências de nucleotídeos de genes conhecidos. Os principais métodos baseiam-se quer na leitura direta (sequenciação) dessas sequências após amplificação, quer na hibridação de fragmentos de DNA marcados com biotina amplificados durante a PCR com sondas de DNA. Ambas as alternativas envolvem a identificação das substituições nucleotídicas nas sequências de ADN que utilizam sondas levam à ausência ou hibridização incompleta para uma membrana de nitrocelulose usando o conjugado de enzima (estreptavidina-fosfatase alcalina) - Método LIPA-Rif-TB.

Método para medir a fluorescência num fixa localmente no microsections ADN sondas complementares para mutações conhecidas nas regiões dos genes amplificados por PCR responsáveis pela resistência ou sensibilidade ao fármaco, chamados mikrobiochipov método. O algoritmo principal para a realização desta pesquisa é o seguinte. Após o isolamento de DNA a partir de uma amostra clínica ou cultura de micobactérias é necessário para realizar a amplificação por PCR de fragmentos relevantes do gene rpoB responsáveis pela sensibilidade ao fármaco à rifampicina ou genes katG e inhA que codificam proteínas de Mycobacterium são responsáveis para a sensibilidade à isoniazida. Os resultados de PCR são avaliados por eletroforese em gel de agarose, em que os fragmentos de DNA correspondentes do comprimento desejado são confirmados. Então, uma segunda rodada de PCR é realizada para introduzir um marcador fluorescente no DNA. Os resultados da PCR são novamente confirmados por eletroforese em gel. Em seguida, a hibridação foi realizada (incubação durante a noite), seguido por lavagem do material resultante no biochip, que é um grande número de fixo em uma pequena placa de vidro cadeias de ADN curtas (sondas) que são complementares a sequências de nucleótidos do tipo de Mycobacterium tuberculosis sensível ao fármaco nos pontos de possíveis mutações. Bem como às sequências mutantes responsáveis pela resistência aos medicamentos. A localização das sondas de DNA na placa é estritamente definida e o nível da fluorescência observada durante a hibridação é determinado para determinar o resultado por meio de um leitor especial. A este respeito, os resultados da análise são determinados por meio de um programa de computador especial.

Nos últimos anos, foram desenvolvidos métodos alternativos para determinar a sensibilidade ao fármaco da micobacteria tuberculose com base em tecnologia de PCR em tempo real, o que possibilita a realização desses estudos em um teste de tubo fechado.

Na Fig. 13-13 apresenta o resultado da análise de culturas clínicas de Mycobacterium tuberculosis na determinação da resistência à rifampicina por PCR em tempo real: 218 - uma amostra de controle (sensível à rifampicina); 93 - controle positivo para a mutação de Ser-Trp TCG-TGG; 4482 - controle positivo para mutação de TC-TTG Ser-Leu; 162-322 - amostras experimentais. Resultado do cálculo das curvas cinéticas de amplificação em 4 canais: canal 1: 393 - controle positivo para mutação de Ser-Trp TCG-TGG; canal 2: 4482 - controle positivo para mutação de TC-TTG Ser-Leu; 162, 163, 172, 295 - amostras experimentais; canal 4: curvas cinéticas de amplificação de todas as amostras que participam no experimento. Controle positivo da reação de amplificação. Conclusões: Com base nos resultados da análise, foram identificadas as seguintes mutações que determinam a resistência à rifampicina: nas amostras 162,163,172,295-Ser-Leu TCG-TTG. O mesmo princípio foi utilizado para determinar a resistência dos medicamentos à isoniazida para os genes katG e inhA, que determina as mutações mais frequentes.

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Identificação da tensão de Mycobacterium tuberculosis

O método mais bem estudado de identificação de estirpes de Mycobacterium tuberculosis é uma técnica chamada de restrição polimorfismo do comprimento do fragmento (RFLP RFLP,. Ou na versão Inglês) e que se baseia na fragmentirovanin (limitação) da enzima de ADN de Mycobacterium tuberculosis PvuII e os fragmentos obtidos a hibridização subsequente com certas sequências específicas no ADN é o elemento repetido IS6110. A variabilidade intraespecífica é realizada devido ao número diferente de repetições do IS6110 e sua localização no DNA. Bem como a variedade de distâncias entre certos pontos de ataque da enzima de restrição enzimática (sites de restrição) e o elemento IS6110. Essa tecnologia é muito complicada e demorada. Depois de tratamento com ADN extraído a partir de uma cultura de Mycobacterium tuberculosis, electroforese em gel é realizada com uma enzima de restrição, e, em seguida, transferido fragmentos de ADN de diferentes comprimentos sobre uma membrana de nitrocelulose, a hibridação foi realizada com fragmentos de IS6110-elemento e detectado por meio de reacções enzimáticas. O padrão específico resultante de bandas caracteriza o DNA de uma estirpe específica de Mycobacterium tuberculosis. Com a ajuda da análise informática, a identidade ou a relação das cepas é revelada. Apesar do fato de que o método RFLP é o mais discriminatório, isto é, revela o maior número de diferenças nas cepas analisadas, é ineficaz com um pequeno número (menos de 5) IS6110-repetições observadas em algumas cepas. Na Fig. 13-14 mostra os resultados da tipagem RFLP de estirpes.

Uma alternativa pode ser o método de spoligotyping - análise do polimorfismo de sequências de DNA espaçador - intermediário entre repetições diretas da região DR. Ao realizar a spoligotyping das cepas, a PCR é realizada com primers que delimitam a região DR, após o que são formados fragmentos de diferentes tamanhos que se hibridam com as regiões intermediárias variáveis do DNA. A análise das sequências espaçadoras da região DR é apresentada. Segundo os pesquisadores, mais simples, produtivo e adequado para triagem primária de estirpes e análises epidemiológicas preliminares, bem como pesquisa direta de material clínico.

Obviamente, um método mais eficaz e tecnologicamente acessível é VNTR (abreviatura de palavras em inglês), ou um método para determinar o número variável de repetições tandem exatas no DNA de mycobacterium tuberculosis. Este método baseia-se apenas no uso de PCR e não requer manipulação adicional. Uma vez que o número de repetições em tandem em diferentes cepas e em loci diferentes é diferente, os fragmentos de diferentes tamanhos são determinados e analisados no eletroforese resultante de produtos de PCR. De acordo com os pesquisadores, o uso de VNTR atinge um maior grau de discriminação de cepas do que com o método RFLP.

Nos últimos anos, foi dada muita atenção à disseminação de cepas de Mycobacterium tuberculosis da família W-Pequim (algumas vezes chamadas de cepa de Pequim), que são principalmente resistentes a drogas.

Requisitos básicos para a qualidade da pesquisa biológica molecular

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Documentos regulatórios básicos para PCR

Ordens do Ministério da Saúde da Federação Russa: N ° 45 de 7.02.2000. N ° 109 de 21.03.2003. N ° 64 de 21.02.2000. Instruções metódicas: 1.3.1888-04 "Organização de trabalhos em estudos utilizando o método de PCR de material infectado com patogenicidade biológica agentes dos grupos III-IV de patogenicidade "; 1.3.1794-03 "Organização de trabalhos no estudo de material de PCR, infectados com microorganismos dos grupos de patogenicidade I-II". 2003; 3.5.5.1034-01 "Descontaminação do material de estudo infectado com bactérias dos grupos de patogenicidade I-IV por PCR", 2001. Apêndice 11 à Instrução sobre Métodos Unificados de Pesquisa Microbiológica para Detecção, Diagnóstico e Tratamento da Tuberculose.

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A equipe

Os diagnósticos laboratoriais clínicos, os médicos bacteriológicos, os virologistas, os biólogos do laboratório de diagnóstico clínico, bem como especialistas em educação médica secundária, que passaram por especialização e treinamento avançado na ordem estabelecida, podem realizar estudos de biologia molecular.

Arranjo de instalações laboratoriais

São necessárias as seguintes salas de laboratório:

• A área de manuseio de amostra é um laboratório adaptado para trabalhar com agentes infecciosos dos grupos de patogenicidade III-IV, de acordo com as Instruções Metálicas 13.1888-04.
• Zona para a preparação de misturas de reação PCR - sala de laboratório, que fornece proteção contra contaminação laboratorial interna - zona "limpa".
• • Se a eletroforese ou hibridação é utilizada para analisar produtos de PCR. Uma sala de laboratório em que os fragmentos de DNA multiplicados são extraídos do tubo de amplificação e, consequentemente, podem entrar no ambiente, de acordo com os requisitos para laboratórios de PCR (Diretrizes 1.3.1794-03, Diretrizes 1.3.1888-04) deve ser totalmente está isolado das instalações indicadas nos parágrafos anteriores. O movimento da área de eletroforese para a área de manuseio da amostra e a zona "limpa" de qualquer pessoal, equipamento, materiais e objetos, bem como transporte aéreo através do sistema de ventilação ou como resultado de rascunhos devem ser evitados. Esta zona não é necessária para a detecção fluorimétrica de produtos de PCR.
• O espaço para documentação e processamento de resultados está equipado com computadores e equipamento de escritório necessário. Esta sala pode conter equipamentos que fornecem detecção de produtos de PCR sem abrir o tubo. - Detectores de PCR fluorescentes e termocicladores para PCR em tempo real.

Os requisitos sanitários e epidemiológicos para o tratamento primário do escarro são semelhantes aos requisitos microbiológicos padrão para trabalhar com micobactérias tuberculose.

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Conclusão de equipamentos de laboratório para diagnóstico por PCR

O laboratório inclui equipamento para os seguintes quartos.

• espaço para preparação de amostras, contém os seguintes equipamentos: laminar da classe II de proteção "SP-1.2": termostato de estado sólido com uma tampa de aquecimento para tubos de teste do tipo "Eppendorf"; microcentrífuga a 13.000 rpm; uma centrífuga (Vortex); geladeira com uma faixa de temperatura de -20 ^о С a +10 ^о С; pipetas de volume variável da série "Rroline"; uma bomba com um balão de armadilha OM-1; um tripé para pipetas; estação de trabalho com tripé 200x0,5 ml; estação de trabalho com tripé 50x1,5 ml; Suportes para armazenamento de tubos de ensaio 80x1,5 ml;
• Sala de preparação da mistura de reacção: caixa de PCR da câmara de protecção ("Laminar-C. 110 cm"); centrífuga - Vortex; Pipetas de volume variável da série Proline; um tripé para pipetas; estação de trabalho de tripé 200x0,2 ml; Suportes para armazenamento de tubos de ensaio 80x1,5 ml; geladeira com uma faixa de temperatura de -20 ^о С a + 10 ^о С;
• espaço para eletroforese: câmera para eletroforese horizontal; fonte de alimentação; transiluminador;
• Amplificadores de DNA ou analisador de ácido nucleico (PCR em tempo real) com um computador e software; pode ser colocado em qualquer quarto livre. Se a tecnologia de PCR em tempo real for usada. Não é necessário espaço para eletroforese.

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Controle de qualidade externo

Para ter confiança em obter resultados objetivamente confiáveis, os laboratórios devem participar do sistema de avaliação externa da qualidade da pesquisa em laboratório.

Os participantes no sistema de controle de qualidade recebem; 12 ampolas com suspensões liofilizadas de células bacterianas, duas das quais contendo E. Coli E. Coli, 3 ampolas com mycobacterium tuberculosis (cepa avirulenta) a uma concentração de 10 ² / ml; 3 ampolas com células de uma estirpe similar a uma concentração de 10 ⁴ / ml; 2 ampolas com micobactérias não tuberculose M. Avium-intracellulare e M. Kansasii em uma concentração de 10 ⁵ / ml.

Testes distribuídos para avaliação de qualidade externa são pré-testados em dois laboratórios independentes com ampla experiência neste campo.

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