Modelos experimentais de osteoartrite

A cartilagem é um tecido altamente especializado contendo apenas um tipo de células (condrócitos), caracterizada pela ausência de sangue e vasos linfáticos. A nutrição da cartilagem é realizada principalmente por absorção do líquido sinovial. O metabolismo dos condrocitos é regulado por uma série de fatores solúveis produzidos localmente por condrócitos e tecidos circundantes. A função dos condrócitos também depende da composição do meio extracelular (tensão do oxigênio, concentração de íons, pH, etc.), composição do VCM, interação célula e matriz, sinais físicos. A principal tarefa da modelagem experimental é a criação de culturas no ambiente extracelular sem alterar o fenótipo das células maduras. A segunda tarefa é criar culturas para estudar a resposta prematura, retardada, a curto ou a longo prazo de condrócitos a sinais químicos e / ou físicos. Os estudos in vitro também proporcionam uma oportunidade para estudar o comportamento dos condrócitos na osteoartrite. A terceira tarefa é o desenvolvimento de sistemas co-curativos, que permitem estudar as interações de vários tecidos na articulação. A quarta tarefa é a preparação de implantes cartilaginosos para o posterior transplante. E, finalmente, a quinta tarefa é estudar fatores de crescimento, citocinas ou agentes terapêuticos capazes de estimular o reparo e / ou a inibição da reabsorção da cartilagem.

Ao longo das últimas décadas, foram criados vários modelos de culturas de células de cartilagem articular, incluindo culturas monocamadas, culturas suspensas, culturas de condron, explantes, coculturas, culturas de células imortais. Cada cultura tem suas vantagens e desvantagens e cada uma é adequada para estudar um aspecto particular do metabolismo de condrócitos. Assim, os explantes cartilaginosos são um excelente modelo para estudar o turnover dos elementos da matriz, que requer receptores de superfície celular genuínos e interações celulares e matriz-célula normais. Ao mesmo tempo, o estudo de depósitos na matriz ou mecanismos para a regulação do metabolismo de condrócitos é recomendado para ser realizado em uma cultura de células isoladas. Uma cultura monolayer de baixa densidade é necessária para estudar o processo de diferenciação celular. As culturas suspensas em uma matriz natural ou sintética são um modelo para analisar a resposta adaptativa dos condrócitos ao estresse mecânico.

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Cultivares de condrócitos

Ao escolher tecido de cartilagem para estudos in vitro, vários pontos importantes precisam ser considerados. A composição da matriz e a atividade metabólica dos condrócitos variam em diferentes articulações, e esta também depende da profundidade do condrócito no tecido. Esses dados foram obtidos em vários experimentos em que foram estudadas subpopulações isoladas de condrócitos das zonas de cartilagem de diferentes profundidades. Foram encontradas várias diferenças morfológicas e bioquímicas entre condrócitos cultivados localizados na superfície e camadas profundas da cartilagem articular. As células de superfície sintetizam uma matriz fibrilar raramente rica em proteoglicano, enquanto as células mais profundas produzem uma matriz rica em fibrilas e proteoglicanos. Além disso, as células da superfície produzem proteoglicanos relativamente não agregados relativamente pequenos e ácido hialurônico e relativamente menos sulfato de agreco e queratano do que os condrócitos mais profundamente localizados. Outra característica distintiva importante do metabolismo dos condrócitos isolados das zonas de cartilagem de diferentes profundidades é a resposta ao estímulo exógeno. De acordo com M. Aydelotte e co-autores, os condrocitos de touro da zona de superfície da cartilagem foram mais sensíveis à IL-1 do que as células da zona profunda.

O comportamento das células também depende da localização do tecido. Os condrócitos das cartilagens das costelas e orelhas, retirados do mesmo animal, respondem de forma diferente aos fatores de crescimento, como fator de crescimento de fibroblastos (FGF) e TGF-beta. FGF aumentou a incorporação de timidina, prolina e leucina na cultura dos condrócitos da costela, mas não na orelha. O TGF-P aumentou a incorporação de timidina nos condrócitos da cartilagem da costela e da orelha, mas não afetou a incorporação de timidina e prolina nos condrócitos da orelha. As células de cartilagem obtidas a partir de zonas com maior carga diferem das de locais com baixa carga na cartilagem. Por exemplo, os condrócitos maduros da cartilagem da articulação do joelho a partir da região central da superfície óssea tibial ovelhas articular não coberto pelo menisco, que transporta a maior carga in vivo, menor agrecano sintetizado, decorina, mas maior do que as células das zonas abrangidas pelo menisco. Os autores também enfatizam a importância de usar cartilagem de zonas articulares idênticas ao examinar a função sintética das articulações.

O metabolismo dos condrócitos e sua resposta a fatores reguladores também depende significativamente da idade do doador, do desenvolvimento do esqueleto e do estado das articulações das quais as células são tomadas. Nos condrócitos humanos, observa-se uma diminuição significativa com a idade da resposta proliferativa. A maior diminuição é observada em doadores com idade entre 40-50 anos e mais de 60 anos. Além disso, a gravidade da resposta proliferativa aos fatores de crescimento (por exemplo, FGF e TGF-beta) diminui durante o envelhecimento. Além das mudanças quantitativas na proliferação de condrócitos, também há mudanças qualitativas. As células doadoras jovens (10-20 anos) respondem melhor ao fator de crescimento derivado das plaquetas (PDGF) do que ao TGF-beta, enquanto o oposto é observado em células doadoras adultas. Para explicar as mudanças dependentes da idade na função sintética dos condrócitos e sua resposta ao efeito dos fatores de crescimento, são utilizados vários mecanismos. Entre eles, uma diminuição no número e afinidade dos receptores celulares de superfície, uma mudança na síntese e bioatividade dos fatores de crescimento e citoquinas, uma modificação dos sinais postreceptor.

A condição patológica das articulações também altera a morfologia e a atividade metabólica dos condrócitos. Assim, J. Kouri e co-autores (1996) identificaram três subpopulações de condrócitos na cartilagem com osteoartrite. Os condrócitos do meio superficial e superior da cartilagem formam clusters e sintetizam mais proteoglicanos e colágeno. O TGF-beta e o factor de crescimento semelhante a insulina (IGF) são capazes de estimular a síntese de proteoglicanos por condrócitos e neutralizar parcialmente os efeitos de IL-1 e TNF-a. Os explantes de cartilagem afetados pela osteoartrite e condrócitos isolados da cartilagem de um paciente com osteoartrite são mais sensíveis à estimulação de TGF-beta do que os condrócitos de cartilagem saudável. Essas diferenças são provavelmente associadas a alterações fenotípicas em condrócitos nas camadas superiores da cartilagem articular.

O isolamento de condrócitos individuais é conseguido por tratamento sequencial com enzimas proteolíticas de ECM. Após a sua liberação do ECM, células isoladas são ideais para estudar a síntese de componentes de matriz de novo. Alguns autores utilizam apenas clostridium colagenase, outros pré-incubar cartilagem com tripsina, pronase, DNase e / ou hialuronidase. O número de células isoladas depende das enzimas utilizadas. Assim, quando o processamento de um de 1 g de tecido de colagenase pode ser obtido 1,4T0 ⁶ condrócitos, ao passo que quando se utiliza a pronase, a colagenase e hialuronidase - 4,3-10 ⁶. Quando o processamento com colagenase, aggrecan, proteínas, IL-6, IL-8 permanecem na cultura celular muito mais do que no caso de tratamento seqüencial com várias enzimas. Existem várias explicações para essas diferenças entre as duas culturas celulares:

• receptores celulares danificadas ou deprimidas pela acção de enzimas, o TGF-beta inibe a síntese de ADN de proteoglicanos nos condrócitos recentemente isoladas (dia 1), enquanto que o ADN e a síntese de proteoglicano de condrócitos em cultura em monocamada (7 dias) estimuladas por TGF-beta. No entanto, a re-expressão dos componentes da membrana requer período adequado, antes de começar a experiência.
• As proteases exógenas podem quebrar a interação das células e a matriz, mediada por integrinas. A família integrina promove a ligação de condrócitos a moléculas de VKM (Shakibaei M. Et al., 1997). Essa ruptura pode afetar a expressão de genes da matriz.
• Os resíduos dos componentes da matriz podem regular a função sintética dos condrócitos. As integrinas são capazes de reconhecer produtos de degradação de ECM, desempenhando assim um papel importante no reparo tecidual após a exposição a enzimas proteolíticas. T. Larsson e co-autores (1989) relataram que a adição de pró-teoglicanos intactos ou fragmentados à cultura celular estimula a síntese de proteínas e proteoglicanos. No entanto, um alto nível de ácido hialurônico provoca uma redução significativa na inclusão de sulfatos na síntese de proteoglicanos pelos condrócitos do embrião de pinto, condrocitos maduros do porco e células de condrossarcoma do rato. Além disso, o ácido hialurônico é um inibidor da liberação de proteoglicanos das células, mesmo na presença de IL-lb, TNF-a, FGF, o que indica uma resistência à primeira atividade biológica de fatores de crescimento e citoquinas. O mecanismo exato subjacente à ação do ácido hialurônico não está claro; Sabe-se que os condrócitos contêm um receptor de ácido hialurônico, associado a filamentos de actina do citosol. A ligação do ácido hialurônico ao seu receptor estimula a fosforilação das proteínas. Assim, esses dados demonstram a modulação da função metabólica de condrócitos por moléculas fragmentadas ou nativas de proteínas da matriz ativando as células receptoras da membrana.
• A estimulação rápida por enzimas da síntese de proteínas da matriz por condrócitos pode ser uma conseqüência de uma mudança na forma dos condrócitos e / ou da reorganização do citoesqueleto.
• Algumas citocinas (por exemplo, IL-8) e fatores de crescimento (por exemplo, IGF-1, TGF-P) são fixadas no ECM. O exemplo mais conhecido é a ligação do TGF-beta com decore, o que leva a uma diminuição da capacidade do primeiro para induzir o crescimento celular nas células do ovário em hamsters chineses. Os dados que o conteúdo da decoração da cartilagem aumenta com a idade, indicam uma diminuição da biodisponibilidade do TGF-beta no envelhecimento. Fatores de crescimento e citocinas podem ser liberados a partir de resíduos de matriz durante a cultura e, em seguida, modulam a função dos condrócitos.

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Cultura monocapa de condrócitos

O fenótipo diferenciado dos condrócitos é caracterizado principalmente pela síntese de colágeno tipo II e proteoglicanos específicos de tecido, bem como por um baixo nível de atividade mitótica. Há evidências de que, com o cultivo prolongado de células em uma monocamada, e após várias passagens repetidas de células, os condrócitos perdem seus contornos esféricos, adquirem uma forma alongada, semelhante a fibroblastos. Com esta metaplasia de fibroblasto, a função sintética das células também é modificada, caracterizada por uma diminuição progressiva na síntese de tipos de colágeno II, IX e XI e um aumento na síntese de colágenos I, III e Utyopov. Pequenos proteoglicanos não agregados são sintetizados por aggrecan funcional. A sintetzatepsina B e L é extremamente baixa em células diferenciadas, mas no processo de perda de diferenciação aumenta. A colagenase-1 é expressa em condrócitos diferenciados, com cultivo prolongado, sua expressão diminui, enquanto a produção de inibidores de tecido de metaloproteases (TIMP) aumenta.

Os condrócitos diferenciados reexpressam o colágeno do fenótipo diferenciado quando são transferidos de uma cultura monocamada para uma suspensa. O processo de diferenciação provavelmente está relacionado à forma das células. Esta propriedade é regularmente utilizada por pesquisadores que estudam transplantes defeituosos com condrócitos autólogos. Um pequeno número de células obtidas a partir de um material de biópsia pode ser multiplicada em uma cultura monocamada e depois colocada novamente em uma matriz tridimensional antes do transplante. A reexpressão de um fenótipo específico por condrócitos desdiferenciados transferidos para uma cultura de agarose pode ser estimulada com TGF-p, um complexo osseína-hidroxiapatita e ácido ascórbico.

Em resposta ao efeito de fatores de crescimento e citoquinas, os condrócitos são modificados durante o processo de diferenciação. A resposta celular a citocinas e fatores de crescimento diferem entre condrócitos indiferenciados e diferenciados. A IL-1 estimula a proliferação de fibroblastos, enquanto o crescimento de condrócitos indiferenciados é inibido pela IL-1. A síntese de DNA é estimulada pelo IGF-1 em condrócitos alongados, mas não achatados. Nos condrócitos diferenciados, os efeitos estimulantes de IL-1β e TNF-α em produtos de procollagenase são mais pronunciados do que em indiferenciados.

Cultivo de condrócitos

O cultivo de condrócitos em suspensão em um meio líquido ou em uma matriz tridimensional natural ou sintética estabiliza o fenótipo do condrócito. As células mantêm sua forma esférica, sintetizam proteínas específicas de tecido. Uma cultura de condrocitos ponderados é geralmente recomendada para o estudo da formação de uma nova matriz pericelular. As culturas de condrócitos em polímeros absorventes sintéticos ou naturais são usadas para implantar células em defeitos de cartilagem para estimular a regeneração do tecido da cartilagem da articulação. Ambiente sintético ou natural para células implantáveis deve satisfazer uma série de requisitos:

• Os implantes devem ter uma estrutura porosa para adesão e crescimento celular,
• nem o próprio polímero nem os produtos de sua degradação devem causar inflamação ou reações tóxicas durante a implantação in vivo,
• o transportador de transplantes deve ser capaz de se ligar a um cartilage adjacente ou ao osso subcondral,
• uma matriz natural ou sintética deve ser capaz de absorção, sua degradação deve ser equilibrada pela regeneração do tecido,
• Para facilitar o reparo da cartilagem, a estrutura química e a matriz da matriz devem ajudar a manter o fenótipo celular inserido nos condrócitos e a síntese de proteínas específicas de tecido,
• durante a implantação in vivo, é necessário estudar as propriedades mecânicas da matriz sintética ou natural.

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Suspensão de condrócitos na fase líquida

A ligação de células a vasos plásticos em que os condrócitos são cultivados pode ser prevenida ao revestir suas paredes com uma solução de metilcelulose, agarose, hidrogel (poli-2-hidroxietil metacrilato) ou uma mistura de colágeno-agarose. Nessas condições, os condrócitos formam clusters e sintetizam principalmente colágenos específicos para o agregado e tecido (tipos II, IX, XI). Normalmente, dois tipos de células são encontradas. As células localizadas no centro mantêm uma forma esférica cercada por um ECM bem desenvolvido, que é confirmado por estudos histoquímicos e ultraestruturais. Na periferia, os condrócitos têm contornos discóides, estão rodeados por um ECM raro; Pouco se sabe sobre as características funcionais de tais células.

O cultivo de condrócitos em microportadores suportados em suspensão é possível; Os grânulos de dextrano (cytodex), os grânulos de dextrano revestidos com colagénio (cytodex III), microesferas não vazias de colágeno tipo I (colágeno) são usados como microportadores. Sob estas condições de cultura, os condrócitos se prende à superfície do microportador, mantêm sua forma esférica e produzem um material parecido com a matriz. Além disso, o uso de colágeno promove a proliferação de condrócitos e a reexpressão de um fenótipo normal. Portanto, o cultivo de condrócitos nas microesferas do colágeno pode ser usado para restaurar o fenótipo celular antes do transplante.

Outro método de cultivo de uma suspensão de condrócitos em um meio líquido é o seu cultivo na forma de pérolas densas que consistem em células (0,5-1 * 10 ^b ) obtidas por centrifugação. Tais condrócitos são capazes de produzir uma matriz contendo um grande número de proteoglicanos, colágeno tipo II, mas não colágeno de tipo I, que é confirmado por métodos histológicos, imunoistoquímicos e quantitativos.

Suspensão de condrócitos em um ECM natural

Os condrócitos podem ser cultivados em suspensão em uma matriz tridimensional (agar macio, agarose, gel de colágeno ou esponja, ácido hialurônico, cola de fibrina, pérolas de alginato).

Os condrócitos de agarose cultivados mantêm seu fenótipo normal e sintetizam colágeno tipo II e agregados novos agregados específicos de tecido. Quando cultivados em agarose, proteoglicanos sintetizados em células são libertados no meio durante 50 dias. Para comparação - em cultura monocamada, a fase celular é superada com glicosaminoglicanos já nos primeiros 5-6 dias de cultivo; quando cultivada no meio após a síntese e a liberação de glicosaminoglicanos é intensificada, a diminuição dependente do tempo em glicosaminoglicanos ocorre nos primeiros 8-10 dias. No entanto, o comportamento dos condrócitos durante o seu cultivo em agarose difere daquelas em condições in vivo. Em agarose, um grande número de agregados de Aggregan sintetizados contém moléculas menores e menores do que in vivo. O TGF-P estimula a síntese de proteoglicanos no explante, mas reduz a síntese de aggrecan em agarose.

O alginato é um polissacarídeo linear derivado de algas marrons. Na presença de catiões divalentes, tais como ^{íons de} Ca2 ⁺, este polímero torna-se um gel. Cada condrócito encontrado no alginato é cercado por uma matriz de polissacarídeos carregados negativamente, cujos poros são proporcionais aos da cartilagem hialina. A matriz que forma condrócitos em pérolas de alginato consiste em duas seções: uma camada fina da matriz associada à célula correspondente à matriz pericelular e territorial, a cartilagem articular e uma matriz mais remota equivalente à matriz interterritorial no tecido nativo. No trigésimo dia de cultivo, o volume relativo e absoluto ocupado pelas células, e cada uma das duas divisões no talão de alginato são quase idênticas às da cartilagem nativa. Durante cerca de 30 dias condrócitos mantêm a sua forma esférica e produzir propriedades hidrodinâmicas, agrecano, que são semelhantes aos das moléculas de agrecano da matriz de cartilagem articular e colagénio molécula II, IX e XI tipos. Ao mesmo tempo, como outras culturas em suspensão, as células achatadas estão presentes na superfície das pérolas de alginato, que produzem uma pequena quantidade de moléculas de colágeno de tipo I que são liberadas diretamente no meio e não incorporadas no ECM. Nas pérolas de alginato, observa-se uma proliferação moderada de condrócitos. Após 8 meses de cultivo no gel de alginato, os condrócitos maduros não perdem atividade metabólica e continuam a sintetizar o colágeno tipo-colágeno do tipo II e o agrecano.

N. Tanaka e co-autores (1984) investigaram as propriedades de difusão de várias moléculas naturais no alginato e descobriram que moléculas maiores que 70 kD não se difundem através do alginato. Assim, o cultivo de células no alginato é adequado para estudar a regulação da biossíntese da matriz e a organização da ECM. A disponibilidade de células cultivadas no alginato permite investigar o efeito de fatores reguladores de peptídeos e agentes farmacológicos em níveis transcricionais, pós-transcricionais e translacionais.

Os condrócitos também são cultivados em uma matriz de tipos de fibras de colágeno I e II. S. Nehrer e co-autores (1997) compararam o funcionamento de condrócitos de cães em matrizes poliméricas por colágeno-proteoglicano porosas contendo colágenos de diferentes tipos. Eles encontraram diferenças importantes na morfologia da função biossintética dos condrócitos cultivados em matrizes de colágeno contendo os tipos de colágeno I e II. As células na matriz de colágeno tipo II enrolaram sua forma esférica, enquanto que no colágeno tipo I, eles tinham uma morfologia semelhante a fibroblastos. Além disso, na matriz de colágeno tipo II, os condrocitos produziram mais glicosaminoglicanos. J. Van Susante et ai (1995) compararam as propriedades dos condrócitos cultivados no alginato e no gel de colágeno (tipo I). Os autores encontraram um aumento significativo no número de células no gel de colágeno, mas a partir do sexto dia de cultivo, as células perderam um fenótipo característico, transformando-se em células semelhantes a fibroblastos. No gel de alginato, observou-se uma diminuição do número de células, mas os condrócitos mantêm seu fenótipo normal. No gel de colágeno, o número de proteoglicanos por célula foi significativamente maior do que no alginato, no entanto, no gel, a síntese dos elementos da matriz foi reduzida a partir do 6º dia de cultivo, enquanto que no alginato a síntese continuou a crescer.

Uma matriz de fibrina tridimensional sólida é uma substância natural que suporta os condrócitos pesados nele em um fenótipo diferenciado. A matriz de fibrina 3D também pode ser usada como transportadora para o transplante de condrócitos. As vantagens da fibrina são a ausência de citotoxicidade, a capacidade de preencher o espaço, a capacidade adesiva. Por estudos histológicos e bioquímicos, autorradiografia, microscopia eletrônica, condrócitos no gel de fibrina foram encontrados para reter sua morfologia, multiplicar e produzir uma matriz mesmo após 2 semanas de cultura. No entanto, G. Homminga e co-autores (1993) relataram que, após 3 dias de cultivo, começa a desintegração da fibrina, a desdiferenciação dos condrócitos progride.

Suspensão de condrócitos em um ECM artificial (sintético)

Os implantes de cartilagem para cirurgia reconstrutiva ou ortopédica podem ser obtidos através do crescimento de condrócitos isolados in vitro em uma matriz biocompatível sintética.

Os condrocitos de ácido poliglicólico cultivados proliferam e mantêm morfologia e fenótipo normais dentro de 8 semanas. O complexo de condrócitos-ácido poliglicólico consiste em células, glicosaminoglicanos, colágenos e possui uma cápsula externa de colágeno. No entanto, em tais implantes existem dois tipos de moléculas de colágeno - I e II. Implantes de desdiferenciados por uma série de passagens de condrócitos têm um maior número de glicosaminoglicanos e colágenos do que nos implantes de condrócitos primariamente indiferenciados.

L. Freed e co-autores (1 993b) compararam o comportamento de culturas de condrócitos humanos e de touro em ácido poliglicólico fibroso (HPHC) e em ácido poliláctico (PPLC). Após 6-8 semanas de cultivo de condrócitos de touro no HSVG ou PPLC, os autores observaram a proliferação celular e a regeneração da matriz da cartilagem. No HSBC, os condrócitos eram esféricos, localizados em lacunas cercadas por uma matriz cartilaginosa. Após 8 semanas de cultura in vitro, o tecido regenerado continha até 50% de matéria seca (4% de massa celular, 15% de glicosaminoglicanos e 31% de colágeno). Nas células PPLK estavam em forma de fuso, uma pequena quantidade de glicosaminoglicanos e colágeno. No HSBC, o crescimento celular foi 2 vezes mais intenso do que na PTCA. Em condições in vivo, os condrócitos cultivados em HPVC e PPLC durante 1 a 6 meses produziram um tecido histologicamente semelhante à cartilagem. Os implantes continham glicosaminoglicanos, tipo I e colágeno tipo II.

Os condrócitos de touro fetal foram cultivados em polietileno hidrofóbico e hidrofílico poroso de alta densidade porosa. Após 7 dias de incubação em ambos os substratos, as células conservaram uma forma esférica, contendo principalmente colágeno tipo II. Após 21 dias de cultivo, verificou-se que a matriz hidrofílica contém mais colágeno tipo II do que a matriz hidrofóbica.

O tecido de cartilagem também pode ser obtido por cultura em uma monocamada em filtros Millicell-CM. O pré-revestimento dos filtros com colágeno é necessário para a conexão de chondroits. O exame histológico da cultura demonstra o acúmulo de condrócitos nos proteoglicanos contendo ECM e colágeno tipo II. O colágeno tipo I em tal cultura não é detectado. Os condrócitos no tecido cartilaginoso resultante têm uma forma esférica, mas na superfície do tecido estão um pouco achatados. A espessura do tecido recém formado aumentou com o tempo e dependia da densidade inicial da monocamada de células. Sob condições óptimas de cultura, a espessura do tecido cartilaginoso atingiu 110 μm, a organização de suas células e colágeno na superfície e camadas profundas é semelhante à da cartilagem articular. A VKM contém aproximadamente 3 vezes mais colágeno e proteoglicanos. Após 2 semanas de cultivo, observou-se o acúmulo da matriz-sa, o que possibilitou extrair o tecido do filtro e utilizá-lo para transplante.

Sims et al. (1996) estudaram o cultivo de condrócitos em uma matriz de polímero encapsulado de óxido de polietileno que permite que um grande número de células seja transportado por injeção. Seis semanas após a injeção no tecido subcutâneo de camundongos athymic, formou-se uma nova cartilagem, caracterizada morfológicamente por opalescência branca semelhante à cartilagem hialina. Os dados de estudos histológicos e bioquímicos indicaram a presença de condrócitos ativamente proliferantes, que produzem ECM.

Explicação

O exame do tecido cartilaginoso é utilizado para estudar os processos de ana-catabolismo, homeostase, reabsorção e reparação. Os condrócitos em explantes de tecido cartilaginoso suportam o fenótipo e composição normal de ECM, semelhante àqueles na cartilagem articular in vivo. Após 5 dias de cultivo na presença de soro, um nível constante de síntese e degradação natural é alcançado. A reabsorção do tecido pode ser acelerada na cultura e cultura principal com a adição de soro por vários agentes, por exemplo, IL-IB, TNF-a, lipopolissacarídeos bacterianos, derivados de ácido retinóico ou radicais de oxigênio ativo. Para estudar o reparo da cartilagem, seu dano é induzido por mediadores solúveis de inflamação (H ₂ O ₂, IL-1, TNF-a) ou ruptura física da matriz.

O método das culturas organotípicas é um modelo para estudar os efeitos in vitro de fatores externos isolados em condrócitos e a matriz circundante. In vivo, os condrócitos raramente estão localizados no ECM e não se contatam. A cultura da cartilagem articular explante esta organização estrutural, bem como as interações particulares entre os condrócitos e seu ambiente extracelular circundante. Este modelo também é usado para estudar o efeito do estresse mecânico, agentes farmacológicos, fatores de crescimento, citocinas, hormônios no metabolismo da cartilagem.

Outra vantagem da explicação do tecido cartilaginoso é a ausência de dano de condrócitos por enzimas proteolíticas ou um fator mecânico, o que é inevitável quando as células são isoladas. Os receptores e outras proteínas da membrana e glicoproteínas estão protegidos de fatores prejudiciais.

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Cultura de condomínios

Chondron é uma unidade estrutural, funcional e metabólica da cartilagem articular, constituída por um condrocito, sua matriz pericelular e uma cápsula compacta de filamentos e é responsável pela homeostase da matriz. Os chondrons são extraídos mecanicamente da cartilagem e coletados por várias sucessivas homogeneizações de baixa velocidade. Isolados de zonas de diferentes profundidades da cartilagem, os condondes podem ser divididos em quatro categorias: chondron único, chondrons acoplados, múltiplos (três ou mais) chondrons linearmente localizados (colunas de condondro), um conjunto de condondes.

Chondrons simples são geralmente encontrados nas camadas médias de cartilagem intacta, emparelhados - na borda de camadas médias e profundas, os condondes múltiplos de localização linear são típicos para camadas profundas de cartilagem intacta. Finalmente, os aglomerados de chondrons consistem em grupos organizados aleatoriamente de condomos únicos e emparelhados que mantêm o estado agregado após a homogeneização. As acumulações de condomos são grandes fragmentos de cartilagem, geralmente contendo vários condomos e fibrilas de colágeno localizadas radialmente, ou seja, uma organização típica característica das camadas profundas da matriz. Chondrons são imobilizados em uma agarose transparente, que permite estudar sua estrutura, composição molecular e atividade metabólica. O sistema de chondron - agarose é considerado como um micromodel de cartilagem, que difere do sistema tradicional de condrócito - agarose, na medida em que um microambiente natural é mantido, não há necessidade de realizar sua síntese e montagem. A cultura dos condomos é um modelo para estudar as interações de células e matrizes na cartilagem articular em condições normais e patológicas.

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Cultura de condrócitos imortais

Para criar linhas celulares permanentes, são utilizados vírus recombinantes de DNA ou oncogênicos que podem tornar a célula "imortal". Os condrócitos imortais têm a capacidade de proliferação sem fim, mantendo um fenótipo estável. F. Mallein-Gerin e co-autores (1995) mostraram que o SV40T-oncogene induz a proliferação de condrócitos de rato, que neste caso continuam a expressar de forma estável os tipos de colágeno II, IX e XI, bem como agregados articulares e uma proteína de ligação. No entanto, essa linha celular adquire a capacidade de sintetizar colágeno de tipo I quando cultivada em uma cultura monocamada ou em um gel de agarose.

W. Horton e co-autores (1988) descreveram uma linha de células imortais com um baixo nível de expressão de mRNA de colágeno tipo II. Essas células foram obtidas transformando-as com um retrovírus de mouse contendo I-myc- e y-ra-oncogenes. Este tipo de células é um modelo único para estudar as interações da matriz articular na ausência de colágeno tipo II, bem como a regulação da síntese de colágeno tipo II.

A cultura de condropetas com genes mutados ou deletados é um modelo conveniente para o estudo de sua função fisiológica. Este modelo é particularmente adequado para estudar o papel de moléculas específicas na organização de uma matriz cartilaginosa ou estudar os efeitos de vários fatores regulatórios sobre o metabolismo da cartilagem. Os condrócitos com um genoma excluído de colágeno tipo IX sintetizam fibrilas de colágeno mais largas do que o normal, indicando que o colágeno tipo IX regula o diâmetro das fibrilas. Conforme observado no Capítulo 1, uma mutação do gene COLAI que codifica o colágeno tipo II em famílias com osteoartrite primária generalizada foi recentemente detectada. Para estudar o efeito da mutante de colagénio do tipo II na matriz articular R. Dharmrvaram et al (1997) realizaram transfecção ( "contaminação" de um ácido nucleico estranho) COL defeituoso ₂ AI (arginina na posição 519 é substituída por cisteína) em condrócitos fetais humanos in vitro.

Sistema de coculturas. Na articulação, a cartilagem interage com células de outros tipos contidas na membrana sinovial, líquido sinovial, ligamentos, osso subcondral. O metabolismo dos condrócitos pode ser influenciado por vários fatores solúveis sintetizados por essas células. Assim, a artrite cartilagem articular é destruída por enzimas proteolíticas e radicais livres, que são produzidas por células sinoviais. Portanto, modelos foram desenvolvidos para estudar interações complexas entre cartilagens e tecidos circundantes, que são chamados de cocultura.

S. Lacombe-Gleise et al (1995) foram os condrócitos de coelho cultivadas e osteoblastos no sistema de co-cultura (Costar), em que as células foram separadas da membrana microporosa (0,4 micron) permite que a troca entre os dois tipos de células, sem qualquer contacto directo. Este estudo demonstrou a capacidade dos osteoblastos para estimular o crescimento de condrócitos através de mediadores solúveis.

A.M. Malfait e co-autores (1994) investigaram a relação entre monócitos de sangue periférico e condrócitos. Este modelo é conveniente para estudar os processos mediados por citocinas, em artropatias inflamatórias (artrite reumatóide, espondilite soronegativa, etc.). Os autores do modelo separaram as células por uma membrana de ligação à proteína com poros de 0,4 μm de diâmetro. O estudo mostrou que os monócitos estimulados com lipopolisacarídeos produziram IL-1 e TNF-a, que inibiram a síntese de aggrecan por condrócitos e contribuíram para a degradação dos agregados de agreccitos já sintetizados.

K. Tada e co-autores (1994) criaram um modelo de cocção em que células endoteliais em um gel de colágeno (tipo I) foram colocadas em uma câmara interna separada da câmara externa com um filtro com um tamanho de poro de 0,4 μm colocado com condrócitos. Em um estado de isolamento completo da câmara externa, as células endoteliais humanas formaram tubos em um gel de colágeno na presença de EGF ou TGF-a. Com o cultivo simultâneo de ambos os tipos de células de TGF, a formação dependente dos tubos por células endoteliais foi inibida. A inibição de condrócitos deste processo foi parcialmente eliminada por anticorpos anti-TGF-beta. Pode-se supor que o TGF-beta produzido pelos condrócitos deprime a vascularização da própria cartilagem.

S. Groot e co-autores (1994) simultaneamente cultivaram condrócitos das zonas hipertróficas e proliferativas do osso de um rato fetal de 16 dias com pedaços de tecido cerebral. Após 4 dias de cultura, observou-se a transdiferenciação de condrócitos em osteoblastos e o início da formação de osteóide. Após 11 dias de cultivo, uma parte da cartilagem foi substituída por tecido ósseo e a matriz óssea foi parcialmente calcificada. Alguns neuropeptídeos e neurotransmissores produzidos por tecido cerebral, afetam o metabolismo dos osteoblastos ou possuem receptores neles. Entre eles, a norepinefrina, o péptido intestinal vasoativo, o péptido associado ao gene da calcitonina, a substância P e a somatostatina podem ser isolados . Cultivados com condrócitos, pedaços de tecido cerebral podem produzir alguns desses fatores, que podem induzir o processo de transdiferenciação de condrócitos em osteoblastos.

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A influência de fatores externos na cultura dos condrócitos

O efeito da tensão do oxigênio no metabolismo dos condrócitos

Na maioria dos casos, as culturas de condrócitos se desenvolvem sob condições de tensão de oxigênio atmosférico. No entanto, é bem sabido que os condrócitos in vivo existem sob condições hipóxicas e a tensão do oxigênio varia de acordo com diferentes condições patológicas. Durante o processo de maturação, observam-se alterações significativas no suprimento sanguíneo das epífises. Uma vez que a vascularização varia em diferentes áreas da placa de crescimento, a tensão de oxigênio nelas também varia. C. Brighton e R. Heppenstall (1971) demonstraram que, na placa da tíbia em coelhos, a tensão de oxigênio na zona hipertrófica é menor do que na cartilagem circundante. As medidas de alguns parâmetros metabólicos mostraram que os condrócitos são capazes de reagir rapidamente às mudanças locais na concentração de oxigênio. Em primeiro lugar, com baixa tensão de oxigênio, o consumo de condrócitos diminui. Com uma diminuição da tensão de oxigênio de 21 a 0,04%, a utilização de glicose é aumentada, a atividade da enzima de glicólise e a síntese de ácido lático são aumentadas. Mesmo com baixa tensão de oxigênio, a quantidade absoluta de ATP, ADP e AMP permanece estável. Esses dados indicam a direcionalidade do metabolismo de condrócitos para maximizar a conservação de energia. No entanto, a atividade sintética e, portanto, os processos de reparação, mudam em condições de hipoxia.

A alta tensão de oxigênio também afeta o metabolismo dos condrócitos, causando uma diminuição na síntese de proteoglicanos e DNA, degradação da matriz de cartilagem. Esses efeitos, em regra, são acompanhados pela produção de radicais livres de oxigênio.

Influência da concentração iónica e pressão osmótica do meio ambiente sobre a função dos condrócitos

Na cartilagem nativa, a concentração de iões difere significativamente daquela em outros tecidos: o teor de sódio no meio extracelular é de 250-350 mmol e sua osmolaridade é de 350-450 moles. Ao isolar condrócitos da ECM e incubá-los em mídia padrão (DMEM (Meio Mínimo Mínimo de Dulbecco), a osmolaridade é 250-280.7 mosmol), o ambiente circundante muda dramaticamente. Além disso, a concentração de cálcio e potássio em meios padrão é muito menor do que no tecido nativo, e a concentração de aniões é muito maior.

A adição de sacarose ao meio leva a um aumento da sua osmolaridade e induz um aumento intracelular transitório na concentração de aniões H ⁺ e cálcio no citosol. Tais mudanças intracelulares podem influenciar os processos de diferenciação de condrócitos e sua atividade metabólica. J. Urban et ai (1993) encontraram que a inclusão de ³⁵ 8-sulfato e ³ H-prolina condrócitos isolados incubadas em meio padrão DMEM durante 2-4 horas, foi de apenas 10% do que no tecido nativo. A intensidade de síntese atingiu o máximo com osmolaridade do meio extracelular de 350-400 mosmol, tanto nos condrócitos recém-isolados quanto nos explantes do tecido cartilaginoso. Além disso, o volume de condrócitos aumentou em 30-40% após colocar células isoladas em um meio DMEM padrão da referida osmolaridade. No entanto, quando os condrócitos são cultivados sob osmolaridade não-fisiológica durante 12-16 h, as células se adaptam a novas condições, diminuindo a intensidade da biossíntese em proporção à osmolaridade do meio extracelular.

P. Borgetti e co-autores (1995) investigaram a influência da osmolaridade do meio extracelular no crescimento, morfologia e biossíntese de condrócitos porcinos. Os autores demonstraram características bioquímicas e morfológicas semelhantes de condrócitos cultivados em meios com osmolaridade de 0,28 e 0,38 mosmol. Com osmolaridade de 0,48 mosmol durante as primeiras 4-6 horas de cultura, a proliferação celular e a síntese protéica foram reduzidas, mas posteriormente esses parâmetros se recuperaram, que eventualmente atingiram valores de controle. Quando os condrócitos são cultivados em um meio com osmolaridade de 0,58 mosmol, as células perdem a capacidade de manter a intensidade fisiológica dos processos proliferativos e, após 6 dias, a quantidade de condrócitos diminui significativamente. Com osmolaridade do meio, 0,58 mosmol, observa-se uma inibição profunda da síntese protéica. Além disso, quando cultivadas em meios com uma osmolaridade mOsm 0,28-0,38 condrócitos reter fenótipo fisiológico a uma osmolaridade superior (mOsm 0,48-0,58) alterações significativas na morfologia celular, como perda manifesta fenótipo característico condrócitos conversão em células semelhantes a fibroblastos, bem como perda de células, a capacidade de montar proteoglicanos de matriz. Os resultados deste estudo indicam a capacidade dos condrócitos para responder a oscilações de osmolalidade limitadas no ambiente extracelular.

A mudança na concentração de outros íons também pode afetar os processos de biossíntese em condrócitos. Assim, o grau de inclusão de ³⁵ S (sulfato) aumenta à metade com um aumento na concentração de iões de potássio a partir de 5 mmol (concentração em DM padrão de DM) para 10 mmol (concentração em VKM in vivo). A concentração de cálcio abaixo de 0,5 mmol contribuiu para a produção de colágeno por condrócitos de touro maduros, enquanto uma concentração de 1-2 mmol (correspondente à concentração no meio DM DM padrão) causou uma redução significativa na síntese de colágeno. Observou-se um aumento moderado da biossíntese em níveis elevados de cálcio (2-10 mmol). Diversos cations participam da ligação de condrócitos a proteínas VKM. Assim, os íons de magnésio e manganês fornecem ligação à fibronectina e ao colágeno tipo II, enquanto que os íons de cálcio não participam da ligação de condrócitos às proteínas. Assim, os resultados dos estudos descritos indicam a influência das alterações nos íons extracelulares de potássio, sódio, cálcio e osmolaridade do meio na função biossintética de condrócitos incubados em meios padrão.

A influência do estresse mecânico no metabolismo dos condrócitos

A imobilização da articulação causa uma atrofia reversível da cartilagem, o que indica a necessidade de estímulos mecânicos para o curso normal dos processos metabólicos no ECM. Na maioria dos casos, os modelos de cultura celular utilizados existem em condições normais de pressão atmosférica. M. Wright e co-autores (1996) mostraram que o ambiente mecânico afeta o metabolismo dos condrócitos, a resposta das células depende da intensidade e freqüência da carga de compressão. As experiências com o carregamento de explantes de cartilagem articular intacta in vitro demonstraram uma diminuição na síntese de proteínas e proteoglicanos sob a ação de uma carga estática, enquanto o carregamento dinâmico estimula esses processos. Os mecanismos exatos para realizar o efeito do estresse mecânico na cartilagem são complexos e provavelmente estão relacionados à deformação celular, pressão hidrostática, pressão osmótica, potencial elétrico e receptores celulares de superfície às moléculas da matriz. Para estudar o efeito de cada um desses parâmetros, é necessário criar um sistema no qual um parâmetro pode ser variado independentemente. Por exemplo, a cultura de explantes não é adequada para estudar a deformação celular, mas pode ser usada para estudar o efeito geral da pressão sobre a atividade metabólica dos condrócitos. A compressão da cartilagem conduz à deformação das células e também é acompanhada pelo aparecimento de um gradiente de pressão hidrostática, potencial elétrico, fluxo de fluido e alterações nos parâmetros fisicoquímicos, como o teor de água na matriz, a densidade de carga elétrica e o nível de pressão osmótica. A deformação celular pode ser estudada usando condrócitos isolados imersos em um gel de agarose ou colágeno.

Vários sistemas foram desenvolvidos para estudar o efeito da estimulação mecânica na cultura dos condrócitos. Alguns pesquisadores usam sistemas para esse propósito em que a pressão é aplicada à cultura celular através da fase gasosa. Assim, JP Veldhuijzen et al. (1979), usando uma pressão acima da atmosférica a 13 kPa a baixa freqüência (0,3 Hz) durante 15 min, observou um aumento na síntese de cAMP e proteoglicanos e uma diminuição na síntese de DNA. R. Smith e co-autores (1996) mostraram que uma exposição intermitente de uma cultura de condrócitos primários a uma pressão hidrostática (10 MPa) a uma freqüência de 1 Hz por 4 horas causou um aumento na síntese de agreccol e de colágeno tipo II, enquanto a pressão constante não afetou esses processos. Usando um sistema semelhante, M. Wright e co-autores (1996) relataram que a pressão cíclica sobre a cultura celular está associada à hiperpolarização da membrana celular dos condrócitos e à ativação de canais de potássio dependentes de Ca2 ⁺. Assim, os efeitos da pressão cíclica são mediados por canais iónicos, ativados pelo alongamento, na membrana dos condrócitos. A resposta dos condrócitos à pressão hidrostática depende das condições da cultura celular e da freqüência da carga aplicada. Assim, a pressão hidrostática cíclica (5 MPa) reduz a inclusão de sulfato na monocamada de condrócitos a uma freqüência de 0,05, 0,25 e 0,5 Hz, enquanto a uma freqüência superior a 0,5 Hz, aumenta a inclusão de sulfato na cartilagem explante.

M. Bushmann et al. (1992) relataram que os condrócitos em um gel de agarose alteram a biossíntese em resposta ao estresse mecânico estático e dinâmico da mesma maneira que o órgão intacto cultivado. Os autores descobriram que a carga mecânica gera um estímulo hiperosmótico seguido de uma diminuição do pH nos condrócitos.

O efeito do alongamento mecânico pode ser estudado em uma cultura de células imersas em um gel. A força de estiramento pode ser criada usando um vácuo controlado por computador. Quando o sistema está no vácuo de certo grau, o fundo da placa de Petri com a cultura celular é prolongado por uma certa quantidade, a deformação é máxima nas bordas do fundo do copo e é mínima no centro. O alongamento é transmitido e cultivado em uma placa de petri de condrócitos. Com este método, Holm-Vall K. Et ai (1995) mostraram que em cultura em colagénio (tipo II), as células de condrossarcoma de gel aumentou a expressão de ARNm e ₂ -integrina. E ₂ p _g integrina é capaz de se ligar ao colágeno do tipo II. É considerado um mecanorreceptor, pois interage com proteínas de ligação a actina, conectando assim o ECM e o citoesqueleto.

Efeito do pH no metabolismo dos condrócitos

O pH do líquido intersticial de ECM do tecido cartilaginoso é mais ácido do que em outros tecidos. A. Maroudas (1980) determinou o pH da cartilagem articular em 6,9. W. Diamant e co-autores (1966) encontraram um pH de 5,5 em condições patológicas. Sabe-se que os condrócitos vivem em baixa PO2, o que indica o papel importante da glicólise (95% do metabolismo total da glicose) no metabolismo dessas células; A glicólise é acompanhada pela produção de uma grande quantidade de ácido láctico.

Além da acidificação do meio ambiente pelos produtos da glicólise, os próprios componentes da matriz são de grande importância. Uma grande quantidade de carga negativa fixa em proteoglicanos modifica a composição iónica extracelular: são observadas uma alta concentração de catiões livres (por exemplo, H ⁺, Na ⁺, K ⁺ ) e uma baixa concentração de aniões (por exemplo, O2, HCO3). Além disso, sob a influência de uma carga mecânica, a água é expulso do ECM, o que leva a um aumento na concentração de cargas negativas fixas e à atração de mais catiões para a matriz. Isto é acompanhado por uma diminuição do pH do meio extracelular, que afeta o pH intracelular, modificando assim o metabolismo dos condrócitos. R. Wilkin e A. Hall (1995) estudaram o efeito do pH do meio extracelular e intracelular sobre a biossíntese da matriz por condrócitos de touro isolados. Eles observaram uma dupla modificação da síntese da matriz com uma diminuição do pH. Uma ligeira diminuição no pH (7,4 35 S0 ₄ e ³ H-prolina em condrócitos em 50% , enquanto uma acidificação mais profunda do meio (pH <7,1) inibiu a síntese em 75% em comparação com controle. A criação do mesmo pH baixo (6,65) com íons de amônio causou uma diminuição da síntese da matriz em apenas 20%. Os resultados obtidos indicam que a modificação do pH do meio de síntese da matriz extracelular não pode ser explicada apenas por mudanças no pH do meio intracelular. Além disso, os condrócitos possuem a capacidade para regular o pH intracelular por Na ⁺, H ⁺ permutador, Ca ⁺ -dependente C1 ^_ -NSOZ -CONVEYORS e H ⁺ / ATPase.

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Efeito da composição do meio para cultivo no metabolismo de condrócitos

O meio para cultivar os condrócitos deve corresponder às condições experimentais. Nos últimos anos, o soro de vitela tem sido usado para otimizar as condições de cultura. No entanto, ao usar soro, vários pontos importantes devem ser considerados:

• crescimento externo de células da periferia do tecido em culturas de órgãos,
• a variabilidade da composição dos soros de várias séries,
• presença de componentes desconhecidos neles,
• aumento do risco de interferência, artefatos no estudo da influência de vários fatores biológicos sobre a atividade metabólica das células.

Um exemplo deste último é o estudo do efeito do EGF em condrócitos de cartilagem em ratos. EGF estimulou a incorporação de ³ H-timidina e aumentar o teor de ADN na cultura. Esse efeito foi mais pronunciado em baixas concentrações séricas (<1%), mas em altas concentrações (> 7,5%) o efeito desapareceu.

Sabe-se que os níveis de síntese e degradação em DMEM enriquecido com soro de vitela são significativamente aumentados em comparação com condições in vivo. As diferenças entre o metabolismo in vivo e in vitro podem ser causadas por diferenças entre o líquido sinovial eo ambiente em que as células são cultivadas. D. Lee et al. (1997) cultivaram condrócitos de touros jovens em agarose usando um meio nutriente contendo DMEM enriquecido com 20% de soro de vitelo e uma grande quantidade de líquido sinovial alogênico normal. A presença de líquido sinovial no meio induziu um aumento no número de proteoglicanos, até 80% da quantidade total de líquido sinovial. Os resultados obtidos indicam que o fluido sinovial em cultura induz uma taxa metabólica semelhante à in vivo, com alto nível de síntese de glicosaminoglicanos e baixo nível de divisão celular.

G. Verbruggen et al (1995) mostraram que a síntese de ³⁵ S-arrpeKaHa condrócitos humanos em cultura em agarose em DMEM sem soro foi de 20-30% do nível de síntese observados em DMEM, suplementado com soro de vitelo a 10%. Os autores determinaram em que medida o IGF-1, o IGF-2, o TGF-P ou a insulina restauram a produção de aggrecan em meios isentos de soro. Os autores concluíram que 100 ng / ml de insulina, IGF-1 ou IGF-2 reduziram parcialmente a síntese de aggrecan a 39-53% do nível de controle. Com uma combinação desses fatores, nenhum fenômeno sinérgico ou cumulativo foi identificado. Ao mesmo tempo, 10 ng / ml de TGF-P na presença de 100 ng / ml de insulina estimularam a síntese de aggrecan até 90% ou mais do nível de referência. Finalmente, a transferrina sérica, isolada ou em combinação com insulina, não afetou a síntese de agrecana. Quando o soro de vitelo foi substituído por albumina de soro bovino, o conteúdo agregado de agrecano foi significativamente reduzido. O enriquecimento do meio para cultura de insulina, IGF ou TGF-P restaurou parcialmente a capacidade das células de produzir agregados de agrecana. Neste caso, IGF-1 e insulina são capazes de manter a homeostase em culturas celulares. Após 40 dias de cultivo em meio enriquecido com 10-20 ng / ml de IGF-1, a síntese de proteoglicanos foi mantida no mesmo nível ou mesmo maior do que no meio contendo 20% de soro de vitelo. Os processos catabólicos prosseguiram mais lentamente em um meio enriquecido com IGF-1 do que em um meio enriquecido com 0,1% de solução de albumina, mas um pouco mais rápido em um meio enriquecido com 20% de soro. Nas culturas de vida longa, 20 ng / ml de IGF-1 mantém um estado de células estável.

D. Lee et al (1993) em comparação com o efeito da composição do meio de cultura (DMEM, DMEM + 20% de soro de vitelo, DMEM + 20 ng / ml de IGF-1) sobre a síntese de ADN numa cultura de cartilagem explante, cultura em monocamada e em suspensão em agarose . Quando cultivados em agarose na presença de soro, os autores observaram uma tendência para agrupar condrócitos em grandes aglomerados. As células cultivadas sem soro ou com IGF-1 foram armazenadas em uma agarose em forma redonda, montadas em pequenos grupos, mas não formaram grandes agregados. Na monocamada, a síntese de DNA foi significativamente maior em meio contendo soro que no meio enriquecido com IGF-1; A síntese de DNA no último foi muito maior que no ambiente não enriquecido. No cultivo de condrócitos em suspensão em agarose em meio não enriquecido e em meio com IGF-1, não foram observadas diferenças na síntese de DNA. Ao mesmo tempo a lama de cultura de condrócitos em agarose em meio suplementado com soro, foi acompanhada por um aumento da incorporação de radionucleidos ³ H-timidina em comparação com outros ambientes.

A vitamina C é necessária para a ativação de enzimas envolvidas na formação de uma estrutura espiral estável de fibrilas de colágeno. Condrócitos, deficiente em relação ao ácido ascórbico, sintetizam precursores não helicoidais sub-hidroxilados de colágeno, que são secretamente segregados. A introdução de ácido ascórbico (50 μg / ml) provoca a hidroxilação dos tipos de colágeno II e IX e a sua secreção em quantidades normais. A adição de vitamina C não afetou o nível de síntese de proteoglicanos. Conseqüentemente, a secreção de colágeno é regulada independentemente da secreção de proteoglicanos.

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