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PCR como método de diagnóstico de doenças genéticas
Última revisão: 23.04.2024
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O PCR é uma nova conquista na genética molecular, utilizada para amplificação de DNA e permite que a porção específica do DNA (ou seja, qualquer gene de interesse) seja rapidamente replicada in vitro mais de 200.000 vezes. Para realizar a reação, é suficiente ter o material de DNA de uma célula; a quantidade de DNA amplificado por PCR é tão grande que este DNA pode simplesmente ser corado (o uso de sondas radioativas após a eletroforese não é necessário). Um pré-requisito para a realização de PCR é o conhecimento da sequência de nucleotídeos da região de DNA amplificada para a seleção adequada de iniciadores artificialmente sintetizados.
Atualmente, o PCR é um processo que ocorre em um único tubo e consiste em ciclos repetidos de amplificação (duplicação e cópia) de uma sequência específica da molécula de DNA, a fim de obter um número suficientemente grande de cópias que podem ser identificadas por eletroforese. Um dos principais componentes da reação é "primers" - oligonucleótidos sintéticos constituídos por 20-30 bases, complementares a "sites" (seções) de recozimento (anexo) no site identificado do DNA modelo.
O PCR prossegue automaticamente em um termostato programável - termociclador (termociclador). O ciclo de três passos, que resulta em réplicas da porção identificável do DNA modelo, é repetido 30 a 50 vezes de acordo com o programa predefinido do termociclador. No primeiro ciclo, os oligopramers se hibridam com o DNA modelo original, e depois (nos ciclos subseqüentes) e com as moléculas de DNA recentemente sintetizadas à medida que se acumulam na mistura de reação. No último caso, a síntese de DNA não termina devido a uma mudança no regime de temperatura, mas ao atingir o limite de DNA polimerase da região amplificada, que determina o tamanho da região de DNA recentemente sintetizada dentro de um nucleótido.
Como método de detecção das moléculas de DNA obtidas, é utilizada a eletroforese, através da qual o material amplificado é dividido de acordo com o tamanho dos amplicões (produtos de amplificação).
Com a ajuda da PCR, é possível investigar diretamente os locais de localização de mutações putativas ou sites polimórficos, bem como estudar a presença de quaisquer outras características específicas do DNA.
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