Métodos de genética molecular para o diagnóstico de doenças hereditárias

Métodos de tecnologia de DNA são usados para determinar a localização de um gene mutante em um cromossomo específico, responsável pela origem de certas formas de patologia hereditária. Como um gene é uma seção do DNA e uma mutação genética é um dano à estrutura primária do DNA (mutação é entendida como todas as alterações na sequência de DNA, independentemente de sua localização e impacto na viabilidade de um indivíduo), então, por meio da sondagem de preparações de cromossomos em metáfase de um paciente com uma doença hereditária, é possível estabelecer a localização do gene patológico. Os métodos de genética molecular criam oportunidades para o diagnóstico de doenças no nível da estrutura alterada do DNA, permitindo-nos determinar a localização de distúrbios hereditários. Os métodos de genética molecular podem identificar mutações associadas à substituição de até mesmo uma única base.

A etapa mais importante da identificação genética é o seu isolamento. O DNA pode ser isolado de qualquer tipo de tecido e células que contenham núcleos. As etapas do isolamento do DNA incluem: lise rápida das células, remoção de fragmentos de organelas e membranas celulares por centrifugação, destruição enzimática de proteínas e sua extração da solução usando fenol e clorofórmio, e concentração de moléculas de DNA por precipitação em etanol.

Em laboratórios de genética, o DNA é mais frequentemente isolado de leucócitos sanguíneos, para os quais 5 a 20 ml de sangue venoso são coletados do paciente para um tubo de ensaio estéril com uma solução anticoagulante (heparina). Em seguida, os leucócitos são separados e processados de acordo com as etapas acima.

A próxima etapa da preparação do material para pesquisa é o "corte" do DNA em fragmentos em áreas com uma sequência de bases estritamente específica, o que é realizado usando enzimas bacterianas - endonucleases de restrição (enzimas de restrição). As enzimas de restrição reconhecem sequências específicas de 4 a 6, e menos frequentemente de 8 a 12 nucleotídeos, em uma molécula de DNA fita dupla e a dividem em fragmentos nos locais dessas sequências, chamados sítios de restrição. O número de fragmentos de restrição de DNA resultantes é determinado pela frequência de ocorrência dos sítios de restrição, e o tamanho dos fragmentos é determinado pela natureza da distribuição desses sítios ao longo do comprimento da molécula de DNA original. Quanto mais frequentemente os sítios de restrição estiverem localizados, mais curtos serão os fragmentos de DNA após a restrição. Atualmente, são conhecidos mais de 500 tipos diferentes de enzimas de restrição de origem bacteriana, e cada uma dessas enzimas reconhece sua própria sequência de nucleotídeos específica. No futuro, os sítios de restrição poderão ser usados como marcadores genéticos de DNA. Os fragmentos de DNA formados como resultado da restrição podem ser ordenados por comprimento por eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida, e assim seu peso molecular pode ser determinado. Tipicamente, o DNA em um gel é identificado por coloração específica (geralmente brometo de etídio) e visualização do gel em luz ultravioleta transmitida. Os locais de localização do DNA são coloridos em vermelho. No entanto, em humanos, quando o DNA é processado por várias enzimas de restrição, tantos fragmentos de diferentes comprimentos são formados que eles não podem ser separados por eletroforese, ou seja, não é possível identificar visualmente fragmentos de DNA individuais na eletroforese (uma coloração uniforme é obtida ao longo de todo o comprimento do gel). Portanto, para identificar os fragmentos de DNA desejados em tal gel, o método de hibridização com sondas de DNA marcadas é usado.

Qualquer segmento de fita simples de DNA ou RNA é capaz de se ligar (hibridizar) com uma fita complementar, com a guanina sempre se ligando à citosina e a adenina à timina. É assim que uma molécula de fita dupla é formada. Se uma cópia de fita simples de um gene clonado for marcada com um marcador radioativo, uma sonda é obtida. A sonda é capaz de encontrar um segmento complementar de DNA, que é então facilmente identificado usando autorradiografia. Uma sonda radioativa adicionada a uma preparação de cromossomos esticados permite que o gene seja localizado em um cromossomo específico: usando uma sonda de DNA, áreas específicas podem ser identificadas durante Southern blotting. A hibridização ocorre se a seção de DNA sendo testada contiver um gene normal. No caso em que uma sequência de nucleotídeos anormal esteja presente, ou seja, as estruturas cromossômicas correspondentes contenham um gene mutante, a hibridização não ocorrerá, o que permite que a localização do gene patológico seja determinada.

Para obter sondas de DNA, utiliza-se o método de clonagem genética. A essência do método é que um fragmento de DNA correspondente a um gene ou a uma seção de um gene é inserido em uma partícula de clonagem, geralmente um plasmídeo bacteriano (DNA extracromossômico anular presente em células bacterianas e que carrega genes de resistência a antibióticos), e então as bactérias com o plasmídeo com o gene humano inserido são multiplicadas. Graças aos processos de síntese no plasmídeo, bilhões de cópias do gene humano ou de sua seção podem ser obtidas.

As cópias de DNA resultantes, marcadas com um marcador radioativo ou fluorocromos, são então usadas como sondas para procurar sequências complementares entre o conjunto de moléculas de DNA estudado.

Atualmente, existem muitos tipos diferentes de métodos que usam sondas de DNA para diagnosticar mutações genéticas.

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