Diagnóstico do herpes

O diagnóstico do herpes é baseado no isolamento clássico do vírus em culturas de células sensíveis, métodos de imunofluorescência e sorológico, exame colposcópico e uso de métodos biológicos moleculares modernos (PCR, hibridização de pontos), que permitem diagnosticar todo o grupo de vírus do herpes, incluindo os tipos HHV-6 e HHV-7.

Métodos de diagnóstico laboratorial para infecção por herpes

Os principais métodos que visam isolar o VHS ou detectar partículas virais e/ou seus componentes	Métodos auxiliares destinados à detecção de anticorpos contra o VHS em fluidos biológicos do corpo humano
Isolamento de HSV em culturas de células e animais sensíveis Microscopia eletrônica direta e imune Variantes diretas e indiretas do IPA IFA Métodos biológicos moleculares Reação de aglutinação do látex	Reação de neutralização RSC Determinação de anticorpos para proteínas não estruturais do HSV-1,2

Foi demonstrado que, em 76% dos pacientes, o herpes genital (HG) é causado pelo HSV-2 e, em 24%, pelo HSV-1. Além disso, a HG como monoinfecção ocorreu em apenas 22% dos pacientes, sendo detectadas associações microbianas em 78% dos casos. Em 46% dos indivíduos, foi detectada parasitocenose causada por dois patógenos, incluindo clamídia, que foi detectada em 40% dos casos. Gardnerella, Trichomonas e gonococos foram detectados com menor frequência em esfregaços.

Em 27% dos pacientes, a parasitocenose foi representada por três patógenos, e em 5,2%, por quatro patógenos. Além disso, a combinação de clamídia com fungos Gardnerella e Candida foi a mais frequentemente observada. Esses dados comprovam a necessidade de um exame bacteriológico completo de pacientes com GH para identificar combinações de agentes patogênicos, bem como um estudo aprofundado da patogênese de infecções mistas do trato urogenital, o que permitirá uma terapia complexa diferenciada para a infecção por herpes.

Materiais estudados para isolamento do VHS em função da localização das lesões herpéticas

Localização das lesões	Conteúdo da vesícula	Raspagem de células				LCR	Aspirado brônquico	Biópsia	Sangue
		1	2	3	4
Couro	+								+
Olhos			+						+
Órgãos genitais				+					+
Ânus	+				+				+
Boca	+	+							+
SNC	+					+		+	+
Pulmões		+					+		+
Fígado								+	+
Herpes congênito	+	+	+				+		+

Métodos de diagnóstico laboratorial da infecção por citomegalovírus

Métodos	Tempo necessário para obter resultados	Notas
VIROLÓGICO
Microscopia eletrônica	3 horas	Não muito acessível
Isolamento de vírus em cultura de células (VCI)	4-20 dias	Padrão, Lento
Coloração de imunofluorescência de AG precoce usando anticorpos monoclonais	6 horas	Menos específico
CITOLÓGICO	2-3 horas	Menos específico
SOROLÓGICO
RSC	2 dias	Padrão
RGA	1 dia	Trabalho intensivo
RECIFE	6 horas	Simples, específico
NRIF	6 horas	Difícil
RIMP	6 horas	Difícil
ELISA (IgM, DO)	6 horas	Rápido, simples
Imunoblot	6 horas	Caro
BIOLÓGICO MOLECULAR
MG	5-7 dias	Caro e trabalhoso
PCR	3 horas	Caro

Métodos de diagnóstico do vírus herpes zoster

Métodos de diagnóstico	Técnicas de laboratório
INDIRETO
Seleção	Cultura de tecidos, embriões de galinha, animais de laboratório, cocultura com células permissivas ou vírus auxiliares
Identificação de isolados	Reação de neutralização, RSC, IF, PIEF, reação de precipitação de isolados, aglutinação, IF
DIRETO
Citologia	Esfregaços: imunofluorescência colorida
Histologia	Patomorfologia da célula
Estrutura	Microscopia embrionária, microscopia imunoeletrônica
Determinação de antígenos	SE, PIEF, RIM, IFA
Determinação da produção local de anticorpos	Ig M, Ig G, Ig A: ELISA, RIA
Abordagens biológicas moleculares	Hibridização molecular, PCR

Diagnóstico laboratorial da infecção causada pelo vírus herpes zoster

Problemas de diagnóstico	Métodos	Resultados esperados
Infecção primária aguda	1	Detecção em 2 horas
	2	Os níveis de anticorpos estão aumentando lentamente
	3	Presente 3 dias após a infecção
Infecção aguda reativada	1	Detecção de UUU após 2 horas
	2	Os níveis de anticorpos estão aumentando lentamente
	4	Presente 4 dias após o aparecimento da erupção

1. determinação de vesículas do VEGF em líquido;
2. sorologia: CSC, ELISA, visando detecção
3. sorologia: ELISA visando detecção de IgM;
4. sorologia: ELISA que visa detectar IgA, IgM.

Métodos para indicar a resposta imune à infecção pelo vírus herpes zoster

Abordagem	Método
Detecção de aumento do título de anticorpos no segundo soro	RSK, RTGA, RPGA, reação de neutralização de IF, RIM, ELISA
Detecção de anticorpos específicos da classe Ig G, Ig A na primeira amostra de soro	ELISA, IF, RIM, aglutinação de látex

Interpretação dos resultados do exame sorológico de soros de pacientes para infecções por herpesvírus (ELISA)

Nome da infecção/marcador	Valores limite médios para infecções
	Resultados da análise	Interpretação
Citomegalia Anti-CMV IgG (1-20 U/ml) IgM anti-CMV (100-300%)	Positivo 1-6 Positivo 6-10 Positivo >10 Negativo Positivo 100-300 Negativo <90 Duvidoso 90-100	Remissão Exacerbação da doença Fase aguda da doença Sem infecção (doença) Fase aguda da doença Repita a análise em 2-3 semanas
Herpes simplex 1,2 sorotipos Anti-HSV 1/2 total (100-900%)	Positivo 100-400 Positivo 400-800 Positivo >800 Negativo <100	Remissão Exacerbação da doença Fase aguda da doença Sem infecção (doença)

A tabela apresenta os principais métodos de diagnóstico laboratorial de infecções por herpesvírus, bem como materiais biológicos recomendados que são examinados no isolamento do HSV, levando em consideração a localização das lesões herpéticas.

Isolamento confiável dos vírus herpes simplex e CMV por meio da infecção de culturas de células sensíveis. Assim, durante o exame virológico de 26 pacientes durante o período de recidiva, o HSV foi isolado em uma cultura de células Vero sensíveis em 23 casos (88,4%). As culturas infectadas apresentaram um quadro de ação citopática típico do HSV - a formação de células gigantes multinucleadas ou um acúmulo de células arredondadas e aumentadas na forma de aglomerados. Em 52,1% dos casos, os focos de ação citopática do vírus puderam ser detectados já em 16-24 horas após a infecção. Em 48-72 horas de incubação das culturas infectadas, a porcentagem de materiais que causam destruição específica de células aumentou para 87%. E apenas em 13% dos casos foram detectados resultados positivos 96 horas após a infecção ou mais ou durante repassagens repetidas.

Métodos de diagnóstico laboratorial da infecção generalizada por herpes

Os principais métodos que visam detectar (isolar) os vírus do herpes, suas partículas e seus componentes

Métodos auxiliares destinados à detecção de anticorpos contra o vírus do herpes em fluidos biológicos, detecção de alterações enzimáticas no soro sanguíneo

Isolamento de vírus do herpes em culturas sensíveis de células e animais Microscopia eletrônica direta e imunológica Variantes diretas e indiretas do método da imunoperoxidase Variantes diretas e indiretas do método do anticorpo fluorescente Variantes do imunoensaio enzimático em fase sólida Variantes do método de hibridização molecular (DNA-DNA) Reação em cadeia da polimerase Reação de aglutinação em látex

Teste de neutralização Teste de fixação de complemento Teste de aglutinação de látex Versão indireta do método de anticorpo fluorescente Versão indireta do método de imunoperoxidase Variantes do imunoensaio enzimático em fase sólida Método de imunotransferência Método de fixação radial do complemento Determinação dos níveis de alanina e aspartato aminotransferase

Métodos sorológicos são utilizados para diagnosticar a mononucleose infecciosa (uma infecção causada pelo VEB). A reação de Paul-Bunnell com hemácias de carneiro, um título diagnóstico de 1:28 ou superior em um único teste de soro sanguíneo ou um aumento de 4 vezes nos anticorpos ao examinar soros pareados, é utilizada. A reação de Hoff-Bauer com uma suspensão a 4% de hemácias de cavalo formalinizadas é utilizada. O resultado é considerado após 2 minutos; na mononucleose infecciosa, a reação é altamente específica.

Atualmente, está sendo desenvolvido um método de ensaio imunoenzimático (EIA) para o diagnóstico da mononucleose infecciosa. Nesse caso, os anticorpos IgG e IgM presentes no soro do paciente são determinados por meio da incubação com linfoblastos infectados com EBV, seguido de tratamento com anticorpos fluorescentes. No período agudo da doença, os anticorpos contra o antígeno do capsídeo viral são determinados em um título de 1:160 ou superior.

Ao utilizar diversos sistemas de teste comerciais importados, o ELISA pode detectar: anticorpos contra o envelope do EBV, anticorpos contra o antígeno precoce do EBV, anticorpos totais contra o antígeno precoce do EBV, determinados na fase aguda da doença, tanto no núcleo quanto no citoplasma da célula, e anticorpos limitados contra o EBV precoce, determinados na fase aguda da doença, tanto no núcleo quanto no citoplasma da célula, anticorpos limitados contra o antígeno precoce do EBV, determinados no auge da doença apenas no citoplasma da célula, e anticorpos contra o antígeno nuclear do EBV. O uso desses sistemas de teste permite o diagnóstico diferencial de diversas doenças associadas ao EBV.

Após um teste ELISA positivo que revela anticorpos para EBV, é realizada uma reação de immunoblotting confirmatória, que determina a presença de anticorpos para proteínas marcadoras individuais de EBV (proteínas p): p23, p54, p72 (a presença desta proteína indica a possibilidade de reprodução do EBV), p 138. Os métodos laboratoriais acima também são usados para monitorar a eficácia do tratamento.

A sensibilidade dos métodos virológicos é de 85-100%, a especificidade é de 100% e o tempo de estudo é de 2 a 5 dias. O método de imunofluorescência direta (IFD) com anticorpos policlonais ou monoclonais contra HSV-1 e HSV-2 é frequentemente utilizado na prática. O método de IFD é facilmente reprodutível em laboratórios clínicos convencionais, não é caro, tem sensibilidade acima de 80% e especificidade de 90-95%. A microscopia de imunofluorescência revelou a presença de inclusões citoplasmáticas, características morfológicas e a porcentagem de células infectadas em esfregaços e raspados da uretra, canal cervical, colo do útero e reto.

O método PIF fornece uma ideia das propriedades morfológicas das células e das alterações na localização dos antígenos do HSV. Além dos sinais diretos de dano celular causado pelo vírus do herpes (detecção de luminescência específica), existem sinais indiretos de infecção por herpes, de acordo com os dados do PIF:

• agregação de matéria nuclear, desprendimento do cariolema;
• a presença dos chamados núcleos “buracos”, quando resta apenas um cariolema do núcleo da célula;
• a presença de inclusões intranucleares - corpos de Cowdry.

Ao realizar o PIF, o médico recebe não apenas uma avaliação qualitativa, mas também quantitativa, do estado das células infectadas, que utilizamos para avaliar a eficácia da terapia antiviral com aciclovir (AC). Assim, 80 pacientes com herpes genital simples (HG) foram examinados usando o método PIF em dinâmica. Foi demonstrado que, se antes do tratamento com aciclovir, 88% dos pacientes apresentavam uma alta porcentagem de células infectadas (50-75% e mais) nos esfregaços, após um ciclo de aciclovir, células saudáveis foram detectadas nos esfregaços de 44% dos pacientes, em 31% dos casos, células infectadas isoladas foram observadas e em 25% dos pacientes havia até 10% de células infectadas.

Conteúdo de células infectadas em esfregaços (reação PIF) de pacientes com herpes genital tratados com aciclovir

Períodos de doença	Conteúdo percentual em esfregaços
	Células infectadas					Células normais
	Mais de 75%	50-75%	40-50%	10%	Células individuais no campo de visão
Recaída (antes do tratamento)	25%	63%	12%
	(20)	(50)	(10)
Remissão (após tratamento)				25%	31%	44%
				(20)	(25)	(35)

Utilizando o PIF e o método de hibridização por pontos há muitos anos, observou-se que os resultados do estudo coincidem em quase 100% dos casos. Vale ressaltar que, para aumentar a confiabilidade do diagnóstico de herpes, especialmente em casos de formas subclínicas e de baixa manifestação, recomenda-se o uso de 2 a 3 métodos de diagnóstico laboratorial no trabalho, especialmente ao examinar gestantes, mulheres com histórico obstétrico desfavorável e pessoas com diagnóstico ginecológico não especificado.

Assim, no diagnóstico por PCR de infecções virais e bacterianas do trato urogenital, é necessário avaliar os resultados positivos obtidos, levando em consideração a anamnese e a presença (ou ausência) de sintomas clínicos específicos da doença. Se a clamídia for detectada por PCR, existe uma alta probabilidade de infecção e as questões terapêuticas podem ser resolvidas adequadamente. Em caso de detecção de micoplasmas (ureaplasmas), que são microrganismos oportunistas, são necessários estudos culturais adicionais para confirmar o diagnóstico, ou seja, semear material do paciente em culturas de células sensíveis. Somente se forem obtidos resultados positivos na análise cultural, podemos falar em confirmação laboratorial do diagnóstico de micoplasmose. O mesmo método permitirá, se necessário, determinar a sensibilidade dos micoplasmas isolados a formas farmacêuticas frequentemente utilizadas (antibióticos, fluoroquinolonas, etc.).

A infecção simultânea com vários vírus da família Herpesviridae é possível. Frequentemente, detectamos a infecção de um paciente pelos vírus HSV-1, HSV-2 e CMV. Pacientes com manifestações clínicas e laboratoriais de SDI secundária (pacientes oncohematológicos, oncológicos e infectados pelo HIV) foram significativamente mais infectados com vários vírus herpes. Assim, foi demonstrado que distúrbios clínicos e imunológicos que progridem na infecção pelo HIV são acompanhados por um aumento no número de vírus herpes detectados pelo método de hibridização molecular. Nesse caso, o mais significativo em termos de prognóstico pode ser considerado a detecção simultânea complexa de DNA dos tipos HSV-1, CMV e HHV-6.

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