Corynebacterium

A difteria é uma doença infecciosa aguda, que afeta principalmente crianças, que se manifesta como uma intoxicação profunda do corpo pela toxina diftérica e inflamação fibrinosa característica no local de localização do patógeno. O nome da doença vem da palavra grega diphthera - pele, película, uma vez que uma película densa, branco-acinzentada, se forma no local de reprodução do patógeno.

O agente causador da difteria - Corynebacterium diphtheriae - foi descoberto pela primeira vez em 1883 por E. Klebs em secções de filme e obtido em cultura pura em 1884 por F. Leffler. Em 1888, E. Roux e A. Yersin descobriram a sua capacidade de produzir uma exotoxina, que desempenha um papel importante na etiologia e patogénese da difteria. A produção de soro antitóxico por E. Behring em 1892 e a sua utilização desde 1894 para o tratamento da difteria permitiram reduzir significativamente a mortalidade. Um ataque bem-sucedido a esta doença começou após 1923, em conexão com o desenvolvimento de um método para obter a anatoxina diftérica por G. Raion.

O agente causador da difteria pertence ao gênero Corynebacterium (classe Actinobacteria). Morfologicamente, caracteriza-se pelo fato de as células serem em forma de clava e espessadas nas extremidades (do grego coryne - clava), formarem ramificações, especialmente em culturas antigas, e conterem inclusões granulares.

O gênero Corynebacterium inclui um grande número de espécies, que são divididas em três grupos.

• Corinebactérias são parasitas de humanos e animais e patogênicas para eles.
• Corynebacteria patogênica para plantas.
• Corinebactérias não patogênicas. Muitas espécies de Corinebactérias são habitantes normais da pele, membranas mucosas da faringe, nasofaringe, olhos, trato respiratório, uretra e genitais.

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Morfologia das corinebactérias

C. diphtheriae são bastonetes imóveis, retos ou ligeiramente curvos, com 1,0 a 8,0 μm de comprimento e 0,3 a 0,8 μm de diâmetro; não formam esporos ou cápsulas. Frequentemente apresentam inchaços em uma ou ambas as extremidades e frequentemente contêm grânulos metacromáticos - grãos de volutina (polimetafosfatos), que adquirem uma coloração azul-púrpura quando corados com azul de metileno. Um método especial de coloração de Neisser foi proposto para sua detecção. Nesse caso, os bastonetes são corados de amarelo-palha e os grãos de volutina são marrom-escuros, geralmente localizados nos polos. Corynebacterium diphtheriae cora-se bem com corantes de anilina, é gram-positivo, mas em culturas antigas frequentemente fica descolorido e tem coloração negativa de acordo com Gram. É caracterizado por polimorfismo pronunciado, especialmente em culturas antigas e sob a influência de antibióticos. O conteúdo de G + C no DNA é de cerca de 60 mol %.

Propriedades bioquímicas das corinebactérias

O bacilo da difteria é um aeróbio ou anaeróbio facultativo, a temperatura ótima para crescimento é de 35-37 °C (os limites de crescimento são de 15-40 °C), o pH ótimo é de 7,6-7,8. Não é muito exigente em meios nutrientes, mas cresce melhor em meios contendo soro ou sangue. Os meios de soro coalhado Roux ou Loeffler são seletivos para bactérias da difteria, o crescimento neles aparece após 8-12 horas na forma de colônias convexas do tamanho de uma cabeça de alfinete, de cor branco-acinzentada ou creme-amarelada. Sua superfície é lisa ou ligeiramente granular, na periferia as colônias são um pouco mais transparentes do que no centro. As colônias não se fundem, como resultado da qual a cultura adquire a aparência de couro de shagreen. No caldo, o crescimento se manifesta como turbidez uniforme, ou o caldo permanece transparente, e uma película delicada se forma em sua superfície, que gradualmente engrossa, se esfarela e se deposita em flocos no fundo.

Uma característica das bactérias da difteria é seu bom crescimento em meios de cultura contendo sangue e soro, contendo concentrações de telurito de potássio que suprimem o crescimento de outros tipos de bactérias. Isso se deve ao fato de que C. diphtheriae reduz o telurito de potássio a telúrio metálico, que, depositado nas células microbianas, confere às colônias uma coloração cinza-escura ou preta característica. O uso desses meios aumenta a porcentagem de disseminação de bactérias da difteria.

Corynebacterium diphtheriae fermenta glicose, maltose e galactose com formação de ácido sem gás, mas não fermenta (em geral) sacarose, possui cistinase, não possui urease e não forma indol. Essas características o diferenciam das bactérias corineformes (difteroides) mais frequentemente encontradas na mucosa ocular (Corynebacterium xerosus) e nasofaríngea (Corynebacterium pseiidodiphtheriticum), bem como de outros difteroides.

Na natureza, existem três variantes principais (biótipos) do bacilo da difteria: gravis, intermedins e mitis. Eles diferem em propriedades morfológicas, culturais, bioquímicas e outras.

A divisão das bactérias da difteria em biótipos foi feita levando em consideração as formas de difteria em pacientes com as quais são isoladas com maior frequência. O tipo gravis é mais frequentemente isolado de pacientes com uma forma grave de difteria e causa surtos em grupo. O tipo mitis causa casos mais leves e esporádicos da doença, e o tipo intermedius ocupa uma posição intermediária entre eles. Corynebacterium belfanti, anteriormente atribuído ao biótipo mitis, é isolado como um quarto biótipo independente. Sua principal diferença em relação aos biótipos gravis e mitis é a capacidade de reduzir nitratos a nitritos. As cepas de Corynebacterium belfanti têm propriedades adesivas pronunciadas, e variantes toxigênicas e não toxigênicas são encontradas entre elas.

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Estrutura antigênica das corinebactérias

Corynebacterium é muito heterogêneo e mosaico. Várias dezenas de antígenos somáticos foram encontrados em todos os três tipos de patógenos da difteria, de acordo com os quais eles são divididos em sorotipos. Na Rússia, foi adotada uma classificação sorológica, segundo a qual são distinguidos 11 sorotipos de bactérias da difteria, dos quais 7 são principais (1-7) e 4 são sorotipos adicionais, raramente encontrados (8-11). Seis sorotipos (1, 2, 3, 4, 5, 7) pertencem ao tipo gravis, e cinco (6, 8, 9, 10, 11) pertencem ao tipo mitis. Uma desvantagem do método de sorotipagem é que muitas cepas, especialmente as não toxigênicas, têm aglutinação espontânea ou poliaglutinabilidade.

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Tipagem de fagos de Corynebacterium diphtheriae

Vários esquemas de tipagem de fagos foram propostos para diferenciar bactérias diftéricas. De acordo com o esquema de M.D. Krylova, utilizando um conjunto de 9 fagos (A, B, C, D, F, G, H, I, K), é possível tipificar a maioria das cepas toxigênicas e não toxigênicas do tipo gravis. Levando em consideração a sensibilidade aos fagos especificados, bem como as propriedades culturais, antigênicas e a capacidade de sintetizar coricinas (proteínas bactericidas), M.D. Krylova identificou 3 grupos independentes de corinebactérias do tipo gravis (I-III). Cada um deles contém subgrupos de patógenos diftéricos toxigênicos e seus análogos não toxigênicos.

Resistência a Corynebacterium

O Corynebacterium diphtheriae apresenta alta resistência a baixas temperaturas, mas morre rapidamente em altas temperaturas: a 60 °C, em 15 a 20 minutos; em ebulição, após 2 a 3 minutos. Todos os desinfetantes (lisol, fenol, cloramina, etc.) na concentração usualmente utilizada o destroem em 5 a 10 minutos. No entanto, o patógeno da difteria tolera bem a secagem e pode permanecer viável por muito tempo em muco seco, saliva e partículas de poeira. Em um aerossol fino, a bactéria da difteria permanece viável por 24 a 48 horas.

Fatores de patogenicidade das corinebactérias

A patogenicidade de Corynebacterium diphtheriae é determinada pela presença de vários fatores.

Fatores de adesão, colonização e invasão

As estruturas responsáveis pela adesão não foram identificadas, mas sem elas o bacilo da difteria não seria capaz de colonizar as células. Seu papel é desempenhado por alguns componentes da parede celular do patógeno. As propriedades invasivas do patógeno estão associadas à hialuronidase, neuraminidase e protease.

Um glicolipídeo tóxico contido na parede celular do patógeno. É um 6,6'-diéster de trealose contendo ácido corinemicólico (C32H64O3) e ácido corinemicólico (C32H62O3) em proporções equimolares (trealose-6,6'-dicornemicolato). O glicolipídeo tem um efeito destrutivo nas células dos tecidos no local de reprodução do patógeno.

Exotoxina, que determina a patogenicidade do patógeno e a natureza da patogênese da doença. Variantes não toxigênicas de C. diphtheriae não causam difteria.

A exotoxina é sintetizada como um precursor inativo – uma única cadeia polipeptídica com peso molecular de 61 kD. Ela é ativada pela própria protease bacteriana, que corta o polipeptídeo em dois peptídeos ligados por ligações dissulfeto: A (peso molecular 21 kD) e B (peso molecular 39 kD). O peptídeo B desempenha uma função aceptora – reconhece o receptor, liga-se a ele e forma um canal intramembranar através do qual o peptídeo A penetra na célula e implementa a atividade biológica da toxina. O peptídeo A é uma enzima ADP-ribosiltransferase, que assegura a transferência da adenosina difosfato ribose do NAD para um dos resíduos de aminoácidos (histidina) do fator de alongamento proteico EF-2. Como resultado da modificação, o EF-2 perde sua atividade, o que leva à supressão da síntese proteica pelos ribossomos na fase de translocação. A toxina é sintetizada apenas por C. diphtheriae que carregam os genes do prófago conversor moderado em seu cromossomo. O operon que codifica a síntese da toxina é monocistrônico, consiste em 1,9 mil pares de nucleotídeos e tem um promotor toxP e 3 regiões: toxS, toxA e toxB. A região toxS codifica 25 resíduos de aminoácidos do peptídeo sinal (garante a liberação da toxina através da membrana para o espaço periplásmico da célula bacteriana), toxA - 193 resíduos de aminoácidos do peptídeo A e toxB - 342 resíduos de aminoácidos do peptídeo B da toxina. A perda do prófago pela célula ou mutações no operon tox tornam a célula ligeiramente toxigênica. Ao contrário, a lisogenização de C. diphtheriae não toxigênica pelo fago conversor as transforma em bactérias toxigênicas. Isso foi comprovado de forma inequívoca: a toxigenicidade das bactérias da difteria depende de sua lisogenização por corinefagos conversores de toxina. Os corinefagos se integram ao cromossomo das corinebactérias usando o mecanismo de recombinação sítio-específica, e cepas de bactérias da difteria podem conter dois sítios de recombinação (attB) em seus cromossomos, e os corinefagos se integram a cada um deles com a mesma frequência.

A análise genética de diversas cepas não toxigênicas de bactérias diftéricas, realizada com sondas de DNA marcadas contendo fragmentos do operon tox do corinefago, mostrou que seus cromossomos contêm sequências de DNA homólogas ao operon tox do corinefago, mas codificam polipeptídeos inativos ou estão em estado "silencioso", ou seja, inativos. Nesse sentido, surge uma questão epidemiológica muito importante: bactérias diftéricas não toxigênicas podem se transformar em toxigênicas em condições naturais (no corpo humano), semelhante ao que ocorre in vitro? A possibilidade dessa transformação de culturas não toxigênicas de corinebactérias em toxigênicas por meio da conversão fágica foi demonstrada em experimentos com porquinhos-da-índia, embriões de galinha e camundongos brancos. No entanto, ainda não foi estabelecido se isso ocorre durante o processo epidêmico natural (e, em caso afirmativo, com que frequência).

Devido ao fato de que a toxina diftérica no corpo dos pacientes tem um efeito seletivo e específico em certos sistemas (o sistema simpático-adrenal, o coração, os vasos sanguíneos e os nervos periféricos são os principais afetados), é óbvio que ela não apenas inibe a biossíntese de proteínas nas células, mas também causa outros distúrbios em seu metabolismo.

Os seguintes métodos podem ser usados para detectar a toxicidade da bactéria da difteria:

• Testes biológicos em animais. A infecção intradérmica de cobaias com um filtrado de uma cultura em caldo de bactérias da difteria causa necrose no local da injeção. Uma dose letal mínima de toxina (20-30 ng) mata uma cobaia de 250 g quando injetada por via subcutânea no 4º ou 5º dia. A manifestação mais característica da ação da toxina é a lesão das glândulas suprarrenais, que se encontram aumentadas e com hiperemia acentuada.
• Infecção de embriões de galinha. A toxina diftérica causa a morte.
• Infecção de culturas celulares. A toxina diftérica causa um efeito citopático distinto.
• Um ensaio imunoenzimático em fase sólida usando antitoxinas marcadas com peroxidase.
• Uso de uma sonda de DNA para detecção direta do operon tox no cromossomo da bactéria diftérica.

No entanto, o método mais simples e comum para determinar a toxicidade das bactérias da difteria é o sorológico - o método de precipitação em gel. Sua essência é a seguinte. Uma tira de papel de filtro estéril medindo 1,5 x 8 cm é umedecida com soro antitóxico antidifteria contendo 500 AE em 1 ml e aplicada à superfície do meio nutriente em uma placa de Petri. A placa é seca em um termostato por 15 a 20 minutos. As culturas de teste são semeadas com placas em ambos os lados do papel. Várias cepas são semeadas em uma placa, uma das quais, obviamente tóxica, serve como controle. As placas com as culturas são incubadas a 37 °C, os resultados são levados em consideração após 24 a 48 horas. Devido à contradifusão da antitoxina e da toxina no gel, uma linha de precipitação nítida é formada no local de sua interação, que se funde com a linha de precipitação da cepa toxigênica de controle. As bandas de precipitação não específicas (são formadas se, além da antitoxina, outros anticorpos antimicrobianos estiverem presentes em pequenas quantidades no soro) aparecem tardiamente, são fracamente expressas e nunca se fundem com a banda de precipitação da cepa controle.

Imunidade pós-infecciosa

Casos recorrentes, intensos, persistentes e praticamente vitalícios da doença são observados raramente – em 5 a 7% dos que já tiveram a doença. A imunidade é principalmente antitóxica por natureza, sendo os anticorpos antimicrobianos de menor importância.

O teste de Schick foi amplamente utilizado anteriormente para avaliar o nível de imunidade antidiftérica. Para esse propósito, 1/40 da toxina de cobaia em um volume de 0,2 ml foi injetado intradermicamente em crianças. Na ausência de imunidade antitóxica, vermelhidão e inchaço com um diâmetro de mais de 1 cm aparecem no local da injeção após 24-48 horas. Essa reação de Schick positiva indica uma ausência completa de antitoxina ou que seu conteúdo é inferior a 0,001 AE/ml de sangue. Uma reação de Schick negativa é observada quando o conteúdo de antitoxina no sangue é superior a 0,03 AE/ml. Se o conteúdo de antitoxina for inferior a 0,03 AE/ml, mas superior a 0,001 AE/ml, a reação de Schick pode ser positiva ou, às vezes, negativa. Além disso, a própria toxina tem uma propriedade alergênica pronunciada. Portanto, para determinar o nível de imunidade antidiftérica (conteúdo quantitativo de antitoxina), é melhor usar RPGA com um diagnóstico de eritrócitos sensibilizados com toxoide diftérico.

Epidemiologia da difteria

A única fonte de infecção é uma pessoa — uma pessoa doente, uma pessoa em recuperação ou um portador saudável da bactéria. A infecção ocorre por meio de gotículas transportadas pelo ar, poeira transportada pelo ar e por vários objetos usados por portadores doentes ou saudáveis: pratos, livros, roupas de cama, brinquedos, etc. Em caso de contaminação de produtos alimentícios (leite, cremes, etc.), a infecção é possível pela via alimentar. A excreção mais massiva do patógeno ocorre na forma aguda da doença. No entanto, pessoas com formas latentes e atípicas da doença são de maior importância epidemiológica, visto que muitas vezes não são hospitalizadas e não são detectadas imediatamente. Um paciente com difteria é infeccioso durante todo o período da doença e parte do período de recuperação. O período médio de transporte da bactéria em pessoas em recuperação varia de 2 a 7 semanas, mas pode durar até 3 meses.

Portadores saudáveis desempenham um papel especial na epidemiologia da difteria. Em condições de morbidade esporádica, são os principais disseminadores da difteria, contribuindo para a preservação do patógeno na natureza. A duração média do transporte de cepas toxigênicas é um pouco menor (cerca de 2 meses) do que a de cepas não toxigênicas (cerca de 2 a 3 meses).

A razão para a formação de portadores saudáveis de bactérias diftéricas toxigênicas e não toxigênicas não foi totalmente esclarecida, visto que mesmo um alto nível de imunidade antitóxica nem sempre garante a completa libertação do organismo do patógeno. Talvez o nível de imunidade antibacteriana tenha certa importância. De importância epidemiológica primária é o portador de cepas toxigênicas de bactérias diftéricas.

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Sintomas da difteria

Pessoas de qualquer idade são suscetíveis à difteria. O patógeno pode penetrar no corpo humano através das membranas mucosas de vários órgãos ou através da pele lesionada. Dependendo da localização do processo, distinguem-se a difteria da faringe, nariz, laringe, ouvido, olho, genitais e pele. Formas mistas são possíveis, por exemplo, difteria da faringe e pele, etc. O período de incubação é de 2 a 10 dias. Na forma clinicamente expressa de difteria, desenvolve-se uma inflamação fibrinosa característica da membrana mucosa no local de localização do patógeno. A toxina produzida pelo patógeno afeta primeiro as células epiteliais e, em seguida, os vasos sanguíneos próximos, aumentando sua permeabilidade. O exsudato expelido contém fibrinogênio, cuja coagulação leva à formação de uma película branco-acinzentada na superfície da membrana mucosa, que se funde firmemente com o tecido subjacente e, quando rompida, causa sangramento. A consequência da lesão dos vasos sanguíneos pode ser o desenvolvimento de edema local. A difteria da faringe é especialmente perigosa, pois pode causar crupe diftérico devido ao edema da membrana mucosa da laringe e das cordas vocais, do qual 50 a 60% das crianças com difteria costumavam morrer por asfixia. A toxina diftérica, ao entrar na corrente sanguínea, causa intoxicação geral profunda. Afeta principalmente os sistemas cardiovascular, simpático-adrenal e nervos periféricos. Assim, os sintomas da difteria consistem em uma combinação de sinais locais, dependendo da localização da porta de entrada, e sintomas gerais causados pelo envenenamento com a toxina e manifestados na forma de adinamia, letargia, pele pálida, pressão arterial baixa, miocardite, paralisia dos nervos periféricos e outros distúrbios. A difteria em crianças vacinadas, se observada, geralmente progride de forma leve e sem complicações. A taxa de mortalidade no período anterior ao uso de soroterapia e antibióticos era de 50 a 60%, agora é de 3 a 6%.

Diagnóstico laboratorial da difteria

O único método de diagnóstico microbiológico da difteria é o bacteriológico, com testes obrigatórios de toxicidade da cultura isolada de corinebactérias. Os estudos bacteriológicos para difteria são realizados em três casos:

• para o diagnóstico de difteria em crianças e adultos com processos inflamatórios agudos na faringe, nariz e nasofaringe;
• de acordo com as indicações epidemiológicas de pessoas que estiveram em contato com a fonte do patógeno da difteria;
• pessoas recém-admitidas em orfanatos, creches, internatos e outras instituições especiais para crianças e adultos, a fim de identificar possíveis portadores do bacilo da difteria entre elas.

O material para o estudo é muco da faringe e nariz, película das amígdalas ou outras membranas mucosas, que são o ponto de entrada para o patógeno. A semeadura é feita em soro telurito ou meio sanguíneo e simultaneamente em meio de soro coagulado Roux (soro coagulado de cavalo) ou Loeffler (3 partes de soro bovino + 1 parte de caldo de açúcar), nos quais o crescimento de corinebactérias aparece após 8-12 horas. A cultura isolada é identificada por uma combinação de propriedades morfológicas, culturais e bioquímicas, usando métodos de sorotipagem e fagotipagem sempre que possível. Em todos os casos, um teste de toxicidade usando um dos métodos acima é obrigatório. As características morfológicas das corinebactérias são melhor estudadas usando três métodos de coloração de uma preparação de esfregaço: Gram, Neisser e azul de metileno (ou azul de toluidina).

Tratamento da difteria

Um tratamento específico para a difteria é o uso de soro antitóxico antidiftérico contendo pelo menos 2.000 UI por 1 ml. O soro é administrado por via intramuscular em doses de 10.000 a 400.000 UI, dependendo da gravidade da doença. Um método de tratamento eficaz é o uso de antibióticos (penicilinas, tetraciclinas, eritromicina, etc.) e sulfonamidas. Para estimular a produção de suas próprias antitoxinas, pode-se usar anatoxina. Para eliminar a bactéria portadora, devem ser usados antibióticos aos quais a cepa de corinebactéria em questão seja altamente sensível.

Profilaxia específica da difteria

O principal método de combate à difteria é a vacinação em massa planejada da população. Para isso, são utilizadas diversas opções de vacinas, incluindo as combinadas, ou seja, aquelas que visam a criação simultânea de imunidade contra diversos patógenos. A vacina mais difundida na Rússia é a DPT. Trata-se de uma suspensão de bactérias da coqueluche adsorvidas em hidróxido de alumínio, eliminadas por formalina ou timerosal (20 bilhões em 1 ml), e contém toxoide diftérico na dose de 30 unidades floculantes e 10 unidades de toxoide tetânico ligado por 1 ml. As crianças são vacinadas a partir dos 3 meses de idade, sendo então realizadas as revacinações: a primeira após 1,5 a 2 anos, as seguintes aos 9 e 16 anos e, posteriormente, a cada 10 anos.

Graças à vacinação em massa, iniciada na URSS em 1959, a incidência de difteria no país em 1966, em comparação com 1958, foi reduzida em 45 vezes, e seu índice em 1969 era de 0,7 por 100.000 habitantes. A subsequente redução no volume de vacinações na década de 1980 teve consequências graves. Em 1993-1996, a Rússia foi assolada por uma epidemia de difteria. Adultos, principalmente aqueles que não haviam sido vacinados, e crianças adoeceram. Em 1994, quase 40 mil pacientes foram registrados. Nesse contexto, a vacinação em massa foi retomada. Durante esse período, 132 milhões de pessoas foram vacinadas, incluindo 92 milhões de adultos. Em 2000-2001, a cobertura de crianças com vacinação dentro do prazo estabelecido foi de 96% e com revacinação - 94%. Devido a isso, a incidência de difteria em 2001 diminuiu 15 vezes em comparação com 1996. No entanto, para reduzir a incidência a casos isolados, é necessário vacinar pelo menos 97-98% das crianças no primeiro ano de vida e garantir a revacinação em massa nos anos subsequentes. É improvável que a difteria seja completamente eliminada nos próximos anos devido à ampla disseminação de bactérias diftéricas toxigênicas e não toxigênicas. Também levará algum tempo para resolver esse problema.