Células estaminais hematopoiéticas do sangue do cordão umbilical

O sangue do cordão umbilical é uma boa fonte de células-tronco hematopoiéticas em termos de potencial proliferativo e capacidade de repovoamento de células hematopoiéticas. Tem sido repetidamente demonstrado que, no momento do nascimento, o sangue do cordão umbilical contém um número suficientemente grande de células progenitoras hematopoiéticas fracamente comprometidas. Alguns autores acreditam que a vantagem do transplante de células-tronco hematopoiéticas do sangue do cordão umbilical é a ausência da necessidade de procurar um doador compatível com antígenos HLA. Na opinião deles, a imaturidade do sistema imunológico do recém-nascido causa atividade funcional reduzida de células imunocompetentes e, consequentemente, menor incidência de doença enxerto versus hospedeiro grave do que no transplante de medula óssea. Ao mesmo tempo, a taxa de sobrevivência de um transplante de células do sangue do cordão umbilical não é menor do que a de células da medula óssea, mesmo no caso de se utilizar um número menor de HSCs administradas por 1 kg de peso corporal do paciente. Entretanto, em nossa opinião, as questões sobre o número ideal de células do sangue do cordão umbilical transplantadas, necessárias para o enxerto eficaz no corpo do receptor, sua compatibilidade imunológica e uma série de outros aspectos do problema do transplante de células-tronco hematopoiéticas do sangue do cordão umbilical exigem uma análise mais séria.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Obtenção de células-tronco hematopoiéticas do sangue do cordão umbilical

O procedimento para obtenção de células-tronco hematopoiéticas do sangue do cordão umbilical requer sua coleta imediatamente após o nascimento da criança e sua separação da placenta, seja ela intrauterina ou extrauterina, bem como durante uma cesariana, mas também extrauterina. Foi demonstrado que, se o tempo entre o nascimento e a separação do recém-nascido da placenta for reduzido para 30 segundos, o volume de sangue do cordão umbilical obtido aumenta em média de 25 a 40 ml. Se esse procedimento for realizado posteriormente, a mesma quantidade de sangue é perdida. Foi estabelecido que a separação precoce da criança da placenta não acarreta consequências negativas para o recém-nascido.

O Instituto Russo de Pesquisa em Hematologia e Transfusiologia desenvolveu tecnologias eficazes e de baixo custo para a obtenção de sangue do cordão umbilical tanto durante o parto normal ((70,2+25,8) ml) quanto durante a cesariana ((73,4+25,1) ml). Foi proposto um método para a separação do sangue do cordão umbilical com um rendimento suficientemente alto de células nucleadas e mononucleares - (83,1+9,6) e (83,4+14,1)%, respectivamente. Um método para a criopreservação do sangue do cordão umbilical foi aprimorado, o que garante alta preservação de células mononucleares e UFC-GM - (96,8+5,7) e (89,6+22,6)%, respectivamente. A eficiência do método de drenagem para coleta de sangue do cordão umbilical utilizando o recipiente Kompoplast-300 (Rússia) foi determinada. Os autores coletaram sangue do cordão umbilical imediatamente após o nascimento da criança e sua separação da placenta, em condições de colocação da placenta no útero ou fora do útero. Antes da punção da veia umbilical, o cordão umbilical foi tratado uma vez com tintura de iodo a 5% e, em seguida, duas vezes com álcool etílico a 70%. O sangue fluiu espontaneamente através dos tubos de conexão para o recipiente. O procedimento de coleta não levou mais de 10 minutos. O volume médio de 66 amostras de sangue do cordão coletadas por drenagem foi de (72 + 28) ml, e o número de leucócitos no volume total médio da amostra foi de (1,1 + 0,6) x 107. Ao analisar o sangue do cordão para esterilidade (contaminação bacteriana, HIV-1, vírus da hepatite B e C, sífilis e infecção por citomegalovírus), anticorpos IgG para o vírus da hepatite C foram detectados em apenas uma amostra. Em outro estudo, a placenta foi colocada com a superfície fetal voltada para baixo em uma estrutura especial imediatamente após o nascimento, o cordão umbilical foi tratado com solução de iodo a 5% e álcool etílico a 75%. A veia umbilical foi drenada usando uma agulha de um sistema de transfusão (G16). O sangue fluiu para o recipiente espontaneamente. O volume médio de sangue coletado dessa maneira foi de (55 + 25) ml. No trabalho de G. Kogler et al. (1996), o sangue do cordão umbilical foi coletado usando um método fechado e grandes volumes de sangue foram obtidos - em média (79 + 26) ml. Os autores observam que, entre 574 amostras de sangue do cordão umbilical, cerca de 7% continham menos de 40 ml de sangue, o que não permite que sejam usadas para transplante. K. Isoyama et al. (1996), coletando sangue do cordão umbilical por exfusão ativa usando seringas, obtiveram uma média de 69,1 ml de sangue (o volume de sangue do cordão umbilical variou de 15 a 135 ml). Finalmente, A. Abdel-Mageed PI et al. (1997) conseguiram obter uma média de 94 ml de sangue do cordão umbilical (de 56 a 143 ml) através de cateterização da veia umbilical.

Para reduzir o risco de infecção iatrogênica e contaminação com secreções maternas, um sistema fechado de coleta de sangue foi desenvolvido com base no sistema de transfusão amplamente utilizado da Baxter Healthcare Corp., Deerfield, IL (EUA), contendo 62,5 ml de CPDA (citrato-fosfato-dextrose com adenina) como anticoagulante. A tecnologia de obtenção do material é de fundamental importância para a preparação de uma amostra de alta qualidade em termos de volume, conteúdo e pureza da suspensão celular. Dos métodos existentes para coleta de sangue do cordão umbilical, que são convencionalmente classificados em sistemas fechados, semiabertos e abertos, deve-se dar preferência ao primeiro, uma vez que o sistema fechado reduz significativamente o risco de contaminação microbiana do material, bem como a contaminação da suspensão celular com células maternas.

A. Nagler et al. (1998) conduziram uma análise comparativa da eficiência de todos os três sistemas para coleta de sangue do cordão umbilical. Na primeira variante, o procedimento foi realizado em um sistema fechado, esfoliando o sangue diretamente em um recipiente. Na segunda variante, o sangue do cordão umbilical foi obtido por exfusão ativa de sangue com uma seringa MP1, seguida de lavagem das veias placentárias e drenagem simultânea de sangue para um recipiente (método aberto). Na terceira variante, o sangue foi coletado em um sistema semiaberto, extraindo-o ativamente com seringas e lavando-o através da artéria umbilical com exfusão simultânea para um recipiente. Na primeira variante, os autores obtiveram sangue do cordão umbilical em um volume de (76,4 + 32,1) ml com um conteúdo de leucócitos de (10,5 + 3,6) x 10 ⁶ em 1 ml de sangue. Na segunda variante, os indicadores correspondentes foram (174,4 + 42,8) ml e (8,8 + 3,4) x 10 ⁶ /ml; no terceiro - (173,7 + 41,3) ml e (9,3 + 3,8) x 106 ^/ ml. A infecção mais frequente em amostras de sangue do cordão umbilical foi observada ao utilizar um sistema aberto. Foi estabelecida uma correlação direta entre a massa da placenta e o volume de sangue extraído - com o aumento da massa da placenta, a quantidade de sangue coletado aumenta.

Após a coleta do sangue do cordão umbilical, segue-se a etapa de separação: isolamento das células mononucleares e purificação da suspensão celular dos eritrócitos. Em condições experimentais, as células nucleadas são isoladas por sedimentação com metilcelulose durante a lise dos eritrócitos com cloreto de amônio. No entanto, a metilcelulose não deve ser utilizada para fins clínicos, uma vez que as perdas de células-tronco hematopoiéticas nela presentes chegam a 50-90%. A lise de eritrócitos também quase nunca é realizada na clínica devido aos grandes volumes da solução de trabalho, embora a porcentagem de isolamento de células nucleadas com o fenótipo CD34+, bem como de células progenitoras com as funções CFU-GM e CFU-GEMM, seja significativamente maior. Relata-se o surgimento de um novo meio para isolar células mononucleares em gradiente de densidade, a solução de densidade buyant (BDS72). Esta substância apresenta os seguintes parâmetros fisiológicos: pH 7,4, osmolalidade 280 mOsm/kg, densidade 1,0720 g/ml. Segundo os autores, o BDS72 pode ser usado para isolar até 100% das células CD34 positivas e remover 98% dos eritrócitos. No entanto, o BDS72 ainda não é utilizado na clínica.

Nos métodos aprovados para isolamento de células nucleadas do sangue do cordão umbilical, geralmente são utilizadas uma solução de hidroxietilamido a 10% ou uma solução de gelatina a 3%. A eficiência da sedimentação de eritrócitos e do isolamento de células nucleadas é aproximadamente igual em ambos os casos. No entanto, quando se utiliza gelatina como agente de sedimentação, é possível obter uma quantidade ligeiramente maior de UFC-GM do que com o hidroxietilamido. Supõe-se que as diferenças na eficiência do isolamento de UFC-GM se devam às diferentes taxas de sedimentação de frações individuais de células nucleadas ou à capacidade das moléculas de hidroxietilamido de serem absorvidas na superfície dos receptores de células hematopoiéticas, bloqueando assim sua sensibilidade aos fatores estimuladores de colônias utilizados no cultivo de UFC-GM in vitro. No entanto, ambos os sedimentadores podem ser adequados para o isolamento de células nucleadas na criação de bancos de sangue de cordão umbilical em larga escala.

Os métodos de separação e criopreservação do sangue do cordão umbilical basicamente não diferem daqueles utilizados no trabalho com células-tronco hematopoiéticas de sangue periférico e medula óssea de doadores adultos. No entanto, ao preparar um grande número de amostras de sangue do cordão umbilical para seus bancos, os métodos de separação devem, antes de tudo, ser de baixo custo. Portanto, infelizmente, atualmente, para necessidades clínicas, são utilizados métodos de rotina já testados de isolamento e criopreservação de células do sangue do cordão umbilical, e métodos mais eficazes, porém caros, continuam sendo o destino dos experimentadores.

Em geral, foram aprovados critérios para avaliação do número de células hematopoiéticas e requisitos para o exame de amostras de sangue do cordão umbilical para identificação de agentes infecciosos. Para garantir a segurança do transplante de células hematopoiéticas do sangue do cordão umbilical, todas as amostras de sangue devem ser examinadas principalmente para infecções transmitidas por via hematogênica e doenças genéticas. Vários autores recomendam métodos especiais adicionais para o exame do sangue do cordão umbilical para diagnosticar doenças genéticas, como alfa-talassemia, anemia falciforme, deficiência de adenosina desaminase, agamaglobulinemia de Bruton, doenças de Hurler e de Ponter.

De acordo com as recomendações de L. Ticheli e coautores (1998), cada amostra de sangue de cordão umbilical deve ser testada para células nucleadas, células CD34 positivas e UFC-GM, a tipagem HLA deve ser realizada e o grupo sanguíneo deve ser determinado de acordo com ABO e seu fator Rh. Além disso, cultura bacteriológica, testes sorológicos para infecção por HIV e citomegalovírus, HBsAg, hepatite viral C, HTLY-I e HTLV-II (leucemia de células T humanas), sífilis e toxoplasmose devem ser realizados. A reação em cadeia da polimerase para infecção por citomegalovírus e HIV é obrigatória.

O procedimento para obtenção de sangue do cordão umbilical deve ser realizado em estrita conformidade com os princípios da bioética médica. Antes da coleta de sangue, é necessário obter o consentimento da gestante para sua realização. Uma conversa preliminar com a gestante para obter o consentimento informado para todas as manipulações, desde a exfusão de sangue até o preenchimento da documentação, é realizada apenas por profissionais de saúde. Em nenhum caso é permitido que qualquer um desses procedimentos seja realizado por pessoal com formação biológica, química, farmacêutica ou outra formação não médica, devido à violação das normas estabelecidas de bioética e direitos humanos. Em caso de testes positivos para portador de HBsAg, presença de anticorpos para os patógenos da hepatite C, infecção pelo HIV e sífilis, o sangue do cordão umbilical não é coletado, e amostras de sangue já coletadas são rejeitadas e destruídas. Deve-se notar que o portador de infecções latentes em recém-nascidos é muito menos comum do que em adultos; portanto, a probabilidade de transferência hematogênica e desenvolvimento de complicações infecciosas durante infusões de células hematopoiéticas do sangue do cordão umbilical é significativamente menor do que no caso do uso de medula óssea de doador adulto para transplante.

Um aspecto importante do uso clínico do sangue de cordão umbilical é a avaliação de transplantes, que se baseia na determinação da quantidade de células-tronco hematopoiéticas em uma amostra de sangue de cordão umbilical e das doses de células necessárias para o transplante. Atualmente, ainda não foram desenvolvidos padrões para a quantidade ideal de células do sangue de cordão umbilical necessárias para o transplante. Não há um ponto de vista universalmente aceito, mesmo sobre parâmetros de rotina como o número de células CD34 positivas e UFC-GM. Alguns autores avaliam o potencial das células hematopoiéticas analisando culturas de longo prazo com determinação do conteúdo de unidades formadoras de colônias comuns a granulócitos, eritrócitos, monócitos e megacariócitos - UFC-GEMM.

Entretanto, em um ambiente clínico, a avaliação padrão de um transplante de sangue de cordão umbilical normalmente envolve apenas a determinação do número de células nucleadas ou mononucleares.

Armazenamento de células-tronco hematopoiéticas do sangue do cordão umbilical

Existem também alguns problemas na tecnologia de armazenamento de células hematopoiéticas do sangue do cordão umbilical. Ao criopreservar células-tronco hematopoiéticas, para atingir o modo de congelamento ideal, é necessário reduzir o volume de sangue do cordão umbilical o máximo possível e também remover os eritrócitos previamente para evitar hemólise e o risco de desenvolver uma reação de incompatibilidade para antígenos eritrocitários (ABO, Rh). Vários métodos de isolamento de células nucleadas são adequados para esses fins. No início da década de 90 do século passado, o método mais utilizado era o isolamento de células nucleadas em gradiente de densidade baseado em Ficoll com densidade de 1,077 g/ml ou Percoll com densidade de 1,080 g/ml. A separação do sangue do cordão umbilical em gradiente de densidade permite o isolamento de células predominantemente mononucleares, mas leva a perdas significativas de células progenitoras hematopoiéticas – até 30-50%.

A eficiência de sedimentação do hidroxietilamido no processo de isolamento de células hematopoiéticas do sangue de cordão umbilical é avaliada de diferentes maneiras. Alguns autores apontam para a baixa qualidade da separação por esse método, enquanto outros pesquisadores, ao contrário, dentre todos os métodos possíveis, preferem isolar células-tronco hematopoiéticas (CTH) do sangue de cordão umbilical com uma solução de hidroxietilamido a 6%. Ao mesmo tempo, destaca-se a alta eficiência da sedimentação de células hematopoiéticas, que, segundo alguns dados, varia de 84% a 90%.

Os proponentes de um ponto de vista diferente acreditam que praticamente todos os métodos de fracionamento estão associados a grandes perdas de células nucleadas e propõem realizar a separação por centrifugação, dividindo o sangue do cordão umbilical em 3 frações: eritrócitos, anel leucocitário e plasma. Ao isolar as células dessa maneira, os autores descobriram que o conteúdo de células mononucleares, células progenitoras hematopoiéticas precoces e células com o imunofenótipo CD34+ chegou a 90, 88 e 100% do nível inicial, respectivamente. Valores semelhantes para o aumento de células do sangue do cordão umbilical purificadas por esse método também foram obtidos por outros pesquisadores: após a sedimentação, 92% das células nucleadas, 98% das células mononucleares, 96% das células CD34 positivas e 106% das unidades formadoras de colônias foram isoladas.

No final da década de 1990, a gelatina era amplamente utilizada como agente de sedimentação. Na prática clínica, a gelatina tem sido usada para isolar células-tronco hematopoiéticas do sangue do cordão umbilical desde 1994. Ao utilizar uma solução de gelatina a 3%, a eficiência de isolamento de células nucleadas atinge 88-94%. O uso em larga escala da gelatina na criação de um banco de sangue do cordão umbilical confirmou suas vantagens sobre outros agentes de sedimentação. Uma análise comparativa da eficiência de todos os métodos acima para isolar células nucleadas sob as condições de seu uso sequencial em cada uma das amostras de sangue do cordão umbilical testadas provou que uma solução de gelatina a 3% é o agente de sedimentação ideal em termos de rendimento de células mononucleares com o fenótipo CD34+/CD45+, bem como em termos do número de UFC-GM e UFC-GEMM. Os métodos que utilizam um gradiente de densidade de Ficoll, bem como o uso de hidroxietilamido e metilcelulose, foram significativamente menos eficazes, com perdas de células hematopoiéticas chegando a 60%.

A expansão dos volumes de transplante de células-tronco do sangue de cordão umbilical está associada não apenas ao desenvolvimento de métodos para sua aquisição, mas também ao armazenamento. Existem muitos problemas diretamente relacionados à preparação do sangue de cordão umbilical para armazenamento de longo prazo e à escolha da tecnologia ideal para a criopreservação de suas amostras. Entre eles estão as questões da viabilidade de realizar procedimentos de separação, usar vários meios de criopreservação e aplicar métodos para preparar células descongeladas para transplante. O transporte de amostras nativas de sangue de cordão umbilical é frequentemente realizado de regiões distantes dos centros hematológicos. Nesse sentido, surge o problema dos períodos de armazenamento aceitáveis para o sangue de cordão umbilical, desde o momento de sua aquisição até o início da criopreservação, o que é de particular importância na criação de bancos de sangue de cordão umbilical.

Um estudo da atividade funcional das células hematopoiéticas no sangue do cordão umbilical após armazenamento de longo prazo (até 12 anos) em nitrogênio líquido mostrou que cerca de 95% das células hematopoiéticas não perdem sua alta capacidade proliferativa durante esse período. No trabalho de S. Yurasov e coautores (1997), foi comprovado que o armazenamento do sangue do cordão umbilical à temperatura ambiente (22 °C) ou a 4 °C por 24 e 48 horas não reduz significativamente a viabilidade das células hematopoiéticas, que é de 92 e 88% do nível inicial, respectivamente. No entanto, se o período de armazenamento for estendido para três dias, o número de células nucleadas viáveis no sangue do cordão umbilical diminui significativamente. Ao mesmo tempo, outros estudos mostraram que, quando armazenado por 2 a 3 dias a 22 ou 4 °C, a viabilidade dos granulócitos maduros, em vez das células hematopoiéticas, sofre principalmente.

A viabilidade das células-tronco hematopoiéticas do sangue do cordão umbilical pode ser afetada negativamente pelos componentes dos sistemas de coleta de sangue do cordão umbilical. Uma análise do efeito de vários anticoagulantes cujo mecanismo de ação é devido à ligação de íons cálcio (ACD, EDTA, XAPD-1) em células progenitoras hematopoiéticas sob condições de armazenamento do sangue do cordão umbilical por 24 a 72 horas revelou seu efeito negativo na viabilidade de células nucleadas. Nesse sentido, os autores recomendam o uso de PBS (solução tampão fosfato) com adição de heparina nativa sem conservante na concentração de 20 U/ml, o que, em sua opinião, permite aumentar o período de armazenamento do sangue do cordão umbilical não fracionado para 72 horas e preserva a atividade funcional das unidades formadoras de colônias. No entanto, um estudo de segurança de CFU-GM e CFU-G mostrou que o tempo de armazenamento do sangue do cordão umbilical antes da criopreservação não deve exceder nove horas. Obviamente, o princípio que deve ser aplicado neste caso é que, na presença de dados conflitantes, o período mínimo de armazenamento recomendado para o sangue do cordão umbilical deve ser usado e o congelamento programado das células isoladas deve ser iniciado o mais rápido possível.

Ao congelar células-tronco hematopoiéticas do sangue de cordão umbilical, uma solução de DMSO a 10% é geralmente utilizada como crioprotetor. No entanto, além do efeito crioprotetor pronunciado, o dimetilsulfóxido nessa concentração também apresenta um efeito citotóxico direto, mesmo com exposição mínima às células hematopoiéticas do sangue de cordão umbilical. Para reduzir o efeito citotóxico do DMSO, utiliza-se temperatura de exposição zero, aumenta-se a velocidade de todas as manipulações e realizam-se múltiplas lavagens após o descongelamento das amostras de sangue de cordão umbilical.

Desde 1995, o Instituto de Hematologia e Transfusiologia da Academia de Ciências Médicas da Ucrânia vem desenvolvendo uma linha de pesquisa científica voltada para o estudo abrangente do sangue do cordão umbilical como fonte alternativa de células-tronco hematopoiéticas. Em particular, foram desenvolvidas novas tecnologias para criopreservação em baixa temperatura de células hematopoiéticas de sangue do cordão umbilical não fracionado e fracionado. A polivinilpirrolidona médica de baixo peso molecular é utilizada como crioprotetor. O método de criopreservação do sangue do cordão umbilical não fracionado baseia-se em uma tecnologia original de pré-preparação de células para congelamento e em um método de processamento especial da suspensão celular imediatamente antes do transplante.

Um dos fatores mais importantes que influenciam o nível de atividade funcional das células-tronco hematopoiéticas criopreservadas é a taxa de resfriamento da suspensão celular, especialmente durante a fase de cristalização. Uma abordagem de software para resolver o problema da velocidade e do tempo de congelamento oferece excelentes oportunidades para a criação de métodos de criopreservação simples e altamente eficazes, sem a necessidade de lavar a suspensão celular dos crioprotetores antes do transplante.

As etapas mais perigosas para a viabilidade das células durante sua preparação são as etapas de congelamento e descongelamento direto. Ao congelar células hematopoiéticas, uma parte significativa delas pode ser destruída no momento da transição do meio intercelular da fase líquida para a sólida – cristalização. Para reduzir a porcentagem de morte celular, são utilizados crioprotetores, cujos mecanismos de ação e eficácia crioprotetora são suficientemente abordados na literatura científica.

Uma direção promissora para otimizar métodos de criopreservação para células da medula óssea e do sangue do cordão umbilical é a combinação de baixas concentrações de vários crioprotetores com diferentes mecanismos de ação em uma solução, por exemplo, DMSO atuando no nível intracelular e hidroxietilamido ou albumina, que têm um efeito protetor extracelular.

Para a criopreservação de células do sangue do cordão umbilical, utiliza-se tradicionalmente uma solução de DMSO a 20%, que é vertida lentamente na suspensão celular, sob agitação mecânica constante, em banho de gelo, até que se atinja uma proporção igual (1:1) entre os volumes do crioprotetor e da suspensão celular. A concentração final de dimetilsulfóxido é de 10%. A suspensão celular é então resfriada em uma unidade criogênica programada a uma taxa de GS/min até -40 °C, após o que a taxa de resfriamento é aumentada para 10 °C/min. Após atingir -100 °C, o recipiente com a suspensão celular é colocado em nitrogênio líquido (-196 °C). Com essa técnica de criopreservação, a preservação de células mononucleares funcionalmente ativas após o descongelamento atinge 85% do nível original.

Modificações nos métodos de criopreservação visam reduzir a concentração de DMSO pela adição de hidroxietilamido (as concentrações finais de dimetilsulfóxido e hidroxietilamido são de 5% e 6%, respectivamente). Observa-se alta eficiência dessa combinação de crioprotetores ao congelar uma suspensão de células mieloides, com citoproteção não inferior à obtida com apenas uma solução de dimetilsulfóxido a 10%. O número de células nucleadas viáveis atingiu 96,7% do nível inicial, e sua atividade funcional, estimada pelo número de UFC-GM, foi de 81,8%.

Ao utilizar uma solução de dimetilsulfóxido em concentrações de 5 a 10% em combinação com 4% de hidroxietilamido (concentração final), verificou-se que a segurança das células CD34 positivas nessas faixas de dimetilsulfóxido permanece praticamente inalterada. Ao mesmo tempo, quando a concentração de dimetilsulfóxido diminui de 5 para 2,5%, observa-se morte maciça de células do sangue do cordão umbilical – o número de unidades celulares viáveis diminui de 85,4 para 12,2%. Outros autores também chegaram à conclusão de que são as soluções de dimetilsulfóxido a 5 e 10% (na versão do autor, em combinação com soro autólogo) que proporcionam citoproteção com máxima eficiência durante a criopreservação de células-tronco hematopoiéticas (HSCs) do sangue do cordão umbilical. Além disso, observa-se alta preservação de células congeladas e descongeladas sucessivamente no caso de uma combinação de 5 ou 10% de dimetilsulfóxido com uma solução de hidroxietilamido a 4%, especialmente a uma taxa de resfriamento controlada de GS/min. Em outro estudo, foi utilizada uma solução crioprotetora composta por três ingredientes: DMSO, albumina humana purificada e meio RPMI na proporção de 1:4:5, que foi adicionada à suspensão celular em igual proporção volumétrica (a concentração final de dimetilsulfóxido foi de 5%). Após descongelamento em banho-maria a uma temperatura de +4 GS, a preservação de UFC-GM ultrapassou 94%.

Alguns autores sugerem o uso de sangue de cordão umbilical não fracionado para criopreservação, uma vez que quantidades significativas de células hematopoiéticas são perdidas durante o processo de remoção de hemácias. Nessa variante, uma solução de dimetilsulfóxido a 10% é usada para proteger as células mononucleares dos efeitos nocivos da criocristalização. O congelamento é realizado a uma taxa de resfriamento constante de GS/min a -80 °C, após o qual a suspensão de células do sangue de cordão umbilical é imersa em nitrogênio líquido. Esse método de congelamento resulta na lise parcial das hemácias, de modo que as amostras de sangue não requerem fracionamento. Após o descongelamento, a suspensão de células é lavada da hemoglobina livre e do dimetilsulfóxido em uma solução de albumina humana ou no soro sanguíneo autólogo do paciente e usada para transplante.

A preservação de células progenitoras hematopoiéticas após o descongelamento do sangue de cordão umbilical não fracionado é de fato superior à do sangue de cordão umbilical fracionado. No entanto, devido à crioestabilidade de alguns eritrócitos, podem surgir sérios problemas pós-transfusionais devido à transfusão de eritrócitos ABO-incompatíveis. Além disso, o volume de sangue não fracionado armazenado aumenta significativamente. Do ponto de vista clínico, a criopreservação de células hematopoiéticas do sangue de cordão umbilical previamente isoladas e purificadas de outras frações celulares ainda é preferível.

Em particular, foi desenvolvido um método para criopreservação de células fracionadas do sangue do cordão umbilical, permitindo a remoção de eritrócitos na fase de preparação para congelamento, no qual uma solução de hidroxietilamido a 6% é utilizada como parte da solução de substituição de plasma "Stabizol". Após o descongelamento, a suspensão celular obtida desta forma está pronta para uso clínico sem manipulações adicionais.

Assim, atualmente, existem muitos métodos bastante eficazes de criopreservação de sangue do cordão umbilical. A diferença fundamental reside no fato de que as amostras de sangue são congeladas sem fracionamento ou submetidas à separação em frações celulares na fase de preparação, sendo preparadas células nucleadas sem adição de eritrócitos.

Transplante de células-tronco hematopoiéticas do sangue do cordão umbilical

No final da década de 1980 e início da década de 1990, estabeleceu-se que o sangue do cordão umbilical, que fornece suporte de vida ao feto durante a gravidez, possui alto teor de células-tronco hematopoiéticas. A relativa simplicidade da obtenção de células do sangue do cordão umbilical e a ausência de problemas éticos óbvios contribuíram para o uso de células-tronco do sangue do cordão umbilical na medicina prática. O primeiro transplante bem-sucedido de sangue do cordão umbilical para uma criança com anemia de Fanconi serviu como ponto de partida para expandir o volume de transplantes de células-tronco do sangue do cordão umbilical e criar um sistema para seu armazenamento. No sistema mundial de bancos de sangue do cordão umbilical, o maior é o New York Placental Blood Center, que está no balanço do Instituto Nacional de Saúde dos EUA. O número de amostras de sangue do cordão umbilical armazenadas neste banco está se aproximando de 20.000. O número de receptores (principalmente crianças) que passaram por um transplante bem-sucedido também está crescendo. De acordo com o Departamento de Saúde dos EUA, o período livre de recidivas da vida pós-transplante de receptores de transplante de sangue do cordão umbilical já ultrapassa 10 anos.

Isso não é surpreendente, visto que numerosos estudos sobre o potencial hematopoiético do sangue do cordão umbilical demonstraram que, em termos de quantidade e qualidade das células-tronco mais precoces, ele não só não é inferior à medula óssea de um adulto, como também a supera em alguns aspectos. O maior potencial proliferativo das células-tronco do sangue do cordão umbilical se deve às características ontogenéticas da sinalização celular, à presença de receptores para fatores de crescimento específicos nas células-tronco hematopoiéticas (HSC), à capacidade das células do sangue do cordão umbilical de produzir fatores de crescimento de forma autócrina e ao grande tamanho e comprimento dos telômeros.

Assim, as características genômicas e fenotípicas das células-tronco hematopoiéticas do sangue do cordão umbilical predeterminam o enxerto de alta qualidade do transplante, com alto potencial de restauração da hematopoiese do doador no corpo do receptor.

Benefícios das células-tronco hematopoiéticas do sangue do cordão umbilical

Entre as vantagens reais do uso de células-tronco hematopoiéticas do sangue do cordão umbilical para transplante em comparação a outras fontes de células hematopoiéticas, vale destacar o risco praticamente nulo à saúde do doador (se não considerarmos a placenta como tal) e a ausência da necessidade de anestesia geral. O uso do sangue do cordão umbilical amplia as possibilidades de transplante celular devido à compatibilidade parcial do HLA (incompatibilidade de um a três antígenos). Foi desenvolvido um método para armazenamento a longo prazo de células hematopoiéticas do sangue do cordão umbilical em estado congelado, o que aumenta a probabilidade de obtenção de tipos raros de HLA e reduz o tempo de busca por um transplante compatível com HLA para transplante alogênico. Ao mesmo tempo, o risco de desenvolver certas infecções latentes transmitidas por vias transmissíveis é significativamente reduzido. Além disso, surge uma forma barata de seguro de vida biológico devido à possibilidade de usar células do sangue do cordão umbilical para transplante autólogo.

Entretanto, devido aos pequenos volumes de sangue que podem ser coletados da placenta (em média não mais que 100 ml), o problema de obter a maior quantidade possível de sangue da veia do cordão umbilical vem à tona, observando rigorosamente a condição de risco mínimo de contaminação bacteriana das amostras de sangue do cordão umbilical obtidas.

As células hematopoiéticas primitivas do sangue do cordão umbilical são geralmente identificadas pela presença da glicofosfoproteína CD34 em sua superfície, bem como com base em suas propriedades funcionais, estudando a clonogenicidade ou a formação de colônias in vitro. A análise comparativa mostrou que no sangue do cordão umbilical e na medula óssea o conteúdo máximo de células CD34 positivas na fração mononuclear é de 1,6 e 5,0%, respectivamente, o nível máximo de unidades formadoras de colônias na subpopulação de células CD34+ é de 80 e 25%, a eficiência total de clonagem de células CD34+ é de 88 e 58%, o conteúdo máximo de células formadoras de colônias com alto potencial de proliferação (HPP-CFC na população CD34+) é de 50 e 6,5%. Deve-se acrescentar que a eficiência da clonagem de células CD34+CD38 e a capacidade de responder à estimulação de citocinas também são maiores em células-tronco hematopoiéticas do sangue do cordão umbilical.

A combinação dos antígenos fenotípicos Thy-1, CD34 e CD45RA confirma o alto potencial proliferativo das células hematopoiéticas do sangue do cordão umbilical, e a expressão desses três antígenos na superfície das células do sangue do cordão umbilical indica seu pertencimento a células-tronco. Além disso, verificou-se que o sangue do cordão umbilical contém células com o fenótipo CD34+ que não possuem marcadores de diferenciação linear. O nível de subpopulações celulares com o perfil fenotípico CD34+/Lin no sangue do cordão umbilical é de cerca de 1% do número total de células CD34-positivas. As células progenitoras hematopoiéticas do sangue do cordão umbilical dão origem tanto à linhagem celular linfoide quanto à série mieloide pluripotente de diferenciação celular linear, o que também indica seu pertencimento a células-tronco.

Como já mencionado, diferenças significativas entre a medula óssea e o sangue do cordão umbilical estão na quantidade de células hematopoiéticas utilizadas para transplante obtidas durante um procedimento de coleta. Se durante o transplante de medula óssea a perda de massa celular durante a separação, criopreservação, descongelamento e teste for aceitável dentro de 40-50%, então para o sangue do cordão umbilical tais perdas celulares são muito significativas, uma vez que se uma quantidade insuficiente de HSC for usada, o transplante pode se mostrar ineficaz. De acordo com G. Kogler et al. (1998), para transplante de células com peso corporal de um receptor de 10 kg, todas as amostras de sangue do cordão umbilical podem ser potenciais transplantes (o número total de amostras de sangue do cordão umbilical coletadas é 2098), com um peso corporal de 35 kg - 67%, e apenas 25% das amostras podem fornecer transplante eficaz em pacientes com um peso corporal de 50-70 kg. Esta situação clínica indica a necessidade de otimizar e melhorar a eficiência dos métodos existentes de coleta, reprodução e armazenamento de células do sangue do cordão umbilical. Portanto, a literatura atualmente discute amplamente as questões de padronização de métodos de coleta, teste, separação e criopreservação do sangue do cordão umbilical para criação de bancos de sangue, sua utilização na clínica e também estipula as condições e termos de armazenamento de células-tronco hematopoiéticas do sangue do cordão umbilical.

[ 7 ], [ 8 ], [ 9 ]

Uso de células-tronco hematopoiéticas do sangue do cordão umbilical na medicina

^{Geralmente, é possível isolar até 10 6} células-tronco hematopoiéticas do sangue do cordão umbilical, raramente mais. Nesse sentido, a questão de saber se tal quantidade de células hematopoiéticas do sangue do cordão umbilical é suficiente para restaurar a hematopoiese em um receptor adulto permanece em aberto até hoje. As opiniões sobre o assunto estão divididas. Alguns pesquisadores acreditam que tal quantidade é suficiente para transplante em crianças, mas insuficiente para transplante em um adulto, para quem a quantidade ideal é a introdução de (7-10) x 10 ⁶ células CD34 positivas por 1 kg de peso corporal - uma média de 7 x 10 ⁸ por transplante. A partir desses cálculos, conclui-se que uma amostra de sangue do cordão umbilical contém 700 vezes menos células-tronco hematopoiéticas do que o necessário para um transplante em um paciente adulto. No entanto, tal avaliação quantitativa é feita por analogia com o número de células da medula óssea transfundidas e não leva em consideração as características ontogenéticas da hematopoiese.

Em particular, ignora-se o maior potencial proliferativo das células-tronco hematopoiéticas do sangue do cordão umbilical em comparação com as células progenitoras hematopoiéticas da medula óssea. Os resultados de estudos in vitro sobre o potencial de formação de colônias sugerem que uma dose de sangue do cordão umbilical é capaz de reconstituir a hematopoiese do receptor adulto. Por outro lado, não se deve esquecer que o número de células-tronco do sangue do cordão umbilical diminui mesmo durante o desenvolvimento embrionário: o conteúdo de células CD34 positivas no sangue do cordão umbilical diminui linearmente em 5 vezes no período de 20 semanas (o sangue para o estudo foi obtido durante a interrupção prematura da gravidez) a 40 semanas de gestação (período do trabalho de parto fisiológico), o que é acompanhado por uma expressão paralela e permanentemente crescente de marcadores lineares de citodiferenciação.

Devido à falta de uma abordagem padronizada para a determinação quantitativa de células progenitoras em amostras de sangue de cordão umbilical, o debate sobre a dose ideal de células-tronco hematopoiéticas do sangue de cordão umbilical continua. Alguns pesquisadores acreditam que o número de células nucleadas e células mononucleares recalculado para o peso corporal do receptor, ou seja, sua dose, pode ser usado como critério para selecionar amostras de sangue de cordão umbilical. Alguns autores acreditam que o limite quantitativo mínimo de células CD34+, mesmo para autotransplante de HSCs, é de 2 x 106 ^/ kg. Ao mesmo tempo, um aumento na dose de células hematopoiéticas para 5 x 106 ^células /kg (apenas 2,5 vezes) já garante um curso mais favorável do período pós-transplante inicial, reduz a incidência de complicações infecciosas e encurta a duração da antibioticoterapia preventiva.

De acordo com E. Gluckman et al. (1998), em oncohematologia a condição para o transplante bem-sucedido de células do sangue do cordão umbilical é a introdução de pelo menos 3,7 x 10 ⁷ células nucleadas por 1 kg de peso corporal do receptor. Quando a dose de células-tronco hematopoiéticas é reduzida para 1 x 10 ⁷ ou menos células nucleadas por 1 kg de peso corporal do paciente, o risco de falha do transplante e recidiva de câncer no sangue aumenta drasticamente. Deve-se reconhecer que o número mínimo de células progenitoras necessárias para a rápida restauração da hematopoiese após o alotransplante de HSCs ainda é desconhecido. Teoricamente, isso pode ser alcançado usando uma célula, mas na prática clínica do transplante de medula óssea, o enxerto rápido e estável é garantido pela transfusão de pelo menos (1-3) x 10 ⁸ células nucleadas por 1 kg de peso corporal do paciente.

Um estudo detalhado recente para determinar o número ideal de HSCs em oncohematologia incluiu a observação de pacientes em três grupos, alocados dependendo do conteúdo de células CD34 positivas no material transplantado. Os pacientes do primeiro grupo receberam (3-5) x 10 ⁶ células/kg. A dose de HSC em pacientes do segundo grupo foi de (5-10) x 10 ⁶ células/kg, e os pacientes do terceiro grupo foram transplantados com mais de 10 x 10 ⁶ células CD34+/kg. Os melhores resultados foram observados no grupo de receptores que receberam um transplante com o número de células CD34 positivas igual a (3-5) x 10 ⁶ /kg. Com um aumento na dose de células transplantadas acima de 5 x 10 ⁶ /kg, vantagens estatisticamente significativas não foram reveladas. Neste caso, um teor muito alto de HSCs no transplante (> 10 x 106 ^/ kg) está associado à reinfusão de um número significativo de células tumorais residuais, o que leva à recidiva da doença. Não foi estabelecida uma relação direta entre o número de células progenitoras alogênicas transplantadas e o desenvolvimento da reação enxerto versus hospedeiro.

A experiência mundial acumulada em transplantes de sangue de cordão umbilical confirma seu alto potencial de repovoamento. A taxa de enxerto do transplante de sangue de cordão umbilical correlaciona-se com o número de células nucleadas introduzidas. Os melhores resultados são observados com o transplante de 3 x 10⁻¹⁶ ^/ kg, enquanto para a medula óssea essa dose é de 2 x 10⁻² ^/ kg. De acordo com dados dos centros coordenadores, no final de 2000, 1.200 transplantes de células do sangue de cordão umbilical foram realizados em todo o mundo, principalmente de doadores aparentados (83%). É óbvio que o sangue de cordão umbilical deve ser considerado uma alternativa à medula óssea para transplante em pacientes com hemoblastose.

Ao mesmo tempo, a natureza neonatal da fonte de tecido hematopoiético do cordão umbilical inspira otimismo devido à presença de características funcionais de suas células-tronco hematopoiéticas (HSC). Além disso, somente a experiência clínica pode responder à questão da suficiência de uma única amostra de sangue do cordão umbilical para restaurar a hematopoiese em um receptor adulto com aplasia hematopoiética. O transplante de células do sangue do cordão umbilical é utilizado em programas de tratamento para diversas doenças tumorais e não tumorais: leucemia e síndromes mielodisplásicas, linfoma não Hodgkin e neuroblastoma, anemia aplástica, anemias congênitas de Fanconi e Diamond-Blackfan, deficiência de adesão leucocitária, síndrome de Barr, doença de Gunther, síndrome de Hurler e talassemia.

Aspectos imunológicos do transplante de células hematopoiéticas do sangue de cordão umbilical merecem atenção especial e um estudo à parte. Foi demonstrado que, no caso de transplante de células-tronco do sangue de cordão umbilical de doadores com compatibilidade HLA incompleta, os resultados do transplante são bastante satisfatórios, o que, segundo os autores, indica uma menor imunorreatividade das células do sangue de cordão umbilical em comparação com a medula óssea.

Um estudo detalhado da composição celular do sangue do cordão umbilical revelou as características tanto do espectro fenotípico das células efetoras do sistema imunológico quanto de sua atividade funcional, o que tornou possível considerar o sangue do cordão umbilical como uma fonte de HSCs com risco relativamente baixo de desenvolver uma reação "enxerto versus hospedeiro". Entre os sinais de imaturidade funcional das células imunocompetentes do sangue do cordão umbilical, é necessário observar o desequilíbrio na produção de citocinas e a diminuição da sensibilidade à regulação da resposta imune por citocinas. A inibição resultante da atividade de linfócitos citotóxicos é considerada um fator que contribui para a formação de tolerância imunológica ao tecido hematopoiético transplantado. Na população de linfócitos do sangue do cordão umbilical, em contraste com o sangue periférico e a medula óssea de doadores adultos, predominam linfócitos inativos e imaturos e células supressoras. Isso indica uma prontidão reduzida dos linfócitos T do sangue do cordão umbilical para uma resposta imune. Uma característica importante da população monocítica de células do sangue do cordão umbilical é o baixo conteúdo de células apresentadoras de antígenos ativas e funcionalmente desenvolvidas.

Por um lado, a baixa maturidade das células efetoras do sistema imunológico no sangue do cordão umbilical amplia as indicações para seu uso na clínica, uma vez que essas características proporcionam uma diminuição na intensidade do conflito imunológico entre as células do doador e do receptor. Mas, por outro lado, sabe-se da existência de uma correlação entre o grau de desenvolvimento da reação "enxerto versus hospedeiro" e o efeito antitumoral do transplante, ou seja, o desenvolvimento do efeito "enxerto versus leucemia". Nesse sentido, foi realizado um estudo sobre a citotoxicidade antitumoral das células do sangue do cordão umbilical. Os resultados obtidos indicam que, apesar da resposta realmente enfraquecida das células imunocompetentes do sangue do cordão umbilical à estimulação antigênica, os linfócitos que são principalmente ativados são células assassinas naturais e células semelhantes a assassinas, que participam ativamente dos mecanismos de implementação da citotoxicidade antitumoral. Além disso, subpopulações de linfócitos com os fenótipos CD16+CD56+ e CD16"TCRa/p+ foram encontradas no sangue do cordão umbilical. Supõe-se que essas células, em sua forma ativada, implementem a reação "enxerto versus leucemia".

No Instituto de Oncologia da Academia de Ciências Médicas da Ucrânia, células hematopoiéticas criopreservadas de sangue de cordão umbilical foram administradas a pacientes com câncer com hipoplasia hematopoiética persistente devido à quimioterapia e radioterapia. Nesses pacientes, o transplante de células-tronco hematopoiéticas de sangue de cordão umbilical restaurou de forma bastante eficaz a hematopoiese deprimida, evidenciada por um aumento persistente no conteúdo de elementos figurados maduros no sangue periférico, bem como um aumento nos indicadores que caracterizam o estado da imunidade celular e humoral. A estabilidade do efeito de repopulação após o transplante de células hematopoiéticas de sangue de cordão umbilical permite a continuação da radiação e da quimioterapia sem interromper o curso do tratamento. Há informações sobre uma maior eficiência do alotransplante de células-tronco de sangue de cordão umbilical em pacientes oncohematológicos: o risco anual de recidiva de uma doença tumoral com seu uso foi de 25% versus 40% em pacientes com medula óssea alogênica transplantada.

O mecanismo de ação das células-tronco criopreservadas do sangue de cordão umbilical deve ser considerado o resultado da estimulação humoral da hematopoiese do receptor, causada pela capacidade única das células neonatais de produzir autócrinamente fatores de crescimento hematopoiéticos, bem como uma consequência do enxerto temporário de células do doador (conforme evidenciado por um aumento confiável no conteúdo de hemoglobina fetal no sangue periférico dos receptores do 7º ao 15º dia após a transfusão, em comparação com os dados iniciais). A ausência de reações pós-transfusionais em receptores de sangue de cordão umbilical é resultado da relativa tolerância de suas células imunocompetentes, bem como um critério de confiança para a adequação biológica do material criopreservado.

As células progenitoras assassinas de linfócitos T do sangue do cordão umbilical são capazes de ativação sob a influência da estimulação de citocinas exógenas, o que é usado para desenvolver novos métodos ex vivo e in vivo para induzir citotoxicidade antitumoral de elementos linfoides transplantados para imunoterapia subsequente. Além disso, a "imaturidade" do genoma das células imunocompetentes do sangue do cordão umbilical permite que elas sejam usadas para aumentar a atividade antitumoral usando métodos de modelagem molecular.

Atualmente, o sangue do cordão umbilical tem ampla aplicação, principalmente em hematologia pediátrica. Em crianças com leucemia aguda, o alotransplante de células-tronco hematopoiéticas do sangue do cordão umbilical, em comparação com o alotransplante de medula óssea, reduz significativamente a incidência da doença do enxerto contra o hospedeiro. No entanto, isso é acompanhado por um período mais longo de neutrocitopenia e trombocitopenia e, infelizmente, por uma maior taxa de mortalidade em 100 dias após o transplante. Um período mais longo de recuperação dos níveis de granulócitos e plaquetas no sangue periférico pode ser devido à diferenciação insuficiente de subpopulações individuais de células do sangue do cordão umbilical CD34 positivas, como evidenciado pelo baixo nível de absorção de rodamina radioativa e pela baixa expressão de antígenos CD38 em sua superfície.

Ao mesmo tempo, o transplante de células-tronco hematopoiéticas do sangue do cordão umbilical em pacientes adultos, realizado devido à ausência de um doador de medula óssea compatível não aparentado e à possibilidade de mobilização de células-tronco hematopoiéticas autólogas, apresentou alta sobrevida livre de recidiva em um ano no grupo de pacientes com menos de 30 anos (73%). A expansão da faixa etária dos receptores (18-46 anos) levou a uma redução na sobrevida para 53%.

A análise quantitativa de células com o fenótipo CD34+ na medula óssea e no sangue do cordão umbilical revelou seu maior conteúdo (3,5 vezes) na medula óssea, mas uma predominância significativa de células com o perfil fenotípico CD34+HLA-DR foi observada no sangue do cordão umbilical. Sabe-se que células sanguíneas com os marcadores imunológicos CD34+HLA-DR proliferam mais ativamente do que células com o imunofenótipo CD34+HLA-DR+, o que foi confirmado em estudos experimentais de crescimento de cultura de células hematopoiéticas de longo prazo in vitro. Precursores celulares primitivos com o fenótipo CD34+CD38 estão contidos tanto no sangue do cordão umbilical quanto na medula óssea, mas células sanguíneas do cordão umbilical com o conjunto de marcadores CD34+CD38 têm uma atividade clonogênica maior do que células hematopoiéticas do mesmo fenótipo isoladas da medula óssea de doadores adultos. Além disso, as células do sangue do cordão umbilical com o imunofenótipo CD34+CD38 proliferam mais rapidamente em resposta à estimulação de citocinas (IL-3, IL-6, G-CSF) e produzem 7 vezes mais colônias em culturas de longo prazo do que as células da medula óssea.

Bancos de células-tronco do sangue do cordão umbilical

Para o desenvolvimento adequado de uma nova área da medicina prática – o transplante de células-tronco do sangue de cordão umbilical –, bem como para a implementação de transplantes de células-tronco hematopoiéticas da medula óssea, é necessária uma extensa rede de bancos de sangue, já criada nos EUA e na Europa. As redes nacionais de bancos de sangue de cordão umbilical são unidas pela Netcord Bank Association. A conveniência de criar uma associação internacional de bancos de sangue de cordão umbilical é determinada pelo fato de que um grande número de amostras de sangue de cordão umbilical tipadas é necessário para realizar transplantes não relacionados, o que permite a seleção de um doador com HLA idêntico. Somente o estabelecimento de um sistema de bancos com armazenamento de amostras de sangue de vários tipos de HLA pode realmente resolver o problema de encontrar o doador necessário. A organização de tal sistema de banco de sangue de cordão umbilical requer o desenvolvimento preliminar de normas éticas e legais, que estão sendo discutidas em nível internacional.

Para criar bancos de sangue de cordão umbilical na Ucrânia, uma série de regulamentações e documentos devem ser elaborados.

Em primeiro lugar, trata-se de questões de padronização dos métodos de coleta, fracionamento e congelamento do sangue do cordão umbilical. É necessário regulamentar as regras de coleta de sangue do cordão umbilical em maternidades, de acordo com os requisitos da ética médica, para determinar o volume mínimo de sangue do cordão umbilical que garanta o sucesso do transplante. É necessário comparar e padronizar diversos critérios de avaliação da qualidade e quantidade de células progenitoras hematopoiéticas, bem como métodos de tipagem HLA e métodos de diagnóstico de doenças genéticas e infecciosas que podem ser transmitidas durante a infusão de células do sangue do cordão umbilical, a fim de estabelecer critérios comuns para a seleção de doadores saudáveis. Também vale a pena discutir a criação de instalações de armazenamento separadas para soro, células e DNA obtidos do sangue do cordão umbilical.

É absolutamente necessário organizar uma rede de computadores com dados do sangue do cordão umbilical para conectá-los aos registros de doadores de medula óssea. Para o desenvolvimento da transplantologia celular, é necessário desenvolver protocolos especiais para comparar os resultados dos transplantes de sangue do cordão umbilical e de medula óssea de parentes HLA idênticos e de doadores não aparentados. A padronização da documentação, incluindo o consentimento informado dos pais, bem como a notificação da mãe ou de parentes sobre doenças genéticas e/ou infecciosas detectadas na criança, pode ajudar a solucionar os problemas éticos e legais do uso clínico de células do sangue do cordão umbilical.

A condição definidora para o desenvolvimento da transplantologia de células na Ucrânia será a adoção do Programa Nacional de Doação de Células-Tronco e o desenvolvimento da cooperação internacional com outros países por meio da Associação Mundial de Doadores de Medula Óssea (WMDA), do Programa Nacional de Doadores de Medula Óssea dos EUA (NMDP) e outros registros.

Resumindo a ainda curta história do desenvolvimento do transplante de células-tronco hematopoiéticas do sangue de cordão umbilical, notamos que as primeiras suposições sobre a possibilidade de uso clínico do sangue de cordão umbilical, expressas no início da década de 70, foram confirmadas na década de 80 pelos resultados de estudos experimentais em animais. Em 1988, foi realizado o primeiro transplante mundial de células hematopoiéticas do sangue de cordão umbilical para um ser humano, dando início à criação de uma rede global de bancos de sangue de cordão umbilical. Em 10 anos, o número de pacientes com células hematopoiéticas do sangue de cordão umbilical transplantadas se aproximou de 800. Entre eles, havia pacientes com diversas doenças de natureza tumoral (leucemia, linfoma, tumores sólidos) e não tumoral (imunodeficiências congênitas, anemia, doenças associadas a distúrbios metabólicos).

O conteúdo de precursores celulares precoces e comprometidos no sangue do cordão umbilical é maior do que no sangue periférico de um adulto. Em termos do número de unidades formadoras de colônias de granulócitos-macrófagos e seu potencial proliferativo, o sangue do cordão umbilical excede significativamente o sangue periférico de adultos, mesmo após a introdução de fatores de crescimento. Em culturas celulares de longo prazo in vitro, observou-se maior atividade proliferativa e viabilidade das células do sangue do cordão umbilical do que das células da medula óssea. Momentos críticos no transplante de células-tronco do sangue do cordão umbilical são o número e o potencial hematopoiético das células nucleadas, a presença de infecção por citomegalovírus, a compatibilidade HLA do doador e do receptor, o peso corporal e a idade do paciente.

No entanto, o transplante de células-tronco do sangue de cordão umbilical deve ser considerado uma alternativa ao transplante de medula óssea para o tratamento de doenças hematológicas graves, principalmente em crianças. Os problemas clínicos do transplante de células do sangue de cordão umbilical estão sendo gradualmente resolvidos – já existem métodos bastante eficazes para coleta, separação e criopreservação de células do sangue de cordão umbilical, estão sendo criadas condições para a formação de bancos de sangue de cordão umbilical e os métodos para teste de células nucleadas estão sendo aprimorados. A solução de gelatina a 3% e a solução de hidroxietilamido a 6% devem ser consideradas ideais para a separação durante a obtenção em larga escala de células-tronco hematopoiéticas do sangue de cordão umbilical durante a criação de bancos.

P. Perekhrestenko e coautores (2001) observam corretamente que o transplante de células-tronco do sangue do cordão umbilical deve ocupar seu devido lugar no complexo de medidas terapêuticas para superar depressões hematopoiéticas de várias gêneses, uma vez que as células-tronco do sangue do cordão umbilical apresentam uma série de vantagens significativas, entre as quais as mais importantes são a relativa simplicidade de sua obtenção, a ausência de risco para o doador, a baixa contaminação de células neonatais com vírus e o custo comparativamente baixo do transplante. Alguns autores apontam que o transplante de células do sangue do cordão umbilical é menos frequentemente acompanhado por complicações associadas à reação enxerto versus hospedeiro do que o transplante de células da medula óssea, o que se deve, em sua opinião, à fraca expressão de antígenos HLA-DR nas células do sangue do cordão umbilical e à sua imaturidade. No entanto, a principal população de células nucleadas no sangue do cordão umbilical são os linfócitos T (células CD3 positivas), cujo conteúdo é de cerca de 50%, o que é 20% menor do que no sangue periférico de um adulto, mas as diferenças fenotípicas nas subpopulações de células T dessas fontes são insignificantes.

Entre os fatores que influenciam diretamente a taxa de sobrevivência no transplante de células-tronco do sangue de cordão umbilical, destacam-se a idade dos pacientes (os melhores resultados são observados em receptores com idade entre um e cinco anos), o diagnóstico precoce da doença e a forma de leucemia (a eficácia é significativamente maior na leucemia aguda). De grande importância são a dose de células nucleadas do sangue de cordão umbilical, bem como sua compatibilidade HLA com o receptor. Não é por acaso que a análise da eficácia clínica do transplante de células-tronco hematopoiéticas do sangue de cordão umbilical em oncohematologia mostra os melhores resultados de tratamento com transplantes relacionados: a sobrevida livre de recidiva em um ano neste caso chega a 63%, enquanto com transplantes não relacionados - apenas 29%.

Assim, a presença de um grande número de células-tronco no sangue do cordão umbilical e a alta capacidade de repopulação das células-tronco hematopoiéticas neonatais permitem que elas sejam usadas para transplante alogênico em pacientes oncohematológicos. No entanto, deve-se notar que a recapitulação da hematopoiese após o transplante de células hematopoiéticas do sangue do cordão umbilical é "esticada no tempo": a restauração do conteúdo de neutrófilos no sangue periférico é geralmente observada ao final da 6ª semana, e a trombocitopenia geralmente desaparece após 6 meses. Além disso, a imaturidade das células hematopoiéticas do sangue do cordão umbilical não exclui conflitos imunológicos: doença enxerto versus hospedeiro aguda e crônica grave é observada em 23 e 25% dos receptores, respectivamente. Recidivas de leucemia aguda ao final do primeiro ano após o transplante de células do sangue do cordão umbilical são observadas em 26% dos casos.

[ 10 ], [ 11 ]