Causas da tuberculose

A família Mycobacteriaceae, da ordem Actinomycetales, contém o gênero Mycobacterium. Em 1975, esse gênero continha cerca de 30 espécies e, em 2000, esse número já se aproximava de 100. A maioria das espécies de micobactérias é classificada como microrganismos saprofíticos, amplamente distribuídos no meio ambiente.

O grupo de parasitas obrigatórios é insignificante, mas sua importância prática é grande e é determinada pelas espécies que causam tuberculose em humanos e animais. Acredita-se que os precursores das micobactérias patogênicas para humanos tenham sido antigas micobactérias do solo.

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Taxonomia de micobactérias

Todas as micobactérias são divididas em patogênicas para humanos e oportunistas.

Na microbiologia clínica, várias abordagens são usadas para classificar micobactérias:

• pela velocidade e temperatura ótima de crescimento, capacidade de formar pigmento;
• para complexos clinicamente significativos.

As espécies de micobactérias causadoras da tuberculose são combinadas no complexo M. tuberculosis, que inclui M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum, M. microti e M. canettii. Recentemente, M. pinnipedii e M. sarrae, que são filogeneticamente relacionadas a M. microti e M. bovis, foram adicionadas a ele.

As micobactérias restantes, causadoras de diversas micobacterioses, são classificadas como micobactérias não tuberculosas. Desse grupo, destacam-se os seguintes complexos: M. avium, composto por M. avium, M. intracellulare e M. scrofulaceum; M. fortuitum, incluindo as subespécies M. fortuitum e M. chelonae; e M. terrae, incluindo M. terrae, M. triviale e M. nonchromogenicum. Os grupos mais importantes são o patógeno da hanseníase M. leprae, bem como o patógeno da lesão ulcerativa Buruli M. ulcerans.

Esta classificação reúne espécies de micobactérias com o mesmo significado clínico, quando sua diferenciação mais precisa não é essencial. Métodos biológicos, bioquímicos e moleculares são utilizados para identificar espécies dentro de grupos e complexos.

A classificação de micobactérias não tuberculosas com base em diferenças culturais foi desenvolvida por Runyon em 1959. De acordo com ela, quatro grupos de micobactérias são distinguidos.

Grupo I - micobactérias fotocromogênicas

Este grupo inclui micobactérias que não são pigmentadas quando cultivadas no escuro, mas adquirem pigmentação amarelo-vivo ou amarelo-alaranjada após a exposição à luz. Cepas potencialmente patogênicas pertencentes a este grupo são M. asiaticum, M. kansasii, M. marinum e M. simiae. Entre as micobactérias deste grupo, existem tanto as de crescimento rápido (M. marinum) quanto as de crescimento lento (M. asiaticum e M. kansasii). A temperatura ideal para crescimento varia de 25 ^° C para M. simiae, 32-33 ^° C para M. marinum e 37 ^° C para M. asiaticum.

A espécie clinicamente mais significativa em nosso país é a M. kansasii, encontrada em corpos d'água. A cepa M. kansasii (M. luciflavum) causa doenças em humanos. Cresce em meio de cultura de ovos como colônias rugosas ou lisas, com temperatura ótima de 37 ^° C. Morfologicamente, a bactéria é de comprimento moderado. Duas variantes de M. kansasii foram descritas até o momento: laranja e branca. Quando introduzida em cobaias, a M. kansasii causa infiltrados e compactação dos linfonodos regionais.

Grupo II - micobactérias escotocromogênicas (do grego scotos - escuridão)

Este grupo inclui micobactérias que produzem pigmento no escuro. A taxa de crescimento é de 30 a 60 dias. Este grupo inclui M. aquae (M. gordonae) e M. scrofulaceum.

M. scrofulaceum é considerada uma espécie potencialmente patogênica. Em meio de cultura de ovos, as bactérias desta espécie crescem como colônias lisas ou rugosas de cor alaranjada. Morfologicamente, as micobactérias são em forma de bastonete, curtas ou longas. Crescem a uma temperatura de 25 a 37 ^° C. Em crianças, causam danos aos linfonodos e pulmões.

M. aquae (M. gordonae) é classificada como micobactéria escotocromogênica saprofítica. Cresce em meio de cultura de ovos como colônias alaranjadas a uma temperatura de 25-37 °C. Morfologicamente, as micobactérias têm formato de bastonete e comprimento moderado (> 5 μm). São encontradas em corpos d'água.

Grupo III - micobactérias não fotocromogênicas

Este grupo inclui micobactérias que não formam pigmento ou apresentam uma coloração amarelo-pálida que não se intensifica na luz. Crescem por 2 a 3 ou 5 a 6 semanas. Entre elas estão: M. avium, M. intracellulare, M. xenopi, M. terrae, M. gastri, M. hattey e M. bruiiense.

M. avium (micobactéria aviária) cresce no meio Lowenstein-Jensen como colônias pigmentadas ou fracamente pigmentadas a 37 ^° C e 45 ^° C. Morfologicamente, são bastonetes de comprimento médio. Podem ser patogênicos para humanos e diversos animais de laboratório e domésticos (por exemplo, porcos). São encontrados na água e no solo.

M. xenopi é isolado de um sapo. Culturas jovens crescem como colônias despigmentadas. Posteriormente, surge um pigmento amarelo. Morfologicamente, são bastonetes longos e filiformes. Crescem a uma temperatura de 40-45 ^° C. São condicionalmente patogênicos para humanos.

M. terrae foi inicialmente isolado do rabanete. Cresce em meio Lowenstein-Jensen e como colônias livres de pigmentos. A temperatura ótima de crescimento é de 37 ^° C. Morfologicamente, são representados por bastonetes de comprimento moderado, saprófitos.

Grupo IV - micobactérias de crescimento rápido

As micobactérias pertencentes a este grupo caracterizam-se por um crescimento rápido (até 7 a 10 dias). Crescem na forma de colônias pigmentadas ou não pigmentadas, mais frequentemente na forma R. Apresentam bom crescimento por 2 a 5 dias a uma temperatura de 25 ^° C. Este grupo inclui a micobactéria potencialmente patogênica M. fortuitum, bem como micobactérias saprófitas, como M. phlei, M. smegmatis, etc. M. fortuitum apresenta crescimento visível no meio de cultura de ovos do 2º ao 4º dia, na forma de uma "roseta". Morfologicamente, as micobactérias são representadas por bastonetes curtos. No meio de cultura Lowenstein-Jensen, podem absorver o verde malaquita e tornar-se verdes. São amplamente distribuídas na natureza.

A classificação de Runyon demonstrou ser muito conveniente para identificar os tipos mais comuns de micobactérias. No entanto, a descoberta de novas espécies e o surgimento de um número crescente de formas intermediárias de micobactérias dificultam o registro delas em um ou outro grupo de Runyon.

O M. tuberculosis é uma formação evolutiva jovem. Recentemente, tem havido uma tendência a dividir o M. tuberculosis em grupos ou famílias. As cepas mais importantes são aquelas pertencentes à família Beijing, que se distinguem pelo comportamento clonal e pela capacidade de causar microsurtos de tuberculose.

Morfologia das micobactérias

As micobactérias são células finas em forma de bastonete com a propriedade característica de resistência a ácidos e álcool (em um dos estágios de crescimento), aeróbicas. Quando coradas de acordo com Gram, são fracamente gram-positivas. As micobactérias são imóveis, não formam esporos. Conídios ou cápsulas estão ausentes. Crescem em meios nutritivos densos lentamente ou muito lentamente: na temperatura ideal, colônias visíveis aparecem após 2 a 60 dias. As colônias são rosa, laranja ou amarelas, especialmente quando cultivadas na luz. O pigmento não se difunde. A superfície das colônias é geralmente fosca (tipo S) ou rugosa (tipo R). As micobactérias frequentemente crescem na forma de colônias mucosas ou enrugadas. Em meios líquidos, as micobactérias crescem na superfície. A delicada película seca engrossa com o tempo, torna-se rugosa e adquire uma tonalidade amarelada. O caldo permanece transparente e o crescimento difuso pode ser alcançado na presença de detergentes. Nas microcolônias de M. tuberculosis (ou seja, nos estágios iniciais), são formadas estruturas semelhantes a cordões - uma característica que está associada ao fator cordão.

Quando coradas com carbolfucsina, as Mycobacteria tuberculosis aparecem como bastonetes finos e ligeiramente curvados, de cor vermelho-framboesa, contendo um número variável de grânulos.

O comprimento das micobactérias é de aproximadamente 1 a 10 µm e a largura de 0,2 a 0,7 µm. Às vezes, podem ser encontradas variantes curvas ou retorcidas. Microrganismos localizados individualmente, em pares ou em grupos destacam-se bem contra o fundo azul dos outros componentes da preparação. As células bacterianas podem frequentemente ser organizadas na forma do algarismo romano "V".

A preparação também pode revelar formas alteradas do patógeno resistentes ao ácido cocoide, estruturas esféricas arredondadas ou semelhantes a micélios. Nesse caso, uma resposta positiva deve ser confirmada por métodos adicionais.

A estrutura da parede celular das micobactérias

A parede celular das micobactérias é a mais complexa em comparação com outros procariontes.

Enquanto as bactérias gram-negativas possuem duas membranas, a parede celular micobacteriana consiste em várias camadas, algumas das quais contêm açúcares e são caracterizadas por uma composição relativamente constante. As camadas externas têm uma composição química variável e são representadas principalmente por lipídios, a maioria dos quais são ácidos micólicos e seus derivados. Como regra, essas camadas não são visíveis à microscopia eletrônica. A estrutura primária da parede celular é formada por glicanos peptídicos reticulados – uma camada eletrodensa. A camada de arabinogalactana repete a camada de glicano peptídico, formando um estroma polissacarídico da parede celular. Ela possui pontos de conexão com a camada de glicano peptídico e estruturas para a fixação de ácidos micólicos e seus derivados.

Os ácidos micólicos estão presentes na forma de sulfolipídios livres e fator corda, cuja presença na superfície celular está associada à formação característica de colônias de M. tuberculosis na forma de flagelos. A singularidade e o papel fundamental dos ácidos micólicos na organização estrutural e fisiologia das micobactérias os tornam um excelente alvo para terapia etiotrópica.

A camada glicolipídica é chamada de "micosídeos" e às vezes é comparada a uma microcápsula. Os micosídeos são estrutural e funcionalmente semelhantes aos lipopolissacarídeos da membrana externa de bactérias gram-negativas, mas não apresentam a mesma agressividade; no entanto, são tóxicos e (como o fator corda e os sulfolipídios) causam a formação de granulomas.

A membrana celular e as camadas da parede celular são permeadas por canais ou poros, entre os quais podemos distinguir poros passivos com vida útil curta, proporcionando difusão controlada de substâncias, e canais com vida útil mais longa, proporcionando transporte de substâncias dependente de energia.

Outro componente da parede celular micobacteriana é a lipoarabinomanana. Ela se fixa à membrana plasmática, penetra na parede celular e se projeta em sua superfície. Nesse aspecto, é semelhante aos ácidos lipoteicoicos de bactérias gram-positivas ou ao antígeno O do lipopolissacarídeo de bactérias gram-negativas. Os fragmentos terminais da lipoarabinomanana, principalmente seus radicais manose, suprimem de forma não específica a ativação de linfócitos T e leucócitos no sangue periférico. Isso leva à interrupção da resposta imune às micobactérias.

Variabilidade e formas de existência das micobactérias

A persistência bacteriana tem um significado patogênico especial. Experimentos laboratoriais conduzidos in vitro e in vivo demonstraram que os fármacos bactericidas isoniazida e pirazinamida matam micobactérias apenas na fase de reprodução. Se as micobactérias estiverem na fase de baixa atividade metabólica (ou seja, o crescimento bacteriano está quase completamente suspenso e as bactérias podem ser chamadas de "dormentes"), os fármacos bactericidas não as afetam. Esse estado é geralmente chamado de dormência, e os microrganismos são chamados de persistentes. Os persistentes não são sensíveis a quimioterápicos, ou seja, comportam-se como microrganismos resistentes. Na verdade, podem manter a sensibilidade aos fármacos.

Um poderoso estímulo para a transição de células micobacterianas para um estado dormente são os medicamentos quimioterápicos, bem como fatores do sistema imunológico do hospedeiro. As micobactérias persistentes são capazes de permanecer nas lesões por meses ou até anos. Durante a persistência, as micobactérias podem se transformar em formas L. Nessa forma, as micobactérias exibem atividade metabólica extremamente baixa, visando principalmente o aumento da espessura da parede celular e da matriz extracelular, o que impede a difusão simples de substâncias. Além disso, as micobactérias acumulam material genético, o que aumenta a probabilidade de recriar uma célula com funcionamento normal quando ocorrem condições favoráveis. A detecção de formas L por métodos microbiológicos padrão é difícil.

Se as micobactérias dormentes recuperam a atividade metabólica e começam a se multiplicar durante a quimioterapia, elas morrem rapidamente. Se a quimioterapia for concluída, essas micobactérias "revividas" continuam a se multiplicar e causam uma recidiva da doença. Isso explica a justificativa para longos ciclos de quimioterapia e o uso subsequente de ciclos profiláticos curtos, geralmente sazonais, de quimioprofilaxia.

Fisiologia das micobactérias

No reino dos procariontes, as micobactérias são líderes indiscutíveis na síntese de compostos orgânicos complexos. Possuem provavelmente o metabolismo mais flexível, proporcionando a variabilidade necessária para a sobrevivência tanto no ambiente externo quanto no macrorganismo. Até o momento, mais de 100 reações enzimáticas foram descritas, demonstrando a natureza ramificada e complexa do metabolismo micobacteriano. Para sintetizar os compostos finais ou fornecer as funções fisiológicas necessárias às micobactérias, vias metabólicas paralelas podem ser realizadas, dependendo da disponibilidade do substrato, do ambiente químico e do fornecimento dos componentes necessários aos ciclos respiratórios (íons metálicos, pressão parcial de oxigênio, dióxido de carbono, etc.).

Propriedades bioquímicas das micobactérias

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Metabolismo lipídico

Os lipídios da parede celular, que constituem até 60% da massa seca da célula, determinam as propriedades tintoriais, fisiológicas e ecológicas não padronizadas das micobactérias.

Os lipídios específicos de micobactérias descritos até o momento são divididos em 7 grupos principais de acordo com as características estruturais:

1. derivados de ácidos graxos de carboidratos (principalmente trealose - fator cordão):
2. fosfatidil mioinositol manosídeos:
3. derivados de ácidos graxos de peptídeos;
4. Glicosídeos N-acilpeptídeos - micosídeos C;
5. ésteres de ácidos graxos de ftioceróis;
6. micosídeos A, B. G;
7. micolatos de glicerol.

Lipídios dos grupos 4-6 são encontrados apenas em micobactérias.

Entre os únicos, vale destacar os ácidos tuberculosoestárico e tuberculopalmítico, que são precursores dos ácidos micólicos.

Os ácidos micólicos são um grupo de ácidos graxos de alto peso molecular com cadeia de até 84 átomos de carbono, cuja estrutura da cadeia principal é determinada pela posição sistemática do microrganismo e pelas condições de seu crescimento. Sua baixa reatividade garante alta resistência química da parede celular das micobactérias. Os micolados suprimem a clivagem enzimática da parede celular e as reações de radicais livres.

O fator corda é classificado como um lipídio do grupo 1. Está associado à alta toxicidade de micobactérias e virulência.

Lipídios tensoativos, ou sulfolipídios, desempenham um papel importante na adaptação intracelular de micobactérias. Juntamente com o fator corda, formam complexos membranotrópicos citotóxicos.

Lipoarabinomanana é uma mistura heterogênea de lipopolissacarídeos de alto peso molecular: polímeros ramificados de arabinose e manose com derivados de diacilglicerol de ácidos palmítico e tuberculoso.

Os micosídeos C são glicolipídeos peptídicos que formam a membrana externa das micobactérias, podendo ser observados à microscopia eletrônica como uma zona transparente na periferia das células. Os micosídeos são compostos específicos de cada espécie. As propriedades antigênicas das micobactérias dependem do seu tipo.

A composição quantitativa e qualitativa dos compostos lipídicos das micobactérias é dinâmica e depende da idade das células, da composição do meio nutriente e das características físico-químicas do ambiente. Células micobacterianas jovens começam a formar uma parede celular sintetizando lipopolissacarídeos com cadeias alifáticas relativamente curtas. Nesse estágio, elas são bastante vulneráveis e acessíveis ao sistema imunológico. À medida que a parede celular cresce e lipídios de alto peso molecular são formados, as micobactérias adquirem resistência e indiferença em suas interações com o sistema imunológico.

Metabolismo de carboidratos

A fonte de carbono mais preferida para micobactérias é o glicerol.

Os carboidratos mais importantes são arabinose, manose e maltose, que constituem mais da metade de todos os sacarídeos. Além disso, trealose, glicose, frutose, galactose, ramnose e alguns outros sacarídeos desempenham um papel na atividade vital da célula. Nesse caso, a síntese ocorre ao longo das vias da hidrolase e da aldolase. A via do piruvato é usada para sintetizar glicogênio. Arabinose e manose participam da formação de compostos estruturais importantes. A via das pentoses fosfato da oxidação da glicose é usada para obter energia. Ela é fornecida pelas enzimas malato, isocitrato e succinato desidrogenases, o que confere flexibilidade ao sistema respiratório.

A via do glioxilato, que as micobactérias utilizam para incorporar ácidos graxos livres que se acumulam durante o crescimento micobacteriano no ciclo do ácido tricarboxílico, é única. Este ciclo tem atraído a atenção de pesquisadores como um possível mecanismo para a quimiotaxia micobacteriana durante a persistência.

Metabolismo de nitrogênio e aminoácidos

A taxa de utilização de nitratos, nitritos e hidroxilaminas por micobactérias pode ser usada para identificar espécies. As micobactérias preferem a asparagina como fonte de nitrogênio. A síntese de aminoácidos é um processo dependente de energia e é realizada por um grupo de enzimas que permitem a utilização de outros compostos de aminoácidos, como o glutamato.

Atividade da redutase de nitrito e nitrato

O Mycobacterium tuberculosis pode formar adenosina trifosfato (ATP) transferindo elétrons ao longo de uma cadeia de transportadores que termina em NO3 em vez de O2 _. Essas reações reduzem o NO3 _a NH3 _em quantidades necessárias para a síntese de aminoácidos, bases purínicas e pirimídicas. Isso é realizado pela ação sequencial das redutases de nitrato e nitrito.

Atividade de catalase e peroxidase

A catalase previne o acúmulo de peróxido de hidrogênio, que se forma durante a oxidação aeróbica de flavoproteínas reduzidas. A atividade da enzima depende do pH do meio e da temperatura. A uma temperatura de 56 °C, a catalase não é ativa. Existem testes para determinar se a catalase pertence ao complexo patogênico de micobactérias, com base na sua termolabilidade.

Sabe-se que 70% das cepas de Mycobacterium tuberculosis resistentes à isoniazida perdem sua atividade de catalase e peroxidase.

A atividade da peroxidase e da catalase são realizadas pelo mesmo complexo enzimático.

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Vitaminas e coenzimas

M. tuberculosis contém vitaminas do complexo B (riboflavina, piridoxina, cianocobalamina, tiamina), vitaminas C e K, ácido para-aminobenzóico, ácidos pantotênico e nicotínico, biotina e ácido fólico.

Metabolismo, nutrição e respiração de micobactérias

Em condições normais e favoráveis, as Mycobacteria tuberculosis são estritamente aeróbias e mesófilas, ou seja, crescem na presença de oxigênio e na faixa de temperatura de 30 a 42 ^° C, preferencialmente a 37 ^° C. Em condições externas desfavoráveis e/ou deficiência de oxigênio, as Mycobacteria tuberculosis se manifestam como microaerófilas e até mesmo como anaeróbias. Nesse caso, seu metabolismo sofre alterações significativas.

_{Em termos de consumo de oxigênio e desenvolvimento de sistemas oxidase, as micobactérias são semelhantes aos fungos verdadeiros. A vitamina K9} atua como um elo entre a NADH desidrogenase e o citocromo b no sistema de transporte do gênero Mycobacterium. Este sistema citocromo assemelha-se ao mitocondrial. É sensível ao dinitrofenol, assim como em organismos superiores.

O tipo de respiração descrito não é a única fonte de formação de ATP. Além do terminal O₂ _, as micobactérias podem utilizar cadeias respiratórias que transferem elétrons e terminam com nitratos (NO₂ ₎^. A reserva do sistema respiratório das micobactérias é o ciclo do glioxilato.

A respiração anóxica (endógena), que ocorre em uma atmosfera com concentração de oxigênio menor que 1%, é estimulada por compostos azida, que reduzem a oxidação do piruvato ou da trealose.

Crescimento e reprodução de micobactérias

O Mycobacterium tuberculosis reproduz-se extremamente lentamente: o período de duplicação é de 18 a 24 horas (bactérias normais se dividem a cada 15 minutos). Portanto, para obter o crescimento visível de colônias típicas, são necessárias pelo menos 4 a 6 semanas. Uma das razões para a reprodução lenta das micobactérias é considerada sua hidrofobicidade pronunciada, que dificulta a difusão de nutrientes. É mais provável que isso seja geneticamente determinado e esteja associado à estrutura mais complexa das micobactérias. Sabe-se, por exemplo, que a maioria das bactérias possui múltiplas cópias do operon do ácido ribonucleico ribossômico (rRNA). Micobactérias de crescimento lento (M. tuberculosis, M. leprae) possuem uma cópia do operon, enquanto as de crescimento rápido (M. smegmatis) possuem apenas duas cópias.

Quando cultivadas em meio líquido, as micobactérias crescem na superfície. A delicada película seca engrossa com o tempo, torna-se irregular e enrugada, adquirindo uma tonalidade amarelada, frequentemente comparada à cor do marfim. O caldo permanece transparente e o crescimento difuso só pode ser alcançado na presença de detergentes, como o Tween-80. Em microcolônias (ou seja, nos estágios iniciais), formam-se estruturas semelhantes a feixes – uma característica associada ao fator corda do M. tuberculosis.

Genética de micobactérias

O gênero Mycobacterium é geneticamente muito diverso. Ao contrário de muitas micobactérias saprófitas e não tuberculosas, o Mycobacterium tuberculosis não contém inclusões extracromossômicas (por exemplo, plasmídeos). Toda a diversidade de propriedades do Mycobacterium tuberculosis é determinada por seu cromossomo.

O genoma do complexo M. tuberculosis é extremamente conservador. Seus representantes apresentam homologia de DNA entre 85% e 100%, enquanto o DNA de outras espécies de micobactérias é homólogo ao M. tuberculosis em apenas 4% a 26%.

Representantes do gênero Mycobacteria possuem genomas maiores em comparação com outros procariontes – 3,1-4,5x109 ^Da. No entanto, os genomas de espécies patogênicas são menores que os de outras micobactérias (em M. tuberculosis – 2,5x109 ^Da ). O agente causador clássico da tuberculose humana, M. tuberculosis, possui mais genes que M. africanum e M. bovis, que perderam parte de seu material genético ao longo da evolução.

Em 1998, foi publicada a sequência de nucleotídeos do cromossomo da cepa H37Rv de M. tuberculosis. Seu comprimento é de 4.411.529 pares de bases. O cromossomo da micobactéria da tuberculose é uma estrutura em anel. Ele contém cerca de 4.000 genes que codificam proteínas, bem como 60 componentes funcionais de RNA codificadores: um operon de RNA ribossômico exclusivo, o RNA 10Sa, que participa da degradação de proteínas com RNA de matriz atípico, 45 RNAs de transporte (tRNA) e mais de 90 lipoproteínas.

Mais de 20% do genoma é ocupado por genes do metabolismo de ácidos graxos da parede celular, incluindo ácidos micólicos, polipeptídeos ácidos ricos em glicina (famílias PE e PPE), codificados por regiões polimórficas do genoma PGRS (Polymorphic GC-rich repetitive sequence) e MPTR (Major polymorphic tandem repeat), respectivamente (o quinto e o quarto anéis do mapa cromossômico genômico). A variabilidade dessas regiões genômicas garante diferenças nos antígenos e a capacidade de inibir a resposta imune. O genoma do Mycobacterium tuberculosis contém amplamente genes que controlam fatores de virulência.

O Mycobacterium tuberculosis sintetiza todos os componentes necessários ao metabolismo: aminoácidos essenciais, vitaminas, enzimas e cofatores. Comparado a outros tipos de bactérias, o M. tuberculosis apresenta atividade aumentada de enzimas de lipogênese. Dois genes codificam proteínas semelhantes à hemoglobina que atuam como protetores antioxidantes ou retêm o excesso de oxigênio celular. Essas características facilitam a rápida adaptação do Mycobacterium tuberculosis a mudanças abruptas nas condições ambientais.

Uma característica distintiva do genoma do complexo M. tuberculosis é o grande número de sequências de DNA repetidas. Assim, o cromossomo H37Rv de M. tuberculosis contém até 56 cópias de elementos IS (sequências de inserção), que fornecem o polimorfismo do DNA de Mycobacterium tuberculosis. A maioria deles, com exceção do elemento IS6110, permanece inalterada. Os cromossomos de várias cepas de Mycobacterium tuberculosis geralmente contêm de 5 a 20 cópias de IS6110, mas existem cepas que não possuem esse elemento. Juntamente com os elementos IS, o genoma contém vários tipos de repetições curtas de nucleotídeos (PGRS e MPTR), bem como repetições diretas DR (Repetição Direta), localizadas na região DR e separadas por sequências variáveis - espaçadores (o sexto anel no mapa cromossômico). As diferenças no número de cópias e na localização no cromossomo desses elementos genéticos são usadas para diferenciar cepas de Mycobacterium tuberculosis em epidemiologia molecular. Os esquemas mais avançados para genotipagem de micobactérias baseiam-se na detecção de polimorfismo genômico causado pelo elemento IS6110, bem como por DR e seus espaçadores. É característico que a divergência das espécies de M. tuberculosis ocorra, via de regra, devido a recombinações entre cópias do elemento IS6110, que flanqueiam genes diferentes.

Dois prófagos, phiRv1 e phiRv2, foram encontrados no genoma do H37Rv. Assim como o sítio polimórfico Dral, eles provavelmente estão associados a fatores de patogenicidade, uma vez que essas regiões do genoma diferem de regiões semelhantes das cepas avirulentas de M. tuberculosis H37Ra e M. bom BCG. Regiões do genoma (genes mutT e ogt) responsáveis pelo aumento da taxa de mutação e adaptação da Mycobacteria tuberculosis sob condições de prensagem foram identificadas. A descoberta de genes desencadeadores da dormência da Mycobacteria tuberculosis mudou o conceito de infecção latente por tuberculose.

Estudo do polimorfismo dos genes que codificam a catalase, a peroxidase e a subunidade A da DNA girase. Três grupos genotípicos foram identificados no complexo M. tuberculosis. O mais antigo (do ponto de vista evolutivo) é o grupo I: M. africanum, M. bovis, M. tuberculosis e M. microti. Os grupos II e III incluem diferentes cepas de M. tuberculosis, que se espalharam em algumas regiões geográficas. O comportamento clonal é característico dos grupos I e II, e as cepas do grupo III raramente causam doenças em massa. As famílias genéticas de M. tuberculosis, que receberam os nomes Haarlem, África e Filipinas, estão espalhadas em diferentes regiões do mundo.

Um lugar especial é ocupado pela família Beijing, identificada pela primeira vez em preparações histológicas de tecido pulmonar de pacientes nos subúrbios de Pequim entre 1956 e 1990. Até o momento, cepas dessa família foram encontradas em países asiáticos, África do Sul, Caribe e Estados Unidos. A disseminação desse genótipo em diferentes territórios é determinada pelas características étnicas da população indígena e dos migrantes. Recentemente, foram obtidos dados sobre a disseminação de cepas do genótipo SI/Pequim no noroeste da parte europeia da Rússia (São Petersburgo) e nas regiões da Sibéria.

Resistência micobacteriana

Ao longo da evolução, as micobactérias da tuberculose desenvolveram diversos mecanismos para superar ou inativar fatores ambientais desfavoráveis. Em primeiro lugar, trata-se de uma parede celular potente. Em segundo lugar, apresentam amplas capacidades metabólicas. São capazes de inativar diversas toxinas e substâncias celulares (vários peróxidos, aldeídos e outros) que destroem a membrana celular. Em terceiro lugar, a plasticidade morfológica, que consiste na transformação das micobactérias (a formação de formas L de células dormentes). Em termos de estabilidade, depois das bactérias formadoras de esporos, ocupam um lugar de destaque no reino dos procariontes.

O patógeno permanece viável em estado seco por até 3 anos. Quando aquecidas, as micobactérias da tuberculose podem suportar temperaturas significativamente superiores a 80 °C. Atualmente, acredita-se que as micobactérias da tuberculose encontradas no escarro permaneçam viáveis quando este é fervido a céu aberto por 5 minutos.

O Mycobacterium tuberculosis é resistente a ácidos orgânicos e inorgânicos, álcalis, diversos oxidantes, bem como a diversas substâncias antissépticas e desidratantes que têm efeito prejudicial sobre outros microrganismos patogênicos. O Mycobacterium tuberculosis apresenta resistência aos efeitos de álcoois e acetona.

Observa-se que produtos à base de amônio quaternário não apresentam atividade antituberculosa. Sob certas condições, concentrações de cloro e radicais de oxigênio de até 0,5% também não apresentam efeito prejudicial sobre as micobactérias da tuberculose. Isso implica na impossibilidade de uso desses produtos para esterilizar escarro e outros materiais biológicos infectados.

O Mycobacterium tuberculosis é insensível à luz solar difusa e pode existir no ambiente externo por mais de um ano sem perder a viabilidade. A radiação ultravioleta de ondas curtas tem um efeito bactericida universal sobre todos os microrganismos. No entanto, em condições reais, quando o Mycobacterium tuberculosis é suspenso na forma de aglomerados celulares com partículas de poeira, sua resistência à radiação ultravioleta aumenta.

A alta taxa de sobrevivência da micobactéria da tuberculose contribui para a ampla disseminação dessa infecção na população, independentemente das condições climáticas. No entanto, este não é o único fator que contribui para a globalização do problema – a micobactéria da tuberculose pode persistir no corpo humano por muito tempo e se reativar em intervalos ilimitados.

A localização da micobactéria da tuberculose dentro dos macrófagos proporciona estabilidade suficiente ao substrato, levando em consideração a "longevidade" dos fagócitos mononucleares e a duração da replicação micobacteriana, bem como o isolamento dos efetores da imunidade humoral. Ao mesmo tempo, o patógeno seleciona um biótopo inaceitável para a maioria dos microrganismos devido ao seu potencial perigo. Essa simbiose é proporcionada por diversos mecanismos adaptativos das micobactérias.

O processo de dano e parasitismo do macrófago se parece com isso: penetração de micobactérias no macrófago sem sua ativação; supressão da formação de fagolisossomos ou sua transformação em uma zona confortável para bactérias; avanço dos fagossomos para o citoplasma com inativação de fatores antimicrobianos; interferência na atividade vital da célula; enfraquecimento da sensibilidade dos macrófagos aos sinais de ativação dos linfócitos T; redução da função de apresentação de antígenos dos macrófagos e o enfraquecimento associado das reações dos linfócitos T citotóxicos configurados para destruir células infectadas.

É claro que as características da parede celular desempenham um papel importante para garantir isso, assim como as capacidades metabólicas e funcionais. No primeiro contato com a micobactéria, o sistema imunológico do macrorganismo não é capaz de ativar a imunidade humoral, neutralizar e eliminar rapidamente a célula do corpo, uma vez que as cadeias alifáticas móveis da parede micobacteriana não permitem a avaliação das estruturas da superfície do patógeno e transmitem as informações relevantes para a síntese do conjunto necessário de anticorpos.

A alta hidrofobicidade das micobactérias garante contatos não específicos, ou seja, independentes de receptores, com os macrófagos. Ao formar um fagossomo ao redor da célula micobacteriana, o macrófago a coloca dentro de si. Complexos de micosídeos de superfície e lipoarabinomanana podem ser reconhecidos pelos receptores, mas os sinais desencadeados por eles não ativam ou ativam fracamente os macrófagos. Como resultado, a fagocitose não é acompanhada pela liberação de formas de radicais livres de oxigênio e nitrogênio. Acredita-se que isso seja mais característico de cepas virulentas de M. tuberculosis, que, devido às características estruturais da lipoarabinomanana, iniciam a fagocitose "não agressiva". Outros receptores de macrófagos, em particular o CD 14 e os receptores do componente C3 do complemento (CR1-CR3), também participam do reconhecimento do M. tuberculosis.

Ao penetrar no interior do macrófago, a micobactéria ativa uma série de mecanismos que impedem a formação do fagossomo: a produção de amônio, que alcaliniza o ambiente dentro do fagossomo, a síntese de sulfolipídios, que leva à formação de uma carga negativa na superfície do fagossomo, o que impede a fusão do fagossomo e do lisossomo.

Se um fagolisossomo for formado, a micobactéria, graças à sua poderosa casca cerosa, é capaz de neutralizar reações de radicais livres causadas por substâncias bactericidas dos fagócitos. O amônio alcaliniza o ambiente, bloqueando a atividade de enzimas lisossômicas, e os sulfolipídios neutralizam proteínas catiônicas membranotrópicas. Além disso, as micobactérias da tuberculose produzem enzimas altamente ativas com atividade catalase e peroxidase, que competem com os sistemas peroxidase dos macrófagos e, simultaneamente, inativam os hidroperóxidos do lisossomo. Tudo isso aumenta a resistência das micobactérias ao estresse oxidativo.

A adaptação adicional das micobactérias consiste na utilização de compostos de ferro dos macrófagos em seus sistemas enzimáticos e no bloqueio das funções imunoespecíficas dos macrófagos. Os macrófagos são um dos principais reservatórios de ferro, cujo excesso se acumula na forma de ferritina. O teor de ferro nos macrófagos alveolares é 100 vezes maior do que nos monócitos sanguíneos, o que certamente contribui para sua colonização por micobactérias da tuberculose.

As micobactérias exercem efeitos tóxicos sobre os macrófagos por meio de endotoxinas e fatores inespecíficos. Ambos afetam principalmente o sistema respiratório dos macrófagos – as mitocôndrias. As endotoxinas incluem arabinolipídios micólicos, que inibem a respiração mitocondrial. As toxinas inespecíficas incluem produtos da síntese da parte lipídica da célula micobacteriana – ácidos ftieno e ftiônico, que causam o desacoplamento da fosforilação oxidativa. O aumento dos processos metabólicos nessas condições não é acompanhado pela síntese adequada de ATP. As células hospedeiras começam a sofrer privação de energia, o que leva à inibição de sua atividade vital e, subsequentemente, à citólise e apoptose.

É possível que alguns fatores de patogenicidade sejam formados apenas no interior das células infectadas, como é o caso de outras bactérias que preferem um estilo de vida intracelular. Por exemplo, a salmonela, que parasita o interior dos macrófagos, expressa adicionalmente mais de 30 genes. Apesar da descrição completa do genoma da micobactéria da tuberculose, 30% dos códons estão relacionados a proteínas com propriedades desconhecidas.

Resistência de micobactérias a medicamentos

Do ponto de vista clínico, a suscetibilidade de um microrganismo aos medicamentos determina se a quimioterapia padrão com o medicamento indicado pode ser usada para tratar a doença causada pela cepa isolada. A resistência "prevê a falha do tratamento com o medicamento em teste". Em outras palavras, o uso de quimioterapia padrão que resulta em uma concentração sistêmica do medicamento geralmente eficaz em condições normais não suprime a proliferação de "microrganismos resistentes".

Em microbiologia, a definição de sensibilidade ou resistência a medicamentos baseia-se na abordagem populacional, que implica diferentes graus de resistência de um conjunto (conjunto heterogêneo) de células microbianas. A resistência a medicamentos é avaliada por meio de características quantitativas, como a "concentração inibitória mínima" (CIM). Por exemplo, em CIM-90, 90% dos microrganismos morrem (concentração bacteriostática). Assim, a resistência deve ser entendida como o seu grau em uma parte da população microbiana, que predetermina a falha do tratamento na maioria dos casos. É geralmente aceito que 10% das cepas resistentes em toda a população microbiana de um paciente podem ter um efeito patogênico. Em tisiobacteriologia, para medicamentos antituberculose de primeira linha, é de 1%. (ou 20 unidades formadoras de colônias - UFC). Essa parte da população microbiana é capaz de deslocar a original em um mês e formar uma lesão. Para medicamentos antituberculose de segunda linha, o critério para resistência é um aumento de 10% na população microbiana.

O desenvolvimento de resistência a medicamentos em microrganismos está associado à seleção na presença de um antibiótico e à sobrevivência preferencial de uma parcela da população microbiana que possui mecanismos de proteção contra o agente antibacteriano. Cada população contém um pequeno número de células mutantes (geralmente 106 ^-109) que são resistentes a um determinado medicamento. Durante a quimioterapia, células microbianas sensíveis morrem e as resistentes se multiplicam. Como resultado, células sensíveis são substituídas por células resistentes.

As micobactérias inicialmente apresentam alta resistência natural a muitos medicamentos antibacterianos de amplo espectro, mas diferentes espécies apresentam diferentes espectros e graus dessa sensibilidade.

A verdadeira resistência natural é entendida como uma característica permanente específica da espécie dos microrganismos associada à ausência de um alvo para a ação de um antibiótico ou à inacessibilidade do alvo devido à permeabilidade inicialmente baixa da parede celular, inativação enzimática da substância ou outros mecanismos.

Resistência adquirida é a capacidade de cepas individuais de permanecerem viáveis em concentrações de antibióticos que suprimem o crescimento da maior parte da população microbiana. A aquisição de resistência, em todos os casos, é geneticamente determinada: o surgimento de novas informações genéticas ou uma alteração no nível de expressão dos próprios genes.

Atualmente, vários mecanismos moleculares de resistência do Mycobacterium tuberculosis foram descobertos:

• inativação de antibióticos (inativação enzimática), por exemplo, por β-lactamases;
• modificação do alvo de ação (alteração na configuração espacial da proteína devido à mutação da região correspondente do genoma):
• hiperprodução do alvo, levando a uma alteração na proporção agente-alvo e à liberação de parte das proteínas de suporte à vida da bactéria;
• remoção ativa do fármaco da célula microbiana (efluxo) devido à ativação de mecanismos de defesa contra o estresse:
• alterações nos parâmetros de permeabilidade das estruturas externas da célula microbiana, bloqueando a capacidade do antibiótico de penetrar na célula;
• inclusão de um "shunt metabólico" (desvio da via metabólica).

Além do impacto direto no metabolismo das células microbianas, muitos medicamentos antibacterianos (benzilpenicilina, estreptomicina, rifampicina) e outros fatores desfavoráveis (biocidas do sistema imunológico) levam ao aparecimento de formas alteradas de micobactérias (protoplastos, formas L) e também transferem as células para um estado dormente: a intensidade do metabolismo celular diminui e a bactéria se torna insensível à ação do antibiótico.

Todos os mecanismos formam diferentes graus de resistência, conferindo resistência a diferentes concentrações de quimioterápicos. Portanto, o surgimento de resistência em bactérias nem sempre é acompanhado por uma diminuição na eficácia clínica do antibiótico. Para avaliar a eficácia e o prognóstico do tratamento, é importante conhecer o grau de resistência.

Atualmente, para cada medicamento antituberculose de primeira linha e para a maioria dos medicamentos de reserva, pelo menos um gene foi identificado. Mutações específicas levam ao desenvolvimento de variantes resistentes de micobactérias. Na ampla distribuição da resistência a medicamentos em micobactérias, uma alta taxa de mutação in vivo, maior do que in vitro, é importante.

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Tipos de resistência a medicamentos de micobactérias

É feita uma distinção entre resistência primária e adquirida aos medicamentos. Microrganismos com resistência primária incluem cepas isoladas de pacientes que não receberam terapia específica ou que receberam medicamentos por um mês ou menos. Se for impossível esclarecer o fato do uso de medicamentos antituberculose, o termo "resistência inicial" é usado.

A resistência primária a medicamentos é de grande importância clínica e epidemiológica; portanto, para sua correta avaliação, é necessário não administrar quimioterapia a um paciente recém-diagnosticado com tuberculose antes do exame microbiológico do material diagnóstico. A frequência de resistência primária a medicamentos é calculada como a razão entre o número de pacientes recém-diagnosticados com resistência primária e o número de todos os pacientes recém-diagnosticados que foram testados para suscetibilidade a medicamentos durante o ano. Se uma cepa resistente for isolada de um paciente durante a terapia antituberculosa administrada por um mês ou mais, a resistência é considerada adquirida. A frequência de resistência primária a medicamentos caracteriza o estado epidemiológico da população do patógeno da tuberculose.

A resistência adquirida aos medicamentos entre pacientes recém-diagnosticados é resultado de tratamentos malsucedidos (seleção incorreta dos medicamentos, não adesão ao regime terapêutico, redução das dosagens, fornecimento inconsistente e baixa qualidade dos medicamentos). Esses fatores levam à diminuição da concentração sistêmica dos medicamentos no sangue e de sua eficácia, ao mesmo tempo em que "desencadeiam" mecanismos de defesa nas células micobacterianas.

Para fins epidemiológicos, calcula-se a frequência de casos previamente tratados. Para tanto, são considerados os pacientes registrados para retratamento após um tratamento quimioterápico malsucedido ou recidivas. Calcula-se a razão entre o número de culturas de Mycobacterium tuberculosis resistentes e o número de todas as cepas testadas para resistência aos medicamentos durante o ano entre os pacientes desse grupo no momento do registro.

Na estrutura de resistência aos medicamentos do Mycobacterium tuberculosis, distinguem-se:

Monorresistência - resistência a um dos medicamentos antituberculose, sensibilidade a outros medicamentos preservada. Ao utilizar terapia complexa, a monorresistência é detectada muito raramente e, via de regra, à estreptomicina (em 10-15% dos casos entre pacientes recém-diagnosticados).

Polirresistência é a resistência a dois ou mais medicamentos.

A resistência a múltiplos medicamentos é a resistência à isoniazida e à rifampicina simultaneamente (independentemente da presença de resistência a outros medicamentos). Geralmente é acompanhada de resistência à estreptomicina, etc. Atualmente, a resistência multirresistente (MR) de patógenos da tuberculose tornou-se um fenômeno epidemiologicamente perigoso. Cálculos mostram que a detecção de patógenos com MDR em mais de 6,6% dos casos (entre pacientes recém-diagnosticados) exige uma mudança na estratégia do Programa Nacional de Combate à Tuberculose. De acordo com dados de monitoramento da resistência a medicamentos, a frequência de MDR entre pacientes recém-diagnosticados varia de 4 a 15%, entre recidivas - 45 a 55%, e entre casos de tratamento malsucedido - até 80%.

A superresistência é a resistência a múltiplos medicamentos combinada com a resistência às fluoroquinolonas e a um dos medicamentos injetáveis (canamicina, amicacina, capreomicina). A tuberculose causada por cepas com superresistência representa uma ameaça direta à vida dos pacientes, visto que outros medicamentos antituberculosos de segunda linha não apresentam efeito antibacteriano pronunciado. Desde 2006, alguns países organizam vigilância para a disseminação de cepas de micobactérias com superresistência. No exterior, essa variante MR é geralmente designada como XDR.

Resistência cruzada ocorre quando a resistência a um medicamento leva à resistência a outros medicamentos. Em M. tuberculosis, as mutações associadas à resistência geralmente não estão inter-relacionadas. O desenvolvimento de resistência cruzada se deve à similaridade da estrutura química de alguns medicamentos antituberculosos. A resistência cruzada é especialmente frequentemente detectada dentro de um grupo de medicamentos, como os aminoglicosídeos. Para prever a resistência cruzada, estudos genéticos de culturas micobacterianas são necessários em combinação com estudos microbiológicos de resistência.

Micobactérias não tuberculosas

Micobactérias não tuberculosas são transmitidas de pessoa para pessoa extremamente raramente. A frequência de isolamento de algumas de suas espécies em material de pacientes é comparável à frequência de isolamento dessas espécies em objetos ambientais. As fontes de infecção podem ser animais de fazenda e aves, além de produtos não processados. As micobactérias são encontradas em material pós-abate e no leite bovino.

De acordo com laboratórios bacteriológicos, a prevalência de micobactérias não tuberculosas em 2004-2005 foi de 0,5% a 6,2% entre todas as micobactérias em pacientes recém-diagnosticados. A frequência pode ser um pouco maior, visto que o método utilizado para processar o material diagnóstico não é o ideal para micobactérias não tuberculosas. Micobactérias saprófitas podem estar presentes no material diagnóstico se as regras de coleta não forem seguidas ou devido às características do material (por exemplo, M. smegmatis pode ser isolado da urina de pacientes do sexo masculino).

Nesse sentido, é importante confirmar repetidamente o tipo de micobactéria detectado no material do paciente.

As micobactérias afetam a pele e os tecidos moles e também podem causar micobacteriose pulmonar, especialmente comum em estados de imunodeficiência. Com localização pulmonar, é mais frequentemente detectada em homens idosos com histórico de doenças pulmonares crônicas, incluindo lesões fúngicas.

De todas as micobactérias, o complexo M. avium-intracellularae é o agente causador mais comum de micobacteriose pulmonar em humanos. Causa doenças nos pulmões, linfonodos periféricos e processos disseminados. No norte da Europa, cerca de 60% das micobacterioses pulmonares são observadas. Processos fibrocavernosos e infiltrativos predominam, apresentando curso crônico devido à alta resistência aos medicamentos antituberculosos.

M. kansasii é o agente causador de doenças pulmonares crônicas semelhantes à tuberculose. A quimioterapia é mais eficaz devido à maior sensibilidade de M. kansasii a medicamentos antibacterianos. M. xenopi e M. malmoense causam principalmente doenças pulmonares crônicas. Eles podem contaminar sistemas de abastecimento de água quente e fria. O habitat de M. malmoens não está totalmente estabelecido. M. xenopi exibe sensibilidade razoavelmente boa à terapia antituberculose. M. malmoense exibe sensibilidade razoavelmente alta a antibióticos in vitro, mas o tratamento conservador é frequentemente ineficaz e até fatal. M. fortuitum e M. chelonae são reconhecidos como agentes causadores de doenças ósseas e de tecidos moles devido à contaminação direta de uma ferida durante trauma, cirurgia e lesão penetrante. Eles causam até 10% das micobacterioses pulmonares. Ocorre como uma lesão bilateral destrutiva crônica, frequentemente fatal. Medicamentos antituberculose e antibióticos de amplo espectro não são ativos ou têm pouca atividade contra esses tipos de micobactérias.

Nas regiões do sul, as micobacterioses da pele e dos tecidos moles causadas por M. leprae e M. ulceranse são comuns. A identificação de micobactérias não tuberculosas é realizada nos laboratórios das principais instituições antituberculosas do país. Isso exige alta qualificação e bons equipamentos dos laboratórios.