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Análise de polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição
Última revisão: 05.07.2025
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O uso generalizado de várias endonucleases de restrição para a análise de DNA cromossômico revelou a enorme variabilidade do genoma humano. Mesmo pequenas alterações nas regiões codificadoras e regulatórias de genes estruturais podem levar à cessação da síntese de uma determinada proteína ou à perda de sua função no corpo humano, o que geralmente afeta o fenótipo do paciente. No entanto, aproximadamente 90% do genoma humano consiste em sequências não codificadoras, que são mais variáveis e contêm muitas das chamadas mutações neutras, ou polimorfismos, e não têm expressão fenotípica. Essas regiões polimórficas (loci) são usadas no diagnóstico de doenças hereditárias como marcadores genéticos. Loci polimórficos estão presentes em todos os cromossomos e estão ligados a uma região específica do gene. Ao determinar a localização de um locus polimórfico, é possível estabelecer qual gene está associado à mutação que causou a doença no paciente.
Para isolar regiões polimórficas de DNA, são utilizadas enzimas bacterianas – as restritivas, cujos produtos são sítios de restrição. Mutações espontâneas que ocorrem em sítios polimórficos os tornam resistentes ou, inversamente, sensíveis à ação de uma restritivase específica.
A variabilidade mutacional em sítios de restrição pode ser detectada alterando o comprimento dos fragmentos de restrição do DNA, separando-os por eletroforese e subsequente hibridização com sondas de DNA específicas. Na ausência de restrição em um sítio polimórfico, um fragmento grande será detectado em eletroforegramas e, na sua presença, um fragmento menor estará presente. A presença ou ausência de um sítio de restrição em loci idênticos de cromossomos homólogos permite uma marcação bastante confiável do gene mutante e normal e o rastreamento de sua transmissão para a prole. Assim, ao estudar o DNA de pacientes em ambos os cromossomos dos quais um sítio de restrição está presente em uma região polimórfica, fragmentos curtos de DNA serão detectados no eletroforegrama. Em pacientes homozigotos para uma mutação que altera o sítio de restrição polimórfico, fragmentos mais longos serão detectados e, em pacientes heterozigotos, fragmentos curtos e longos.
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