Válvulas cardíacas artificiais

As válvulas cardíacas artificiais biológicas modernas disponíveis para uso clínico, com exceção do enxerto pulmonar autógeno, são estruturas inviáveis, sem potencial de crescimento e reparação tecidual. Isso impõe limitações significativas ao seu uso, especialmente em crianças, para a correção de patologias valvares. A engenharia de tecidos se desenvolveu nos últimos 15 anos. O objetivo dessa direção científica é criar, em condições artificiais, estruturas como válvulas cardíacas artificiais com superfície tromborresistente e interstício viável.

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Como são desenvolvidas válvulas cardíacas artificiais?

O conceito científico da engenharia de tecidos baseia-se na ideia de povoar e cultivar células vivas (fibroblastos, células-tronco, etc.) em uma matriz absorvível sintética ou natural (matriz), que é uma estrutura valvar tridimensional, bem como na utilização de sinais que regulam a expressão gênica, a organização e a produtividade das células transplantadas durante o período de formação da matriz extracelular.

Essas válvulas cardíacas artificiais são integradas ao tecido do paciente para a restauração final e manutenção de sua estrutura e função. Nesse caso, uma nova estrutura de colágeno-elastina, ou, mais precisamente, uma matriz extracelular, é formada sobre a matriz original como resultado do funcionamento das células (fibroblastos, miofibroblastos, etc.). Consequentemente, as válvulas cardíacas artificiais ideais criadas por engenharia de tecidos devem ser próximas às nativas em termos de estrutura e função anatômicas, além de apresentar adaptabilidade biomecânica, capacidade de reparação e crescimento.

A engenharia de tecidos desenvolve válvulas cardíacas artificiais utilizando diversas fontes de coleta de células. Assim, células xenogênicas ou alogênicas podem ser utilizadas, embora as primeiras estejam associadas ao risco de transmissão de zoonoses aos humanos. É possível reduzir a antigenicidade e prevenir reações de rejeição do organismo por meio da modificação genética de células alogênicas. A engenharia de tecidos requer uma fonte confiável de células. Tal fonte são células autógenas retiradas diretamente do paciente e que não produzem reações imunológicas durante o reimplante. Válvulas cardíacas artificiais eficazes são produzidas com base em células autólogas obtidas de vasos sanguíneos (artérias e veias). Um método baseado no uso de triagem celular ativada por fluorescência (FACS) foi desenvolvido para obter culturas celulares puras. Uma população mista de células obtida de um vaso sanguíneo é marcada com um marcador de lipoproteína de baixa densidade acetilada, que é seletivamente absorvido na superfície dos endotelócitos. As células endoteliais podem então ser facilmente separadas do grosso das células obtidas dos vasos, que serão uma mistura de células musculares lisas, miofibroblastos e fibroblastos. A origem das células, seja artéria ou veia, afetará as propriedades da construção final. Assim, válvulas cardíacas artificiais com uma matriz semeada com células venosas são superiores em formação de colágeno e estabilidade mecânica às construções semeadas com células arteriais. A escolha de veias periféricas parece ser uma fonte mais conveniente de coleta de células.

Miofibroblastos também podem ser coletados de artérias carótidas. No entanto, células derivadas de vasos sanguíneos apresentam características significativamente diferentes das células intersticiais naturais. Células autólogas de cordão umbilical podem ser usadas como fonte celular alternativa.

Válvulas cardíacas artificiais baseadas em células-tronco

Nos últimos anos, o progresso na engenharia de tecidos foi facilitado pela pesquisa com células-tronco. O uso de células-tronco da medula óssea vermelha tem suas vantagens. Em particular, a simplicidade da coleta de biomateriais e do cultivo in vitro com subsequente diferenciação em vários tipos de células mesenquimais permite evitar o uso de vasos intactos. As células-tronco são fontes pluripotentes de linhagens celulares e possuem características imunológicas únicas que contribuem para sua estabilidade em condições alogênicas.

Células-tronco da medula óssea vermelha humana são obtidas por punção esternal ou da crista ilíaca. São isoladas de 10 a 15 ml de aspirado esternal, separadas de outras células e cultivadas. Ao atingir o número necessário de células (geralmente em 21 a 28 dias), elas são semeadas (colonizadas) em matrizes e cultivadas em meio nutriente em posição estática (por 7 dias em incubadora umidificada a 37 °C na presença de 5% de CO2). Posteriormente, o crescimento celular é estimulado através do meio cuptural (estímulos biológicos) ou pela criação de condições fisiológicas para o crescimento do tecido durante sua deformação isométrica em um aparelho de reprodução com fluxo pulsante - um biorreator (estímulos mecânicos). Os fibroblastos são sensíveis a estímulos mecânicos que promovem seu crescimento e atividade funcional. O fluxo pulsante causa um aumento nas deformações radiais e circunferenciais, o que leva à orientação (alongamento) das células povoadas na direção dessas tensões. Isso, por sua vez, leva à formação de estruturas fibrosas orientadas nas válvulas. Um fluxo constante causa apenas tensões tangenciais nas paredes. O fluxo pulsante tem um efeito benéfico na morfologia celular, na proliferação e na composição da matriz extracelular. A natureza do fluxo do meio nutriente e as condições físico-químicas (pH, pO2 e pCO2) no biorreator também afetam significativamente a produção de colágeno. Assim, o fluxo laminar e as correntes parasitas cíclicas aumentam a produção de colágeno, o que leva à melhoria das propriedades mecânicas.

Outra abordagem para o crescimento de estruturas teciduais é criar condições embrionárias em um biorreator em vez de simular condições fisiológicas do corpo humano. Bioválvulas teciduais cultivadas com base em células-tronco têm abas móveis e flexíveis, funcionalmente capazes sob a influência de alta pressão e fluxo excedendo o nível fisiológico. Estudos histológicos e histoquímicos das abas dessas estruturas mostraram a presença de processos ativos de biodestruição da matriz e sua substituição por tecido viável. O tecido é organizado de acordo com o tipo em camadas com as características de proteínas da matriz extracelular semelhantes às do tecido nativo, a presença de colágeno tipos I e III e glicosaminoglicanos. No entanto, a estrutura típica de três camadas das abas - camadas ventricular, esponjosa e fibrosa - não foi obtida. Células ASMA positivas expressando vimentina encontradas em todos os fragmentos tinham características semelhantes às dos miofibroblastos. A microscopia eletrônica revelou elementos celulares com características de miofibroblastos ativos e secretores viáveis (filamentos de actina/miosina, fios de colágeno, elastina) e células endoteliais na superfície do tecido.

Colágenos tipos I, III, ASMA e vimentina foram detectados nos folhetos. As propriedades mecânicas dos folhetos do tecido e das estruturas nativas foram comparáveis. As válvulas cardíacas artificiais de tecido apresentaram excelente desempenho ao longo de 20 semanas e assemelharam-se às estruturas anatômicas naturais em sua microestrutura, perfil bioquímico e formação da matriz proteica.

Todas as válvulas cardíacas artificiais obtidas por engenharia de tecidos foram implantadas em animais em posição pulmonar, uma vez que suas características mecânicas não correspondem às cargas na posição aórtica. As válvulas de tecido explantadas de animais apresentam estrutura semelhante à das nativas, o que indica seu posterior desenvolvimento e reestruturação in vivo. Estudos futuros demonstrarão se o processo de reestruturação e maturação tecidual continuará em condições fisiológicas após a implantação das válvulas cardíacas artificiais, como observado em experimentos com animais.

Válvulas cardíacas artificiais ideais devem ter uma porosidade de pelo menos 90%, essencial para o crescimento celular, o fornecimento de nutrientes e a remoção de produtos metabólicos celulares. Além da biocompatibilidade e da biodegradabilidade, as válvulas cardíacas artificiais devem ter uma superfície quimicamente favorável à semeadura celular e corresponder às propriedades mecânicas do tecido natural. O nível de biodegradação da matriz deve ser controlável e proporcional ao nível de formação de novo tecido para garantir a estabilidade mecânica ao longo do tempo.

Atualmente, matrizes sintéticas e biológicas estão sendo desenvolvidas. Os materiais biológicos mais comuns para a criação de matrizes são estruturas anatômicas doadoras, colágeno e fibrina. Válvulas cardíacas artificiais de polímero estão sendo projetadas para se biodegradarem após a implantação, uma vez que as células implantadas começam a produzir e organizar sua própria rede de matriz extracelular. A formação de novo tecido de matriz pode ser regulada ou estimulada por fatores de crescimento, citocinas ou hormônios.

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Válvulas cardíacas artificiais de doadores

Válvulas cardíacas artificiais de doadores obtidas de humanos ou animais e depletadas de antígenos celulares por descelularização para reduzir sua imunogenicidade podem ser usadas como matrizes. As proteínas preservadas da matriz extracelular são a base para a adesão subsequente das células semeadas. Existem os seguintes métodos de remoção de elementos celulares (acelularização): congelamento, tratamento com tripsina/EDTA, detergentes - dodecil sulfato de sódio, desoxicolato de sódio, Triton X-100, MEGA 10, TnBR CHAPS, Tween 20, bem como métodos de tratamento enzimático em múltiplos estágios. Neste caso, membranas celulares, ácidos nucleicos, lipídios, estruturas citoplasmáticas e moléculas solúveis da matriz são removidos, preservando-se o colágeno e a elastina. No entanto, um método ideal ainda não foi encontrado. Somente dodecil sulfato de sódio (0,03-1%) ou desoxicolato de sódio (0,5-2%) resultaram na remoção completa das células após 24 horas de tratamento.

O exame histológico de bioválvulas descelularizadas removidas (aloenxerto e xenoenxerto) em um experimento animal (cão e porco) mostrou endotelização parcial e crescimento interno de miofibroblastos receptores na base, sem sinais de calcificação. Infiltração inflamatória moderada foi observada. No entanto, falha precoce se desenvolveu durante os ensaios clínicos da válvula SynerGraftTM descelularizada. Uma reação inflamatória pronunciada foi detectada na matriz da bioprótese, que foi inicialmente inespecífica e acompanhada por uma reação linfocítica. Disfunção e degeneração da bioprótese se desenvolveram ao longo de um ano. Não foi observada colonização celular da matriz, mas calcificação das valvas e remanescentes de células pré-implantação foram detectados.

Matrizes livres de células semeadas com células endoteliais e cultivadas in vitro e in vivo formaram uma camada coerente na superfície das valvas, e células intersticiais semeadas da estrutura nativa demonstraram sua capacidade de diferenciação. No entanto, não foi possível atingir o nível fisiológico necessário de colonização celular na matriz sob condições dinâmicas do biorreator, e as válvulas cardíacas artificiais implantadas foram acompanhadas por um espessamento bastante rápido (três meses) devido à proliferação celular acelerada e à formação de uma matriz extracelular. Assim, nesta fase, o uso de matrizes livres de células doadoras para sua colonização com células apresenta uma série de problemas não resolvidos, incluindo imunológicos e infecciosos; o trabalho com biopróteses descelularizadas continua.

Vale ressaltar que o colágeno também é um dos materiais biológicos potenciais para a produção de matrizes biodegradáveis. Ele pode ser utilizado na forma de espuma, gel ou placas, esponjas e como um blank à base de fibras. No entanto, o uso de colágeno está associado a uma série de dificuldades tecnológicas. Em particular, é difícil obtê-lo de um paciente. Portanto, atualmente, a maioria das matrizes de colágeno é de origem animal. A biodegradação lenta do colágeno animal pode acarretar um risco aumentado de infecção por zoonoses e causar reações imunológicas e inflamatórias.

A fibrina é outro material biológico com características de biodegradação controlada. Como os géis de fibrina podem ser produzidos a partir do sangue do paciente para a produção subsequente de uma matriz autóloga, a implantação dessa estrutura não causará degradação tóxica nem reação inflamatória. No entanto, a fibrina apresenta desvantagens como difusão e lixiviação para o ambiente, além de baixas propriedades mecânicas.

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Válvulas cardíacas artificiais feitas de materiais sintéticos

Válvulas cardíacas artificiais também são feitas de materiais sintéticos. Várias tentativas de fabricar matrizes de válvulas foram baseadas no uso de poliglactina, ácido poliglicólico (PGA), ácido polilático (PLA), copolímero de PGA e PLA (PLGA) e poli-hidroxialcanoatos (PHA). Material sintético altamente poroso pode ser obtido a partir de fibras trançadas ou não trançadas e usando tecnologia de lixiviação de sal. Um material compósito promissor (PGA/P4HB) para a fabricação de matrizes é obtido a partir de alças não trançadas de ácido poliglicólico (PGA) revestidas com poli-4-hidroxibutirato (P4HB). Válvulas cardíacas artificiais fabricadas a partir deste material são esterilizadas com óxido de etileno. No entanto, a significativa rigidez inicial e espessura das alças desses polímeros, sua degradação rápida e descontrolada, acompanhada pela liberação de produtos citotóxicos ácidos, exigem mais pesquisas e uma busca por outros materiais.

O uso de placas de cultura de tecido de miofibroblastos autólogos cultivadas em um arcabouço para formar matrizes de suporte, estimulando a produção dessas células, possibilitou a obtenção de amostras valvares com células viáveis ativas, circundadas por uma matriz extracelular. No entanto, as propriedades mecânicas dos tecidos dessas valvas ainda são insuficientes para sua implantação.

O nível necessário de proliferação e regeneração tecidual da válvula que está sendo criada pode não ser alcançado pela combinação isolada de células e matriz. A expressão gênica celular e a formação tecidual podem ser reguladas ou estimuladas pela adição de fatores de crescimento, citocinas ou hormônios, fatores mitogênicos ou fatores de adesão a matrizes e scaffolds. A possibilidade de introduzir esses reguladores em biomateriais de matriz está sendo estudada. De modo geral, há uma significativa carência de pesquisas sobre a regulação da formação de válvulas teciduais por estímulos bioquímicos.

A bioprótese pulmonar xenogênica suína acelular Matrix P consiste em tecido descelularizado processado por um procedimento especial patenteado pela AutoTissue GmbH, incluindo tratamento com antibióticos, desoxicolato de sódio e álcool. Este método de processamento, aprovado pela Organização Internacional de Padronização (OIT), elimina todas as células vivas e estruturas pós-celulares (fibroblastos, células endoteliais, bactérias, vírus, fungos e micoplasmas), preserva a arquitetura da matriz extracelular e reduz ao mínimo o nível de DNA e RNA nos tecidos, o que reduz a zero a probabilidade de transmissão do retrovírus endógeno suíno (PERV) para humanos. A bioprótese Matrix P consiste exclusivamente em colágeno e elastina com integração estrutural preservada.

Em experimentos com ovinos, foi registrada reação mínima dos tecidos circundantes 11 meses após a implantação da bioprótese Matrix P, com boas taxas de sobrevida, o que foi particularmente evidente na superfície interna brilhante do endocárdio. Reações inflamatórias, espessamento e encurtamento dos folhetos valvares foram praticamente ausentes. Baixos níveis de cálcio tecidual na bioprótese Matrix P também foram registrados, sendo a diferença estatisticamente significativa em comparação com aquelas tratadas com glutaraldeído.

A válvula cardíaca artificial Matrix P adapta-se às condições individuais do paciente poucos meses após a sua implantação. O exame ao final do período de controle revelou uma matriz extracelular intacta e endotélio confluente. O xenoenxerto Matrix R implantado em 50 pacientes com defeitos congênitos durante o procedimento de Ross entre 2002 e 2004 demonstrou desempenho superior e menores gradientes de pressão transvalvar em comparação com aloenxertos SynerGraftMT criopreservados e descelularizados e biopróteses sem scaffolds tratadas com glutaraldeído. As válvulas cardíacas artificiais Matrix P destinam-se à substituição da válvula pulmonar durante a reconstrução da via de saída do ventrículo direito em cirurgias para defeitos congênitos e adquiridos e durante a substituição da válvula pulmonar durante o procedimento de Ross. Estão disponíveis em 4 tamanhos (por diâmetro interno): para recém-nascidos (15-17 mm), para crianças (18-21 mm), intermediário (22-24 mm) e adulto (25-28 mm).

O progresso no desenvolvimento de válvulas teciduais dependerá de avanços na biologia celular valvar (incluindo questões de expressão e regulação gênica), estudos sobre o desenvolvimento embriogênico e valvar relacionado à idade (incluindo fatores angiogênicos e neurogênicos), conhecimento preciso da biomecânica de cada válvula, identificação de células adequadas para a semeadura e desenvolvimento de matrizes ideais. O desenvolvimento futuro de válvulas teciduais mais avançadas exigirá uma compreensão aprofundada da relação entre as características mecânicas e estruturais das válvulas nativas e os estímulos (biológicos e mecânicos) para recriar essas características in vitro.

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