O papel dos depósitos de cristais na patogénese da osteoartrite

Cristais de fosfato de cálcio básico (BCP) são encontrados no líquido sinovial de 30-60% dos pacientes com osteoartrite. De acordo com A. Swan et al. (1994), cristais contendo cálcio são encontrados no líquido sinovial de um número muito maior de pacientes com osteoartrite; no entanto, devido ao tamanho extremamente pequeno dos cristais ou ao seu pequeno número, eles não são identificados usando técnicas convencionais. A presença de cristais de BCP no líquido sinovial correlaciona-se com sinais radiográficos de degeneração da cartilagem articular e está associada a um maior volume de derrame em comparação ao derrame em articulações do joelho sem cristais. Um estudo de fatores que influenciam a progressão radiográfica da gonartrose mostrou que a deposição de cristais de pirofosfato de cálcio di-hidratado (CPPD) é um preditor de um resultado clínico e radiográfico desfavorável. Em um estudo com pacientes idosos, constatou-se que a osteoartrite estava associada à condrocalcinose, particularmente no compartimento tibiofemoral lateral do joelho e nas três primeiras articulações metacarpofalângicas. Não é incomum que ambos os tipos de cristais, OFC e PFC, sejam encontrados em pacientes com osteoartrite.

Clinicamente, a degeneração da cartilagem articular causada pela deposição de cristais de cálcio difere daquela observada na osteoartrose primária. Se os cristais fossem um simples epifenômeno da degeneração da cartilagem, eles seriam encontrados nas articulações mais frequentemente afetadas pela osteoartrose primária, ou seja, joelhos, quadris e pequenas articulações das mãos. Em contraste, as doenças por deposição de cristais afetam mais frequentemente articulações que não são típicas da osteoartrose primária, como ombro, punho e cotovelo. A presença de cristais no fluido articular (derrame) está associada a uma degeneração mais grave da cartilagem articular. A questão de qual é a causa e qual é o efeito, deposição de cristais ou degeneração da cartilagem, é debatida. Uma posição intermediária é ocupada pela seguinte suposição: uma anomalia primária no metabolismo da cartilagem leva à sua degeneração, e a deposição secundária de cristais acelera sua degradação (a chamada teoria do loop de amplificação).

O mecanismo exato pelo qual os cristais de cálcio danificam a cartilagem articular é desconhecido e está resumido abaixo. Teoricamente, os cristais de cálcio podem danificar diretamente os condrócitos. No entanto, o exame histológico raramente revela cristais próximos aos condrócitos e, ainda mais raramente, são ingeridos por eles. O mecanismo mais provável é a fagocitose dos cristais pelas células de revestimento sinovial, seguida pela liberação de enzimas proteolíticas ou secreção de citocinas que estimulam a liberação de enzimas pelos condrócitos. Este conceito é apoiado por um estudo sobre o papel da sinovite induzida por PFKD no desenvolvimento de osteoartrite rapidamente progressiva na artropatia por pirofosfato. Neste estudo, cristais de pirofosfato de cálcio di-hidratado (1 ou 10 mg) foram injetados semanalmente no joelho direito de coelhos com osteoartrite induzida por meniscectomia lateral parcial. Descobriu-se que, após 8 injeções, a articulação do joelho direito apresentou alterações significativamente mais graves em comparação com a esquerda. A intensidade da inflamação sinovial correlacionou-se com as injeções intra-articulares de cristais de pirofosfato de cálcio di-hidratado e sua dose. Apesar de as doses de cristais de CPPD utilizadas neste estudo excederem as in vivo, os resultados indicam o papel da inflamação induzida por CPPD na progressão da osteoartrite na artropatia por pirofosfato.

Os mecanismos potenciais de indução de danos à cartilagem articular por cristais contendo cálcio estão associados às suas propriedades mitogênicas, à capacidade de induzir MMPs e estimular a síntese de prostaglandinas.

Efeito mitogênico de cristais contendo cálcio. Em artropatias associadas a cristais, a proliferação de células de revestimento sinovial é frequentemente observada, sendo os próprios cristais apenas parcialmente responsáveis por esse processo. O aumento no número de células sinoviais é acompanhado por aumento da secreção de citocinas, que promovem a condrólise e induzem a secreção de enzimas proteolíticas. Cristais de OFC em concentrações encontradas em patologia articular humana estimulam, de forma dose-dependente, a mitogênese de culturas de fibroblastos de pele em repouso e de fibroblastos sinoviais de cães e camundongos. Cristais de pirofosfato de cálcio di-hidratado, urato, sulfato, carbonato e fosfato de cálcio estimulam o crescimento celular. O início e o pico da incorporação de ( ^3H )-timidina induzidos por esses cristais são deslocados em 3 h em comparação à estimulação de células com soro sanguíneo. Esse período de tempo pode ser necessário para a fagocitose e dissolução dos cristais. A adição de cristais de controle do mesmo tamanho (p. ex., pó de diamante ou partículas de látex) não estimulou a mitogênese. Os cristais de monoidrato de urato de sódio apresentaram propriedades mitogênicas fracas e foram significativamente inferiores aos de urato de cálcio, indicando a importância do conteúdo de cálcio dos cristais na mitogênese. Os cristais sintéticos de OFC apresentaram as mesmas propriedades mitogênicas que os cristais obtidos de pacientes com condrocalcinose. O efeito mitogênico dos cristais contendo cálcio não foi resultado de um aumento no conteúdo de cálcio do meio nutriente circundante in vitro, uma vez que a dissolução de cristais básicos de fosfato de cálcio no meio nutriente não estimulou a incorporação de ( ^3H )-timidina pelos fibroblastos.

Um mecanismo proposto para a mitogênese induzida por OFC é que a proliferação anormal de células sinoviais pode ser devida, pelo menos em parte, à endocitose e à dissolução intracelular de cristais, o que aumenta as concentrações citoplasmáticas de Ca ²⁺ e ativa a via dependente de cálcio que leva à mitogênese. Este conceito é apoiado pela necessidade de contato direto célula-cristal para estimular a mitogênese, uma vez que a exposição de culturas celulares a cristais induziu o crescimento celular, enquanto a exposição de células privadas de tal contato não o fez. Para estudar a necessidade de fagocitose de cristais após a interação célula-cristal, as células foram cultivadas com ⁴⁵ Ca-OPC e ( ^3H )-timidina. Foi descoberto que as células contendo ⁴⁵ Ca-OPC incorporaram significativamente mais ( ^3H )-timidina do que as células sem marcação com fosfato de cálcio básico. Em culturas de macrófagos, a inibição da endocitose de cristais pela citocalasina resultou na inibição da dissolução de cristais, destacando ainda mais a necessidade da fagocitose.

Cristais contendo cálcio são solúveis em ácido. Após a fagocitose, os cristais se dissolvem no ambiente ácido dos fagolisossomos dos macrófagos. Cloroquina, cloreto de amônio, bafilomicina A1 e todos os agentes lisossomos que aumentam o pH lisossomal inibem, de forma dose-dependente, a dissolução de cristais intracelulares e a captação de (3H)-timidina ^em fibroblastos cultivados com cristais básicos de fosfato de cálcio.

A adição de cristais de OFC a uma cultura de fibroblastos em monocamada causou um aumento imediato de dez vezes no cálcio intracelular, que retornou ao valor basal após 8 minutos. A fonte de cálcio foi predominantemente íon extracelular, uma vez que os cristais básicos de fosfato de cálcio foram adicionados a um meio de cultura isento de cálcio. O próximo aumento na concentração de cálcio intracelular foi observado após 60 minutos e durou pelo menos 3 horas. Neste caso, a fonte de cálcio foram cristais fagocitados dissolvidos em fagolisossomos.

Foi descoberto que o efeito mitogênico dos cristais de OFC é similar ao do PDGF como fator de crescimento; assim como este último, os cristais de OFC exibem sinergia com IGF-1 e plasma sanguíneo. O bloqueio do IGF-1 reduz a mitogênese celular em resposta ao OFC. PG Mitchell et al. (1989) demonstraram que a indução da mitogênese em fibroblastos Balb/c- ₃ T3 _por cristais de OFC requer a presença da proteína quinase C serina/treonina (PKC), um dos principais mediadores dos sinais gerados durante a estimulação externa das células com hormônios, neurotransmissores e fatores de crescimento. Uma diminuição na atividade da PKC em células Balb/c-3 T3 _{inibe a indução mediada porOFC} dos proto-oncogenes c-fos e c-myc, mas não afeta a estimulação desses oncogenes mediada por PDGF.

O aumento do cálcio intracelular após a dissolução de cristais fagocitados não é a única via de sinalização para a mitogênese. Quando fatores de crescimento como o PDGF se ligam ao seu receptor de membrana, a fosfolipase C (uma fosfodiesterase) é estimulada, hidrolisando o fosfatidilinositol 4,5-bifosfato para formar os mensageiros intracelulares inositol-3-fosfato e diacilglicerol. O primeiro libera cálcio do retículo endoplasmático modulando a atividade de enzimas dependentes de cálcio e dependentes de cálcio/calmodulina, como proteínas quinases e proteases.

R. Rothenberg e H. Cheung (1988) relataram aumento na degradação de fosfatidilinositol 4,5-bifosfato pela fosfolipase C em células sinoviais de coelho em resposta à estimulação com cristais de OFC. Este último aumentou significativamente o conteúdo de inositol-1-fosfato em células com ( ^3H )-inositol marcado; o pico foi atingido em 1 min e persistiu por cerca de 1 h.

O diacilglicerol é um potencial ativador do pirofosfato de cálcio di-hidratado. Como os cristais de OFC aumentam a atividade da fosfolipase C, o que leva ao acúmulo de diacilglicerol, consequentemente, pode-se esperar um aumento na ativação da PKC. PG Mitchell et al. (1989) compararam os efeitos dos cristais de OFC e PDGF na síntese de DNA por _{fibroblastos Balb/c-3T3}. Em cultura de células, a PKC foi inativada pela incubação de células com diéster de forbol (TPD) de suporte tumoral, um análogo do diacilglicerol. A estimulação de longo prazo com baixas doses de TPD diminuiu a atividade da PKC, enquanto uma única estimulação com uma dose alta a ativou. A estimulação da síntese de DNA por cristais de OFC foi suprimida após a inativação da PKC, indicando a importância dessa enzima na mitogênese induzida por OFC. Anteriormente, GM McCarthy et al. (1987) demonstraram uma ligação entre a resposta mitogênica de fibroblastos humanos aos cristais de OFC e a ativação da PKC. Entretanto, os cristais OFC não ativam a fosfatidilinositol 3-quinase ou as tirosina quinases, confirmando que o mecanismo de ativação celular pelos cristais OFC é seletivo.

A proliferação celular é controlada por um grupo de genes chamados proto-oncogenes. As proteínas foe e mye, produtos dos proto-oncogenes c-fos e c-myc, estão localizadas no núcleo da célula e ligadas a sequências específicas de DNA. A estimulação de fibroblastos 3T3 com cristais de OFC resulta na expressão de c-fos em poucos minutos, que atinge um máximo 30 minutos após a estimulação. A indução da transcrição de c-myc por cristais de OFC ou PDGF ocorre em 1 hora e atinge um máximo 3 horas após a estimulação. As células mantêm um nível elevado de transcrição de c-fos e c-myc por pelo menos 5 horas. Em células com PCD inativada, a estimulação de c-fos e c-myc por cristais de OFC ou TFD é significativamente suprimida, enquanto a indução desses genes por PDGF não se altera.

Membros da família da proteína quinase ativada por mitógeno (MAP K) são reguladores-chave de diversas cascatas de sinalização intracelular. Uma subclasse dessa família, p42/p44, regula a proliferação celular por meio de um mecanismo que envolve a ativação dos proto-oncogenes c-fos e c-jun. Cristais de OFC e PFKD ativam uma via de sinalização de proteína quinase que envolve tanto p42 quanto p44, sugerindo um papel para essa via na mitogênese induzida por cristais contendo cálcio.

Por fim, a mitogênese induzida por OFC envolve o fator de transcrição nuclear κB (NF-κB), que foi inicialmente descrito como o gene da cadeia leve da imunoglobulina κ (IgK). Trata-se de um fator de transcrição induzível, importante em muitas vias de sinalização, pois regula a expressão de vários genes. A indução de NF-κB geralmente está associada à liberação de proteínas inibitórias chamadas IκB do citoplasma. A indução de NF-κB é seguida pela translocação do fator de transcrição ativo para o núcleo. Cristais de OFC induzem NF-κB em fibroblastos Balb/c- _3T3 e fibroblastos de pele humana.

Várias vias podem estar envolvidas na transdução de sinal após a ativação do NF-κB, mas todas envolvem proteínas cinases que fosforilam (e, portanto, degradam) o IκB. Com base em estudos in vitro, acreditava-se anteriormente que o IκB servia como substrato para cinases (por exemplo, PKC e proteína cinase A). No entanto, um complexo de cinase IκB de grande peso molecular foi recentemente identificado. Essas cinases fosforilam especificamente resíduos de serina do IκB. A ativação do NF-κB por TNF-α e IL-1 requer a ação eficiente da cinase indutora de NF-κB (NIK) e da cinase IκB. O mecanismo molecular da ativação da NIK é atualmente desconhecido. Embora os cristais de OFC ativem tanto o PKC quanto o NF-κB, a extensão em que esses dois processos podem estar ligados é desconhecida. Como a modificação da cinase GκB ocorre via fosforilação, não se pode descartar o papel da PKC na indução de NF-κB por cristais de OFC via fosforilação e ativação da cinase GκB. Este conceito é corroborado pela inibição da mitogênese induzida por cristais de OFC e da expressão de NF-κB pelo inibidor de PKC, estaurosporina. Da mesma forma, a estaurosporina pode inibir a cinase GκB e, portanto, inibir a proteína cinase A e outras proteínas cinases.

Assim, o mecanismo de mitogênese induzida por cristais de OFC em fibroblastos inclui pelo menos dois processos diferentes:

• um evento rápido ligado à membrana que resulta na ativação de PKC e MAP K, indução de NF-κB e proto-oncogenes,
• dissolução intracelular mais lenta dos cristais, o que leva a um aumento no conteúdo intracelular de Ca ²⁺ e, então, à ativação de uma série de processos dependentes de cálcio que estimulam a mitogênese.

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Indução por cristais contendo MMP-cálcio

Os mediadores de danos aos tecidos por cristais contendo cálcio são as MMPs - colagenase-1, estromelisina, gelatinase 92 kD e colagenase-3.

Dada a relação entre o conteúdo de cristais de OFC e a destruição do tecido articular, foi levantada a hipótese de que os cristais de OFC e possivelmente alguns colágenos são fagocitados pelas células sinoviais. Sinovócitos estimulados proliferam e secretam proteases. Essa hipótese foi testada in vitro pela adição de cristais de OFC, PFCD e outros cristais naturais ou sintéticos a sinovócitos humanos ou caninos cultivados. A atividade das proteases e colagenases neutras aumentou de forma dose-dependente e foi aproximadamente 5 a 8 vezes maior do que a da cultura de células controle cultivada sem cristais.

Em células cultivadas em meio contendo cristais, foi detectada coindução de mRNA de colagenase-1, estromelisina e gelatinase-92 kDa, seguida pela secreção de enzimas no meio.

Os cristais de OFC também induziram o acúmulo de mRNA de colagenase-1 e colagenase-2 em condrócitos suínos maduros, seguido pela secreção das enzimas no meio.

GM McCarty et al. (1998) estudaram o papel da dissolução de cristais intracelulares na produção de MMP induzida por cristais. A elevação do pH lisossomal com bafilomicina A inibiu a dissolução de cristais intracelulares e também atenuou a resposta proliferativa de fibroblastos humanos aos cristais de OFC, mas não inibiu a síntese e a secreção de MMP.

Nem o fosfato de cálcio básico nem os cristais de PFCD induziram a produção de IL-1 in vitro, mas os cristais de urato de sódio o fizeram.

Dados atuais indicam claramente a estimulação direta da produção de MMP por fibroblastos e condrócitos após contato com cristais contendo cálcio.

Os sintomas da osteoartrite indicam um papel significativo das MMP na progressão da doença. A presença de cristais contendo cálcio aumenta a degeneração dos tecidos das articulações afetadas.

Estimulação da síntese de prostaglandinas

Juntamente com a estimulação do crescimento celular e da secreção de enzimas, os cristais contendo cálcio causam a liberação de prostaglandinas de culturas de células de mamíferos, especialmente PGE2 _. A liberação de PGE2 ocorre, _em todos os casos, na primeira hora após a exposição das células aos cristais. R. Rothenberg (1987) determinou que as principais fontes de ácido araquidônico para a síntese de PGE2 _são a fosfatidilcolina e a fosfatidiletanolamina, e também confirmou que a fosfolipase A2 _e a NOX são as vias dominantes para _{a produção} de PGE2.

A PGE1 também pode ser liberada em resposta a cristais de OFA. GM McCarty et al. (1993, 1994) estudaram os efeitos da PGE2 _, PGE e seu análogo misoprostol na resposta mitogênica de fibroblastos humanos a cristais de OFA. Todos os três agentes inibiram a resposta mitogênica de forma dose-dependente, com PGE e misoprostol exibindo atividade inibitória mais pronunciada. PGE2 e misoprostol, mas não PGE2 _, inibiram o acúmulo de mRNA de colagenase em resposta a cristais de OFA.

MG McCarty e H. Cheung (1994) investigaram o mecanismo de ativação celular mediada por OFC por PGE. Os autores demonstraram que a PGE, um indutor mais potente de AMPc intracelular do que a PGE2 _e a PGE, inibe a mitogênese e a produção de MMP induzidas por OFC por meio de uma via de transdução de sinal dependente de AMPc. É possível que o aumento na produção de PGE induzido por cristais de OFC enfraqueça seus outros efeitos biológicos (mitogênese e produção de MMP) por meio de um mecanismo de retroalimentação.

Inflamação induzida por cristais

Cristais contendo cálcio são frequentemente encontrados no líquido sinovial de pacientes com osteoartrose; no entanto, episódios de inflamação aguda com leucocitose são raros tanto na osteoartrose quanto em artropatias associadas a cristais (por exemplo, síndrome do ombro de Milwaukee). O potencial flogístico dos cristais pode ser modificado por uma série de fatores inibitórios. R. Terkeltaub et al. (1988) demonstraram a capacidade do soro sanguíneo e do plasma de inibir significativamente a resposta de granulócitos neutrofílicos a cristais básicos de fosfato de cálcio. Os fatores que causam tal inibição são proteínas de ligação a cristais. Um estudo de uma dessas proteínas, uma glicoproteína ₂ -HS (AHSr), mostrou que a AHSР é o inibidor mais potente e específico da resposta de granulócitos neutrofílicos a cristais de OFC. A AHSr é uma proteína sérica de origem hepática; sabe-se que, em comparação com outras proteínas séricas, é encontrada em concentrações relativamente altas no osso e no tecido mineralizante. Além disso, o AHSr está presente no líquido sinovial "não inflamado" e também foi detectado em cristais de fosfato de cálcio básico no líquido sinovial nativo. Portanto, a possibilidade de o AHSr modular o potencial flogogênico dos cristais de fosfato de cálcio básico in vivo não pode ser descartada.

Para resumir tudo o que foi dito acima, apresentamos dois esquemas de patogênese da osteoartrite propostos por WB van den Berg et al. (1999) e M. Carrabba et al. (1996), que combinam fatores mecânicos, genéticos e bioquímicos.