Diagnóstico de doenças mitocondriais

Avaliação da natureza da herança e manifestação dos sinais clínicos das doenças mitocondriais

Como as doenças miocondriais, em alguns casos, podem ser causadas por danos ao genoma nuclear, a transmissão da doença obedecerá às leis mendelianas da herança. Nos casos em que o desenvolvimento da doença é causado por mutações no DNA mitocondrial, a herança corresponderá ao tipo mitocondrial, ou seja, será transmitida pela linhagem materna. Finalmente, quando a patologia se desenvolve com danos simultâneos aos genes dos genomas nuclear e mitocondrial, a herança será complexa e determinada por vários fatores. Nesse sentido, na análise genealógica por uma característica formal (a natureza da herança de acordo com o pedigree), é possível afirmar os mais diferentes tipos de herança: autossômica dominante, autossômica recessiva, ligada ao cromossomo X, mitocondrial.

O desenvolvimento de doenças miotócondriais, como o distúrbio do metabolismo do ácido pirúvico ou a beta-oxidação de ácidos graxos, ciclo de Krebs, está associado a mutações em genes do genoma nuclear. Essas patologias são caracterizadas por herança autossômica recessiva, quando os pais são portadores de mutações (heterozigotos) e a criança é portadora de ambas as mutações herdadas do pai e da mãe (homozigoto). Os pais geralmente são aparentemente saudáveis, e uma doença semelhante ou seus microssinais devem ser procurados nos irmãos e irmãs da criança doente (irmãos probanda) e em parentes tanto do lado materno quanto do lado paterno (primos).

No caso de um tipo de herança recessiva ligada ao cromossomo X (por exemplo, acidúria glutárica neonatal tipo II ou deficiência da subunidade E1 do complexo pirúvico, doença de Menkes, etc.), os meninos são mais frequentemente afetados, e as mães são portadoras de mutações e as transmitem aos seus filhos. A herança materna difere da herança ligada ao cromossomo X, pois ambos os sexos são afetados. Nesses casos, ao analisar o heredograma, é necessário analisar a incidência da doença em homens, uma vez que ela não se manifestará em mulheres. O heredograma não mostra a transmissão da doença pela linhagem pai-filho, uma vez que o pai só pode transmitir o cromossomo Y para o filho.

Quando uma doença se desenvolve devido a danos no genoma mitocondrial (por exemplo, diversas doenças da cadeia respiratória, neuropatia óptica de Leber, síndromes MELAS, MERF, NARP, etc.), a herança materna é rastreada, uma vez que a criança herda mitocôndrias da mãe, e ela pode transmiti-las tanto para meninos quanto para meninas. Assim, ambos os sexos são igualmente afetados. Nesse sentido, a transmissão da doença ao longo da linhagem materna deve ser rastreada no heredograma.

Ao analisar uma árvore genealógica e buscar sintomas de doenças mitocondriais em parentes, deve-se lembrar que a gravidade da doença (expressividade do sinal) pode variar amplamente, o que pode ser devido ao número diferente de mitocôndrias danificadas, à natureza do dano, à distribuição diferente de mutações nas células, etc. Portanto, nem sempre é possível detectar sinais óbvios de doenças. Em alguns casos, são detectados sintomas ou sinais individuais e apagados, que podem ser detectados durante a busca direcionada.

O desenvolvimento de patologia mitocondrial pode estar associado a danos em grandes áreas das mitocôndrias, as chamadas microdeleções (por exemplo, síndrome de Kearns-Sayre, síndrome de Pearson, algumas formas de diabetes mellitus com surdez, oftalmoplegia externa progressiva, etc.). Nesses casos, os sintomas característicos muitas vezes não são encontrados em parentes, uma vez que o desenvolvimento de doenças está associado ao surgimento de novas mutações que ocorreram no zigoto imediatamente após a fertilização do óvulo ( mutação de novo ). A doença é esporádica. Muitas vezes, junto com essas doenças, uma série de condições associadas a múltiplas mutações do DNA mitocondrial são herdadas de forma autossômica dominante: por exemplo, algumas formas de encefalomiopatia, miopatia com lesão ocular, apesar da presença de mutações do mtDNA (múltiplas deleções), têm um tipo de herança autossômica dominante.

Entretanto, diferentemente da herança mendeliana, o tipo de herança autossômica dominante na patologia mitocondrial é caracterizado por um grande número de indivíduos afetados nas gerações subsequentes.

Por fim, algumas doenças mitocondriais, frequentemente associadas à depleção de mitocôndrias de mtDNA ou à sua ausência nas células, podem ser herdadas de forma autossômica recessiva. Entre elas, estão formas congênitas de miopatia, cardiomiopatia, síndrome do neurodepressão, acidose láctica, lesão hepática, etc.

O estudo da natureza da transmissão hereditária da doença é importante para o prognóstico médico e genético e requer uma análise profunda dos sinais clínicos com conhecimento dos mecanismos de formação da patologia mitocondrial e dos tipos de sua herança.

A manifestação das manifestações clínicas varia amplamente desde os primeiros dias de vida até a idade adulta. Ao analisar esse indicador, é necessário levar em consideração as formas nosológicas, visto que cada uma delas tem uma idade específica de início.

Os distúrbios metabólicos observados em doenças mitocondriais são progressivos na grande maioria dos casos. Os sintomas iniciais costumam ser leves, mas depois progridem e podem levar a distúrbios incapacitantes significativos. Formas raras de patologia, como a miopatia infantil benigna e algumas formas de neuropatia óptica de Leber, podem ser benignas e sujeitas a regressão.

Durante os exames laboratoriais, é dada atenção aos sinais característicos das doenças mitocondriais:

• presença de acidose;
• níveis elevados de lactato e piruvato no sangue, aumento do índice lactato/piruvato de mais de 15, aumentando especialmente com carga de glicose ou exercício físico;
• hipercetonemia;
• hipoglicemia;
• hiperamonemia;
• concentrações aumentadas de acetoacetato e 3-hidroxibutirato;
• aumento da proporção de ácido 3-hidroxibutírico/ácido acetoacético no sangue;
• aumento dos níveis de aminoácidos no sangue e na urina (alanina, glutamina, ácido glutâmico, valina, leucina, isoleucina);
• níveis elevados de ácidos graxos no sangue;
• hiperexcreção de ácidos orgânicos na urina;
• diminuição dos níveis de carnitina no sangue;
• aumento do conteúdo de mioglobina em fluidos biológicos;
• diminuição da atividade de enzimas mitocondriais em miócitos e fibroblastos.

O valor diagnóstico desses indicadores é maior com uma carga alimentar do que com o estômago vazio. Na prática, um teste diagnóstico tem se mostrado eficaz: a determinação do lactato no sangue em relação a uma carga de glicose, o que permite uma detecção mais precisa da falha da cadeia respiratória devido a uma carga adicional de glicose.

Para o diagnóstico laboratorial da disfunção mitocondrial e de suas formas nosológicas específicas, os métodos bioquímicos convencionais e rotineiros de pesquisa não são suficientes; é necessário realizar testes especiais. É especialmente conveniente analisar a atividade de enzimas em biópsias de músculo esquelético do que em outros tecidos. É possível determinar a atividade de enzimas da cadeia respiratória, especialmente citrato sintetase, succinato desidrogenase e citocromo C oxidase.

Dados de estudos morfológicos e genéticos moleculares

Estudos morfológicos são de particular importância no diagnóstico de patologias mitocondriais. Devido ao seu grande valor informativo, a biópsia do tecido muscular e o exame histoquímico das biópsias obtidas são frequentemente necessários. Informações importantes podem ser obtidas examinando-se o material simultaneamente por microscopia óptica e eletrônica.

Um dos marcadores importantes de doenças mitocondriais é o fenômeno das fibras vermelhas "irregulares" [fenômeno RRF (fibras vermelhas irregulares)], estabelecido em 1963. Ele está associado à formação de mitocôndrias anormais geneticamente alteradas ao longo da borda da fibra muscular devido à proliferação e ao acúmulo focal. Esse fenômeno é detectado por microscopia óptica usando uma coloração especial de Gomori, mas, nos últimos anos, diversos marcadores mitocondriais e diversos métodos imunológicos têm sido utilizados para esse fim.

Outros sinais morfológicos de patologia mitocondrial incluem:

• um aumento acentuado no tamanho das mitocôndrias;
• acúmulo de glicogênio, lipídios e conglomerados de cálcio no subsarcolema;
• diminuição da atividade das enzimas mitocondriais;
• distribuição interrompida de grânulos de atividade das enzimas succinato desidrogenase (SDH), NADH oxidorredutase, citocromo C oxidase, etc.

Em pacientes com doenças mitocondriais, a microscopia óptica do tecido muscular pode revelar sinais morfológicos inespecíficos: necrose local das fibras musculares, acúmulo de massas sarcoplasmáticas, presença de lise de áreas subsarcolemais do sarcoplasma, basofilia do sarcoplasma, aumento do número de núcleos musculares, ativação de processos de regeneração, etc.

O estudo do papel do fenômeno das fibras vermelhas "irregulares" demonstrou sua importância para o diagnóstico de condições como MELAS, MERRF, síndromes de Kearns-Sayre, oftalmoplegia progressiva crônica e outras associadas a mutações do mtDNA. Esse fenômeno pode se desenvolver em outras doenças: distrofia muscular de Duchenne, dermatomiosite, distrofia miotônica, uso de medicamentos (clofibrato) e outras condições patológicas. Assim, juntamente com doenças mitocondriais primárias, o fenômeno RRF pode acompanhar disfunções mitocondriais secundárias.

Atualmente, o exame histoquímico e microscópico eletrônico do tecido muscular para detectar sinais de insuficiência mitocondrial tornou-se amplamente difundido. Em alguns casos, auxiliam no diagnóstico, especialmente quando o quadro morfológico do tecido muscular é normal, de acordo com dados de microscopia óptica.

Sinais de microscopia eletrônica - detecção de proliferação mitocondrial, alteração de sua forma e tamanho, desorganização e aumento das cristas, acúmulo de mitocôndrias anormais sob o sarcolema, acúmulo de lipídios e inclusões paracristalinas anormais (consistindo principalmente de proteínas) ou osmofílicas localizadas entre as membranas interna e externa ou dentro das cristas, aglomerados esféricos, frequentemente localizados na matriz (consistindo principalmente de triglicerídeos), etc.

Em alguns pacientes, anormalidades citoquímicas em leucócitos podem ser detectadas.

O complexo de estudos bioquímicos e morfológicos é complementado por métodos modernos de diagnóstico molecular (detecção de mutações nucleares ou mitocondriais), realizados em laboratórios especializados em diagnóstico de DNA. Em doenças mitocondriais, vários tipos de mutações são detectados: mutações pontuais, deleções, duplicações, anomalias quantitativas de DNA, etc.

Na ausência de mutações no mtDNA, se houver suspeita de patologia mitocondrial, é realizado um estudo de DNA nuclear.

Critérios diagnósticos

Existem 2 grupos de critérios diagnósticos para doenças mitocondriais. Critérios diagnósticos principais (primeiro grupo).

• Clínico:
  • diagnósticos estabelecidos: MERRF, MELAS, NARP, MNGIE, síndromes de Pearson, neuropatia de Leber, doenças de Leigh e Alpers;
  • a presença de 2 ou uma combinação dos seguintes sinais:
    • lesão multissistêmica, patognomônica para doenças da cadeia respiratória;
    • curso progressivo com episódios de exacerbação ou presença de mutações mitocondriais na família;
    • exclusão de doenças metabólicas e outras através da realização de testes apropriados.
• Histológico - detecção do fenômeno RRF em mais de 2% do tecido muscular.
• Enzimático:
  • fibras negativas para citocromo c oxidase;
  • diminuição da atividade das enzimas do complexo da cadeia respiratória (<20% do normal no tecido, <30% nas células ou em vários tecidos).
• Funcional - diminuição na síntese de ATP em fibroblastos em mais de 3 desvios-padrão.
• Genética molecular - mutações patogeneticamente significativas do DNA nuclear ou mtDNA.

Critérios diagnósticos adicionais (segundo grupo).

• Clínico - sintomas inespecíficos que ocorrem em doenças da cadeia respiratória (natimorto, diminuição da atividade motora do feto, morte neonatal precoce, distúrbios do movimento, distúrbios do desenvolvimento, tônus muscular prejudicado no período neonatal).
• Histológico - pequena porcentagem do fenômeno RRF, acúmulo subsarcolemal de mitocôndrias ou suas anomalias.
• Enzimático - baixa atividade de enzimas do complexo respiratório (20-30% do normal no tecido, 30-40% nas células ou linhagens celulares).
• Funcional - diminuição da síntese de ATP em fibroblastos em 2-3 desvios-padrão ou ausência de crescimento de fibroblastos em meio com galactose.
• Genética molecular - detecção de mutações no DNA nuclear ou mtDNA com uma possível ligação patogênica.
• Metabólico - detecção de um ou mais metabólitos indicando uma perturbação na bioenergética celular.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]