Células estaminais e medicina plástica regenerativa

Hoje, poucos médicos em atividade desconhecem o desenvolvimento de uma nova direção no tratamento das doenças mais graves, antes incuráveis pela medicina tradicional e alternativa. Estamos falando da medicina regenerativa-plástica, baseada no uso do potencial regenerativo das células-tronco. Uma discussão científica sem precedentes e um exagero pseudocientífico surgiram em torno dessa direção em desenvolvimento, em grande parte graças às hipérboles informacionais da World Wide Web. Em muito pouco tempo, os estudos laboratoriais sobre as capacidades terapêuticas das células-tronco foram além da experimentação e começaram a ser ativamente introduzidos na medicina prática, o que deu origem a uma série de problemas de natureza científica, ética, religiosa, jurídica e legislativa. O Estado e as instituições públicas mostraram-se claramente despreparados para a velocidade da transição das células-tronco das placas de Petri para os sistemas de administração intravenosa, o que não beneficia nem a sociedade como um todo nem uma pessoa específica que sofre. Não é fácil entender a quantidade inimaginável de informações sobre as capacidades das células-tronco, tanto em quantidade quanto em qualidade, mesmo para especialistas (que não existem, já que todos estão tentando dominar a nova tendência científica por conta própria), sem mencionar os médicos que não estão diretamente envolvidos na medicina plástica regenerativa.

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Por que tais experimentos são necessários e eles são realmente necessários?

À primeira vista, a criação de quimeras interespecíficas celulares é fruto da fantasia desenfreada de um cientista fanático que se esqueceu da bioética. No entanto, foi essa abordagem que expandiu significativamente nosso conhecimento fundamental da embriogênese, uma vez que tornou possível calcular o número de células necessárias para a organogênese (a formação do fígado, cérebro, pele e órgãos do sistema imunológico). Além disso (talvez este seja o ponto principal na biologia das CTEs), os geneticistas receberam uma ferramenta única à sua disposição, com a qual a finalidade funcional dos genes pode ser estabelecida durante a quimerização de embriões. Primeiro, uma técnica especial de duplo knockout é usada para "desligar" o par de genes estudado nas CTEs. Em seguida, essas CTEs são introduzidas em um blastocisto e as mudanças que ocorrem no corpo do embrião quimérico em desenvolvimento são monitoradas. Dessa forma, foram estabelecidas as funções dos genes sf-1 (desenvolvimento da glândula adrenal e dos órgãos genitais), urt-l (desenvolvimento renal), muoD (desenvolvimento do músculo esquelético) e gata-l-4 (desenvolvimento da eritropoiese e linfopoiese). Além disso, genes humanos ainda não estudados podem ser introduzidos (transfectados) em células-tronco embrionárias de animais de laboratório para determinar sua função utilizando um embrião quimérico.

Mas, via de regra, justificar um experimento pela obtenção de novos conhecimentos fundamentais não encontra apoio entre um público amplo. Vejamos um exemplo da importância aplicada da quimerização com CTEs. Em primeiro lugar, trata-se de xenotransplante, ou seja, transplante de órgãos de animais para humanos. Teoricamente, a criação de quimeras de células humanas e suínas permite obter um animal com características antigênicas muito mais próximas do doador de CTEs, o que, em diversas situações clínicas (diabetes mellitus, cirrose hepática), pode salvar a vida de uma pessoa doente. É verdade que, para isso, precisamos primeiro aprender como restaurar a propriedade de totipotência ao genoma de uma célula somática madura, para que ela possa ser introduzida em um embrião de porco em desenvolvimento.

Atualmente, a capacidade das CTEs de se dividirem quase infinitamente sob condições especiais de cultivo é utilizada para produzir massa celular totipotente com sua subsequente diferenciação em células especializadas, como neurônios dopaminérgicos, que são então transplantadas para um paciente com doença de Parkinson. Nesse caso, o transplante é necessariamente precedido pela diferenciação direcionada da massa celular obtida em células especializadas, necessárias para o tratamento e a purificação destas últimas a partir de elementos celulares indiferenciados.

Como se descobriu mais tarde, a ameaça da carcinogênese estava longe de ser o único obstáculo ao transplante de células. Espontaneamente, as CTEs em corpos embrionários diferenciam-se heterogeneamente, ou seja, formam derivados de uma ampla variedade de linhagens celulares (neurônios, queratinócitos, fibroblastos, endotelócitos). No campo de visão do microscópio, neste caso, os cardiomiócitos se destacam entre as células de vários fenótipos, cada um dos quais se contrai em seu próprio ritmo. No entanto, para tratar um paciente, é necessário ter populações celulares puras: neurônios - em caso de acidente vascular cerebral, cardiomiócitos - em caso de infarto do miocárdio, células β do pâncreas - em caso de diabetes mellitus, queratinócitos - em caso de queimaduras, etc.

O próximo estágio no desenvolvimento da transplantologia celular foi associado ao desenvolvimento de tecnologias para obter um número suficiente (milhões de células) dessas populações de células puras. A busca por fatores que causam a diferenciação direcionada de CTEs foi de natureza empírica, uma vez que a sequência de sua síntese durante a embriogênese permaneceu desconhecida. Inicialmente, foi estabelecido que a formação do saco vitelínico é induzida pela adição de AMPc e ácido retinoico à cultura de CTEs. Linhagens de células hematopoiéticas foram formadas na presença de 1L-3, SCF, fator de crescimento de fibroblastos (FGH), fator de crescimento semelhante à insulina (IGF-1), 1L-6 e fator estimulador de colônias de granulócitos (G-СSF) no meio de cultura. Células do sistema nervoso foram formadas a partir de CTEs após a remoção do LIF e da camada de fibroblastos, que serviu como alimentador. Após o tratamento com ácido retinoico na presença de soro fetal, as CTEs começaram a se diferenciar em neurônios, e os cardiomiócitos foram obtidos pela adição de dimetilsulfóxido (DMSO), que proporciona a entrega direcionada de moléculas de sinalização hidrofóbicas ao núcleo da célula. Nesse caso, o acúmulo de espécies ativas de oxigênio no meio de cultura, bem como a estimulação elétrica, contribuíram para a formação de cardiomiócitos contráteis maduros.

Enormes esforços e recursos foram despendidos na busca de condições para a diferenciação de CTEs em células pancreáticas produtoras de insulina. No entanto, logo ficou claro que diversas linhagens celulares especializadas (células β pancreáticas, células imunes e endócrinas, adipócitos) não surgem de CTEs quando estimuladas de acordo com o princípio de "um fator estimulante - uma linhagem celular". Esse princípio se mostrou válido apenas para um número limitado de linhagens celulares. Em particular, a formação de neurônios pode ser induzida por ácido retinoico, linhagem de células musculares - pelo fator de transformação de crescimento-β (TCP-β), linhagens eritroides - 1L-6, linhagem monocítico-mieloide - 1L-3. Além disso, os efeitos desses fatores na diferenciação de CTEs se mostraram estritamente dose-dependentes.

Iniciou-se a etapa de busca por combinações de fatores de crescimento que levariam as CTEs a estágios posteriores da embriogênese, com a formação do mesoderma (fonte de cardiomiócitos, músculos esqueléticos, epitélio dos túbulos renais, mieloeritropoiese e células musculares lisas), ectoderma (epiderme, neurônios, retina) e endoderma (epitélio do intestino delgado e glândulas secretoras, pneumócitos). A natureza parecia forçar os pesquisadores a avançar no caminho da embriogênese, repetindo seus estágios em uma placa de Petri, sem a possibilidade de obter o resultado desejado de forma imediata e fácil. E tais combinações de fatores de crescimento foram encontradas. A activina A, em combinação com o TGF-β, revelou-se um potente estimulador da formação de células mesodérmicas a partir das CTEs, enquanto bloqueava o desenvolvimento do endoderma e do ectoderma. O ácido retinoico e uma combinação de sinais da proteína morfogenética da medula óssea (BMP-4) e do fator de crescimento epidérmico (EGF) ativam a formação de células ecto e mesodermas, interrompendo o desenvolvimento do endoderma. Observa-se um crescimento celular intensivo de todas as três camadas germinativas com o efeito simultâneo de dois fatores nas CTEs: o fator de crescimento dos hepatócitos (HGF) e o fator de crescimento das células nervosas.

Assim, para obter as linhagens celulares necessárias, é necessário primeiro transferir células-tronco embrionárias para a fase de formação de células de alguma camada germinativa e, em seguida, selecionar uma nova combinação de fatores de crescimento capaz de induzir a diferenciação direcionada do ectoderma, mesoderma e endoderma em células especializadas necessárias para o transplante no paciente. O número de combinações de fatores de crescimento hoje é de milhares, a maioria delas patenteada, algumas não divulgadas por empresas de biotecnologia.

Era hora de purificar as células obtidas das impurezas celulares indiferenciadas. As células diferenciadas na cultura foram marcadas com marcadores de linhagens celulares maduras e passadas por um classificador imunofenotípico a laser de alta velocidade. O feixe de laser as encontrou no fluxo celular geral e as direcionou por um caminho separado. Animais de laboratório foram os primeiros a receber o material celular purificado obtido. Era hora de avaliar a eficácia do uso de derivados de CTEs em modelos de doenças e processos patológicos. Um desses modelos foi a doença de Parkinson experimental, que é bem reproduzida em animais usando compostos químicos que destroem neurônios dopaminérgicos. Como a doença em humanos é baseada em uma deficiência adquirida de neurônios dopaminérgicos, o uso de terapia de reposição celular neste caso foi patogeneticamente justificado. Em animais com hemiparkinsonismo experimental, cerca de metade dos neurônios dopaminérgicos obtidos de CTEs e introduzidos nas estruturas cerebrais criaram raízes. Isso foi suficiente para reduzir significativamente as manifestações clínicas da doença. Tentativas de restaurar a função de estruturas danificadas do SNC em acidentes vasculares cerebrais experimentais, lesões e até mesmo rupturas da medula espinhal têm se mostrado bastante bem-sucedidas.

No entanto, deve-se notar que quase todos os casos de uso bem-sucedido de derivados de ESC diferenciados para correção de patologia experimental foram realizados no período agudo da situação patológica simulada. Os resultados do tratamento remoto não foram tão reconfortantes: após 8 a 16 meses, o efeito positivo do transplante de células desapareceu ou diminuiu drasticamente. As razões para isso são bastante claras. A diferenciação de células transplantadas in vitro ou in loco morbi leva inevitavelmente à expressão de marcadores celulares de estranheza genética, o que provoca um ataque imunológico do corpo do receptor. Para resolver o problema da incompatibilidade imunológica, foi utilizada a imunossupressão tradicional, paralelamente à qual os ensaios clínicos começaram a perceber o potencial da transdiferenciação e correção genética de células-tronco hematopoiéticas e mesenquimais autólogas que não causam um conflito imunológico.

O que é medicina plástica regenerativa?

A evolução determinou duas opções principais para o fim da vida de uma célula - necrose e apoptose, que no nível do tecido correspondem aos processos de proliferação e regeneração. A proliferação pode ser considerada uma espécie de sacrifício, quando o preenchimento do defeito do tecido danificado ocorre devido à sua substituição por elementos do tecido conjuntivo: embora mantendo a integridade estrutural, o corpo perde parcialmente a função do órgão afetado, o que determina o desenvolvimento subsequente de reações compensatórias com hipertrofia ou hiperplasia dos elementos estruturais e funcionais que permanecem intactos. A duração do período de compensação depende do volume de lesões estruturais causadas pelos fatores de alteração primária e secundária, após o que, na grande maioria dos casos, ocorre a descompensação, uma deterioração acentuada na qualidade e redução na duração da vida humana. A regeneração fisiológica garante processos de remodelação, ou seja, a substituição de células envelhecidas e moribundas pelos mecanismos de morte celular natural (apoptose) por novas originárias das reservas de células-tronco do corpo humano. Os processos de regeneração reparadora também envolvem os recursos celulares dos espaços-tronco, que, no entanto, são mobilizados em condições patológicas associadas à doença ou dano tecidual, iniciando a morte celular por mecanismos de necrose.

A grande atenção de cientistas, médicos, imprensa, televisão e público em geral ao problema do estudo da biologia das células-tronco embrionárias (CTE) deve-se, em primeiro lugar, ao alto potencial da terapia celular ou, como a chamamos, regenerativa-plástica. O desenvolvimento de métodos para o tratamento das doenças humanas mais graves (patologias degenerativas do sistema nervoso central, lesões da medula espinhal e do cérebro, doenças de Alzheimer e Parkinson, esclerose múltipla, infarto do miocárdio, hipertensão arterial, diabetes mellitus, doenças autoimunes e leucemia, doenças de queimaduras e processos neoplásicos constituem uma lista longe de completa) baseia-se nas propriedades únicas das células-tronco, que permitem a criação de novos tecidos para substituir, como se acreditava anteriormente, áreas de tecido irreversivelmente danificadas de um organismo doente.

O progresso da pesquisa teórica em biologia de células-tronco nos últimos 10 anos tem sido impulsionado por áreas emergentes espontâneas da medicina regenerativa-plástica, cuja metodologia não só é bastante passível de sistematização, como também a requer. A primeira e mais rápida área de aplicação prática do potencial regenerativo das células-tronco tornou-se a terapia regenerativa-plástica de substituição. Seu caminho é facilmente traçado na literatura científica – desde experimentos em animais com necrose miocárdica até os trabalhos dos últimos anos voltados para a restauração da deficiência de cardiomiócitos pós-infarto ou para a reposição da perda de células β do pâncreas e neurônios dopaminérgicos do sistema nervoso central.

Transplante de células

A base da medicina plástica regenerativa substitutiva é o transplante de células. Este último deve ser definido como um complexo de medidas médicas, durante o qual o corpo do paciente tem contato direto com células viáveis de origem auto, alo, iso ou xenogênica por um curto ou longo período de tempo. O meio de transplante de células é uma suspensão de células-tronco ou seus derivados, padronizada pelo número de unidades de transplante. Uma unidade de transplante é a razão entre o número de unidades formadoras de colônias na cultura e o número total de células transplantadas. Métodos de transplante de células: administração intravenosa, intraperitoneal, subcutânea de uma suspensão de células-tronco ou seus derivados; administração de uma suspensão de células-tronco ou seus derivados nos ventrículos do cérebro, vasos linfáticos ou líquido cefalorraquidiano.

O transplante alogênico e autólogo de células emprega duas abordagens metodológicas fundamentalmente diferentes para a implementação do potencial pluripotente, multipotente ou polipotente das células-tronco - in vivo ou in vitro. No primeiro caso, a introdução de células-tronco no corpo do paciente é realizada sem sua diferenciação preliminar; no segundo, após reprodução em cultura, diferenciação direcionada e purificação de elementos indiferenciados. Entre as inúmeras técnicas metodológicas de terapia de substituição celular, três grupos de métodos são claramente distinguidos: substituição de medula óssea e células sanguíneas, substituição de células de órgãos e tecidos moles e substituição de elementos rígidos e sólidos do corpo (cartilagem, osso, tendões, válvulas cardíacas e vasos capacitivos). Esta última direção deve ser definida como medicina reconstrutiva e regenerativa, uma vez que o potencial de diferenciação das células-tronco é realizado em uma matriz - uma estrutura biologicamente inerte ou absorvível com o formato da área substituída do corpo.

Outra forma de aumentar a intensidade dos processos regenerativos-plásticos em tecidos danificados é mobilizar os recursos-tronco do próprio paciente, utilizando fatores de crescimento exógenos, como fatores estimuladores de colônias de granulócitos e granulócitos-macrófagos. Nesse caso, a ruptura das conexões estromais leva a um aumento na liberação de células-tronco hematopoiéticas na corrente sanguínea geral, que, na área de dano tecidual, proporcionam processos de regeneração devido à sua plasticidade inerente.

Assim, os métodos da medicina regenerativa visam estimular os processos de restauração da função perdida - seja pela mobilização das reservas do tronco do próprio paciente, seja pela introdução de material celular alogênico.

Um importante resultado prático da descoberta das células-tronco embrionárias é a clonagem terapêutica, baseada na compreensão dos gatilhos da embriogênese. Se o sinal inicial para o início da embriogênese for o complexo pré-mRNA localizado no citoplasma do oócito, a introdução do núcleo de qualquer célula somática no óvulo enucleado deve desencadear o programa de desenvolvimento embrionário. Hoje, sabemos que cerca de 15.000 genes participam da implementação do programa de embriogênese. O que acontece com eles posteriormente, após o nascimento, durante os períodos de crescimento, maturidade e envelhecimento? A resposta a essa pergunta foi dada pela ovelha Dolly: eles são preservados. Utilizando os métodos de pesquisa mais modernos, comprovou-se que os núcleos das células adultas retêm todos os códigos necessários para a formação de células-tronco embrionárias, folhetos germinativos, organogênese e maturação de restrição (saída para diferenciação e especialização) de linhagens celulares de origem mesenquimal, ecto, endo e mesodérmica. A clonagem terapêutica como uma direção foi formada já nos estágios iniciais do desenvolvimento da transplantologia celular e prevê o retorno da totipotência às células somáticas do próprio paciente para obter material de transplante geneticamente idêntico.

A descoberta das células-tronco começou "do fim", já que o termo introduzido na biologia e na medicina por A. Maksimov se referia às células-tronco da medula óssea, que dão origem a todos os elementos celulares maduros do sangue periférico. No entanto, as células-tronco hematopoiéticas, como as células de todos os tecidos de um organismo adulto, também têm seu próprio predecessor, menos diferenciado. A fonte comum para absolutamente todas as células somáticas é a célula-tronco embrionária. Deve-se notar que os conceitos de "células-tronco embrionárias" e "células-tronco embrionárias" não são de forma alguma idênticos. As células-tronco embrionárias foram isoladas por J. Thomson da massa celular interna do blastocisto e transferidas para linhagens celulares de longa duração. Somente essas células têm um fac-símile de "CTE". Leroy Stevens, que descobriu as células-tronco embrionárias em experimentos com camundongos, as chamou de "células-tronco pluripotentes embrionárias", referindo-se à capacidade das CTE de se diferenciarem em derivados de todas as três camadas germinativas (ecto, meso e endoderma). No entanto, todas as células do embrião em estágios posteriores de desenvolvimento também são células-tronco, visto que dão origem a um grande número de células que formam o corpo de um adulto. Para defini-las, propomos o termo “células progenitoras pluripotentes embrionárias”.

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Tipos de células-tronco

A classificação moderna das células-tronco baseia-se no princípio de sua divisão por sua capacidade (potência) de dar origem a linhagens celulares, que é definida como toti-, pluri-, multi-, poli-, bi- e unipotência. A totipotência, ou seja, a capacidade de recriar um organismo geneticamente programado como um todo, é possuída por células zigóticas, blastômeros e células-tronco embrionárias (células da massa interna do blastocisto). Outro grupo de células totipotentes, que são formadas em estágios posteriores do desenvolvimento embrionário, é representado por células germinativas primárias da zona genital embrionária (tubérculos genitais). A pluripotência, que é a capacidade de se diferenciar em células de qualquer órgão ou tecido, é inerente às células embrionárias das três camadas germinativas - ecto-, meso- e endoderme. Acredita-se que a multipotência, ou seja, a capacidade de formar quaisquer células dentro de uma linhagem especializada, seja característica de apenas dois tipos de células: as chamadas células-tronco mesenquimais, que são formadas na crista neural e são as precursoras de todas as células da base do tecido conjuntivo do corpo, incluindo as células da neuróglia, bem como as células-tronco hematopoiéticas hematopoiéticas, que dão origem a todas as linhagens de células sanguíneas. Além disso, distinguem-se células-tronco bi e unipotentes, em particular, as células precursoras dos brotos hematopoiéticos mieloides, linfoides, monocíticos e megacariocíticos. A existência de células-tronco unipotentes foi claramente comprovada usando o exemplo das células hepáticas - a perda de uma parte significativa do tecido hepático é compensada pela divisão intensiva de hepatócitos poliploides diferenciados.

Durante o desenvolvimento, todos os órgãos e tecidos são formados como resultado da proliferação e diferenciação da massa celular interna do blastocisto, cujas células são, em sentido estrito, células-tronco embrionárias totipotentes. O primeiro trabalho sobre o isolamento de células-tronco embrionárias foi realizado por Evans, que demonstrou que blastocistos implantados no cérebro de camundongos dão origem a teratocarcinomas, cujas células, quando clonadas, formam linhagens de células-tronco embrionárias pluripotentes (o nome original dessas células - células de carcinoma embrionário ou, na abreviação, ECС - não é usado atualmente). Esses dados foram confirmados em vários outros estudos nos quais células-tronco embrionárias foram obtidas por meio do cultivo de células de blastocisto de camundongos e outras espécies animais, bem como de humanos.

Nos últimos anos, a literatura tem relatado cada vez mais sobre a plasticidade das células-tronco, que é considerada não apenas como a capacidade destas últimas de se diferenciarem em diferentes tipos de células em diferentes estágios de desenvolvimento, mas também de sofrerem desdiferenciação (transdiferenciação, retrodiferenciação). Ou seja, admite-se a possibilidade fundamental de uma célula somática diferenciada retornar ao estágio de desenvolvimento embrionário com recapitulação (retorno) da pluripotência e sua implementação em diferenciação repetida com a formação de células de um tipo diferente. Em particular, relata-se que as células-tronco hematopoiéticas são capazes de transdiferenciação com a formação de hepatócitos, cardiomioblastos e endotelócitos.

Os debates científicos sobre a divisão das células-tronco de acordo com sua plasticidade continuam, ou seja, a terminologia e o glossário do transplante de células estão em processo de formação, o que tem significado prático direto, uma vez que a maioria dos métodos de medicina plástica regenerativa se baseia no uso das propriedades plásticas e na capacidade das células-tronco de se diferenciarem em várias linhagens celulares.

O número de publicações na área de problemas fundamentais e aplicados da medicina regenerativa-plástica está aumentando rapidamente. Uma gama de diferentes abordagens metodológicas voltadas para o uso mais otimizado do potencial regenerativo-plástico das células-tronco já foi delineada. Cardiologistas e endocrinologistas, neurologistas e neurocirurgiões, transplantologistas e hematologistas identificaram suas áreas de interesse urgente. Oftalmologistas, tisiologistas, pneumologistas, nefrologistas, oncologistas, geneticistas, pediatras, gastroenterologistas, terapeutas e pediatras, cirurgiões e obstetras-ginecologistas buscam uma solução para problemas urgentes na capacidade plástica das células-tronco – todos os representantes da medicina moderna esperam ter a oportunidade de curar doenças que antes eram consideradas fatais.

O transplante de células é a próxima “cura para tudo”?

Esta questão surge, com razão, entre todos os médicos e cientistas ponderados que analisam o estado atual da ciência médica. A situação é complicada pelo fato de que, de um lado do campo do confronto científico, estão os "conservadores saudáveis" e, do outro, os "fanáticos doentios" da transplantologia celular. Obviamente, a verdade, como sempre, está entre eles – na "terra de ninguém". Sem abordar questões de direito, ética, religião e moralidade, consideremos os prós e os contras das áreas designadas da medicina regenerativa-plástica. A "brisa leve" dos primeiros relatórios científicos sobre as possibilidades terapêuticas das CCEs transformou-se num "vento forte" um ano após a sua descoberta, que se transformou num "tornado de informação" em 2003. A primeira série de publicações abordou as questões do cultivo de células-tronco embrionárias, sua reprodução e diferenciação dirigida in vitro.

Descobriu-se que, para a reprodução ilimitada de células-tronco embrionárias em cultura, é necessário observar rigorosamente uma série de condições. Três fatores devem estar presentes no meio condicionado: interleucina-6 (IL-6), fator de célula-tronco (SCF) e fator inibidor de leucase (LIF). Além disso, as células-tronco embrionárias devem ser cultivadas em um substrato (camada de alimentação de células) de fibroblastos embrionários e na presença de soro fetal bovino. Se essas condições forem atendidas, as CTEs em cultura crescem como clones e formam corpos embrionários - agregados de clones em suspensão de células esféricas. A característica mais importante do clone de CTE é que, em cultura, o corpo embrionário para de crescer quando 50-60, no máximo 100 células se acumulam no agregado. Durante esse período, ocorre um estado de equilíbrio - a taxa de divisão celular dentro do clone é igual à taxa de apoptose (morte celular programada) em sua periferia. Após atingir esse equilíbrio dinâmico, as células periféricas do corpo embrionário sofrem diferenciação espontânea (geralmente com a formação de fragmentos endodérmicos do saco vitelínico, angioblastos e endotelócitos), com perda de totipotência. Portanto, para obter uma quantidade suficiente de massa celular totipotente, o corpo embrionário deve ser desagregado semanalmente com o transplante de células-tronco embrionárias individuais para um novo meio nutriente – um processo bastante trabalhoso.

A descoberta das células-tronco embrionárias não respondeu à questão sobre o que exatamente e como desencadeia os programas de embriogênese criptografados no DNA do zigoto. Ainda não está claro como o programa do genoma se desenvolve durante a vida humana. Ao mesmo tempo, o estudo das células-tronco embrionárias tornou possível desenvolver um conceito dos mecanismos para manter a toti-, pluri- e multipotência das células-tronco durante sua divisão. A principal característica distintiva de uma célula-tronco é sua capacidade de se autorreproduzir. Isso significa que uma célula-tronco, diferentemente de uma célula diferenciada, se divide assimetricamente: uma das células-filhas dá origem a uma linhagem celular especializada, e a segunda retém a toti-, pluri- ou multipotência do genoma. Ainda não está claro por que e como esse processo ocorre nos estágios iniciais da embriogênese, quando a massa celular interna em divisão do blastocisto é inteiramente totipotente e o genoma da ESC está em um estado dormente (adormecido, inibido). Se durante a divisão de uma célula comum o processo de duplicação é necessariamente precedido pela ativação e expressão de todo um complexo de genes, então durante a divisão das CTE isso não acontece. A resposta à pergunta "por quê" foi obtida após a descoberta de mRNA preexistente (pré-mRNA) nas CTE, alguns dos quais são formados em células foliculares e armazenados no citoplasma do óvulo e do zigoto. A segunda descoberta respondeu à pergunta "como": enzimas especiais chamadas "editases" foram encontradas nas CTE. As editases desempenham três funções importantes. Primeiramente, elas fornecem leitura e duplicação epigenética alternativa (sem a participação do genoma) do pré-mRNA. Em segundo lugar, elas implementam o processo de ativação do pré-mRNA (splicing - corte de íntrons, ou seja, seções inativas de RNA que inibem o processo de síntese proteica no mRNA), após o qual a montagem das moléculas de proteína começa na célula. Em terceiro lugar, as editases promovem a formação de mRNAs secundários, que são repressores dos mecanismos de expressão gênica, o que mantém o denso empacotamento da cromatina e o estado inativo dos genes. Produtos proteicos sintetizados em tais mRNAs secundários e chamados proteínas silenciadoras ou guardiãs do genoma estão presentes em óvulos humanos.

É assim que o mecanismo de formação de linhagens celulares imortais de células-tronco embrionárias é apresentado hoje. Simplificando, o sinal para iniciar o programa de embriogênese, cujos estágios iniciais consistem na formação de uma massa celular totipotente, vem do citoplasma do óvulo. Se, nesse estágio, a massa celular interna do blastocisto, ou seja, as células-tronco embrionárias (CES), for isolada de outros sinais regulatórios, o processo de autorreprodução celular ocorre em um ciclo fechado, sem a participação dos genes do núcleo celular (epigeneticamente). Se tal célula for suprida com material nutriente e isolada de sinais externos que promovam a diferenciação da massa celular, ela se dividirá e reproduzirá sua própria espécie indefinidamente.

Os primeiros resultados de tentativas experimentais de usar células totipotentes para transplante foram bastante impressionantes: a introdução de células-tronco embrionárias em tecidos de camundongos com sistema imunológico enfraquecido por imunossupressores levou ao desenvolvimento de tumores em 100% dos casos. Entre as células neoplásicas, cuja fonte eram as CTEs, havia derivados diferenciados do material celular exógeno totipotente, em particular neurônios, mas o crescimento de teratocarcinomas reduziu a zero o valor dos resultados obtidos. Ao mesmo tempo, nos trabalhos de L. Stevens, as CTEs introduzidas na cavidade abdominal formaram grandes agregados nos quais músculos embrionários, coração, cabelo, pele, ossos, músculos e tecido nervoso foram formados fragmentariamente. (Cirurgiões que abriram cistos dermoides devem estar familiarizados com este quadro). Curiosamente, células embrioblásticas suspensas de camundongos se comportam exatamente da mesma maneira: sua introdução nos tecidos de animais adultos imunocomprometidos sempre causa a formação de teratocarcinomas. Mas se uma linha pura de CCEs for isolada de tal tumor e introduzida na cavidade abdominal, então novamente derivados somáticos especializados de todas as três camadas germinativas são formados sem sinais de carcinogênese.

Assim, o próximo problema a ser resolvido era purificar o material celular das impurezas de células indiferenciadas. No entanto, mesmo com uma eficiência muito alta de diferenciação celular direcionada, até 20% das células em cultura retêm seu potencial totipotente, o que, in vivo, infelizmente, se concretiza no crescimento tumoral. Outro "estilingue" da natureza: na escala do risco médico, a garantia da recuperação do paciente se equilibra com a garantia de sua morte.

A relação entre células tumorais e células progenitoras pluripotentes embrionárias (EPPCs), que apresentam desenvolvimento mais avançado do que as CTEs, é bastante ambígua. Os resultados de nossos estudos demonstraram que a introdução de EPPCs em diversos tumores transplantáveis em ratos pode levar à desintegração do tecido tumoral (G), a um rápido aumento da massa tumoral (D), à sua redução (E-3) ou não afeta o tamanho da necrose focal central espontânea do tecido neoplásico (I, K). É óbvio que o resultado da interação entre EPPCs e células tumorais é determinado pelo conjunto total de citocinas e fatores de crescimento produzidos por elas in vivo.

É digno de nota que as células-tronco embrionárias, respondendo com carcinogênese ao contato com tecidos adultos, são perfeitamente assimiladas à massa celular do embrião, integrando-se a todos os órgãos do embrião. Tais quimeras, constituídas pelas próprias células do embrião e pelas CTEs do doador, são chamadas de animais alofênicos, embora, na verdade, não sejam quimeras fenotípicas. O sistema hematopoiético, a pele, o tecido nervoso, o fígado e o intestino delgado sofrem quimerização celular máxima quando CTEs são introduzidas em um embrião em estágio inicial. Casos de quimerização dos genitais já foram descritos. A única zona inviolável para CTEs são as células germinativas primárias.

Ou seja, o embrião retém a informação genética de seus pais, o que protege a pureza e a continuação tanto do gênero quanto da espécie.

Em condições de bloqueio da divisão celular do embrião inicial com citoclazina, a introdução de células-tronco embrionárias no blastocisto leva ao desenvolvimento de um embrião cujas células germinativas primárias, como todas as outras, foram formadas a partir de células-tronco embrionárias do doador. Mas, neste caso, o próprio embrião é completamente doador, geneticamente alheio ao corpo da mãe de aluguel. Os mecanismos desse bloqueio natural do potencial de mistura de informações hereditárias próprias e alheias ainda não foram esclarecidos. Pode-se presumir que, neste caso, o programa de apoptose se concretiza, cujos determinantes ainda não conhecemos.

Deve-se notar que a embriogênese de animais de diferentes espécies nunca é coordenada: ao implementar o programa de organogênese do doador no corpo do embrião receptor de células-tronco embrionárias xenogênicas, o embrião morre no útero e é reabsorvido. Portanto, a existência de quimeras "rato-camundongo", "porco-vaca", "humano-rato" deve ser entendida como mosaicismo celular, mas não como mosaicismo morfológico. Em outras palavras, quando CCEs de uma espécie de mamífero são introduzidas no blastocisto de outra espécie, sempre se desenvolvem descendentes da espécie materna, nos quais, entre suas próprias células de quase todos os órgãos, são encontradas inclusões e, às vezes, aglomerados de unidades estruturais e funcionais constituídas por material geneticamente estranho de derivados de CCEs. O termo "porco humanizado" não pode ser entendido como uma designação para algum tipo de monstro dotado de inteligência ou características externas de um humano. Trata-se apenas de um animal cujas células corporais se originam de CCEs humanas introduzidas no blastocisto de um porco.

Perspectivas para o uso de células-tronco

Há muito se sabe que doenças associadas à genopatologia de células da linhagem hematopoiética e linfoide são frequentemente eliminadas após o transplante alogênico de medula óssea. A substituição do próprio tecido hematopoiético por células geneticamente normais de um doador aparentado leva à recuperação parcial e, às vezes, completa do paciente. Entre as doenças genéticas tratadas com transplante alogênico de medula óssea, destacam-se a síndrome da imunodeficiência combinada (SIDA), a agamaglobulinemia ligada ao cromossomo X, a granulomatose crônica, a síndrome de Wiskott-Aldrich, as doenças de Gaucher e Hurler, a adrenoleucodistrofia, a leucodistrofia metacromática, a anemia falciforme, a talassemia, a anemia de Fanconi e a AIDS. O principal problema no uso do transplante alogênico de medula óssea no tratamento dessas doenças está associado à seleção de um doador aparentado compatível com HbA, para cuja busca bem-sucedida são necessárias, em média, 100.000 amostras de tecido hematopoiético do doador tipificado.

A terapia gênica permite corrigir um defeito genético diretamente nas células-tronco hematopoiéticas do paciente. Teoricamente, a terapia gênica oferece as mesmas vantagens no tratamento de doenças genéticas do sistema hematopoiético que o transplante alogênico de medula óssea, mas sem todas as possíveis complicações imunológicas. No entanto, isso requer uma técnica que permita a transferência efetiva de um gene completo para as células-tronco hematopoiéticas e a manutenção do nível necessário de sua expressão, que em certos tipos de patologia hereditária pode não ser muito alto. Nesse caso, mesmo uma ligeira reposição do produto proteico do gene deficiente produz um efeito clínico positivo. Em particular, na hemofilia B, 10-20% do nível normal de fator IX é suficiente para restaurar o mecanismo interno de coagulação sanguínea. A modificação genética de material celular autólogo provou ser bem-sucedida no hemiparkinsonismo experimental (destruição unilateral de neurônios dopaminérgicos). A transfecção de fibroblastos embrionários de ratos com um vetor retroviral contendo o gene da tirosina hidroxilase garantiu a síntese de dopamina no sistema nervoso central: a administração intracerebral de fibroblastos transfectados reduziu drasticamente a intensidade das manifestações clínicas de um modelo experimental da doença de Parkinson em animais experimentais.

A perspectiva de usar células-tronco para terapia gênica de doenças humanas tem apresentado muitos novos desafios para clínicos e pesquisadores. Os aspectos problemáticos da terapia gênica estão associados ao desenvolvimento de um sistema seguro e eficaz para o transporte de genes para a célula-alvo. Atualmente, a eficiência da transferência gênica para células de grandes mamíferos é muito baixa (1%). Metodicamente, esse problema é resolvido de várias maneiras. A transferência gênica in vitro envolve a transfecção de material genético para células do paciente em cultura, com seu subsequente retorno ao corpo do paciente. Essa abordagem deve ser reconhecida como ideal ao usar genes introduzidos em células-tronco da medula óssea, uma vez que os métodos para transferência de células hematopoiéticas do corpo para a cultura e vice-versa estão bem estabelecidos. Os retrovírus são mais frequentemente usados para transferência gênica para células hematopoiéticas in vitro. No entanto, a maior parte das células-tronco hematopoiéticas está em estado dormente, o que complica o transporte de informação genética usando retrovírus e requer a busca por novas formas eficazes de transporte gênico para células-tronco dormentes. Atualmente, são utilizados métodos de transferência gênica como transfecção, microinjeção direta de DNA em células, lipofecção, eletroporação, "gene gun", acoplamento mecânico com esferas de vidro, transfecção de hepatócitos com acoplamento de DNA dependente de receptor à asialoglicoproteína e introdução do transgene por aerossol nas células do epitélio alveolar pulmonar. A eficiência da transferência de DNA por esses métodos é de 10,0 a 0,01%. Em outras palavras, dependendo do método de introdução da informação genética, pode-se esperar sucesso em 10 pacientes em 100 ou em 1 paciente em 10.000 pacientes. É óbvio que um método eficaz e, ao mesmo tempo, seguro para a transferência de genes terapêuticos ainda não foi desenvolvido.

Uma solução fundamentalmente diferente para o problema da rejeição de material celular alogênico em transplantes celulares é o uso de altas doses de células progenitoras pluripotentes embrionárias para alcançar o efeito de reinstalação do sistema de controle da homeostase antigênica de um organismo adulto (o efeito Kukharchuk-Radchenko-Sirman), cuja essência reside na indução de tolerância imunológica pela criação de uma nova base de células imunocompetentes com reprogramação simultânea do sistema de controle da homeostase antigênica. Após a introdução de altas doses de EPPC, estas últimas são fixadas nos tecidos do timo e da medula óssea. No timo, as EPPC, sob a influência de um microambiente específico, diferenciam-se em células dendríticas, células interdigitais e elementos epiteliais-estromais. Durante a diferenciação de EPPCs no timo do receptor, juntamente com as moléculas do próprio receptor do complexo principal de histocompatibilidade (MHC), são expressas moléculas de MHC geneticamente determinadas nas células do doador, ou seja, é estabelecido um padrão duplo de moléculas de MHC, de acordo com o qual é realizada a seleção positiva e negativa de linfócitos T.

Assim, a renovação do elo efetor do sistema imunológico do receptor ocorre por meio dos mecanismos conhecidos de seleção positiva e negativa dos linfócitos T, mas por meio do duplo padrão das moléculas do MHC - as EPPCs do receptor e do doador.

A reprogramação do sistema imunológico por meio da EPPC não apenas permite o transplante de células sem o uso prolongado de imunossupressores, como também abre perspectivas completamente novas no tratamento de doenças autoimunes e fornece uma base para o desenvolvimento de novas ideias sobre o processo de envelhecimento humano. Para compreender os mecanismos do envelhecimento, propomos uma teoria da depleção dos espaços-tronco do corpo. De acordo com a principal premissa dessa teoria, o envelhecimento é uma redução permanente no tamanho dos espaços-tronco do corpo, que são entendidos como um conjunto de células-tronco regionais ("adultas") (células-tronco mesenquimais, neuronais, hematopoiéticas, células progenitoras da pele, trato digestivo, epitélio endócrino, células pigmentares das pregas ciliares, etc.), que repõem as perdas celulares do tecido correspondente no processo de remodelação corporal. A remodelação corporal é a renovação da composição celular de todos os tecidos e órgãos devido às células-tronco, que continua ao longo da vida de um organismo multicelular. O número de células nos espaços-tronco é determinado geneticamente, o que determina o tamanho limitado (potencial proliferativo) de cada espaço-tronco. Por sua vez, o tamanho dos espaços-tronco determina a taxa de envelhecimento de órgãos, tecidos e sistemas corporais individuais. Após o esgotamento das reservas celulares dos espaços-tronco, a intensidade e a taxa de envelhecimento de um organismo multicelular são determinadas pelos mecanismos de envelhecimento das células somáticas diferenciadas dentro do limite de Hayflick.

Portanto, na fase de ontogênese pós-natal, a expansão dos espaços-tronco pode não apenas aumentar significativamente a expectativa de vida, mas também melhorar a qualidade de vida, restaurando o potencial de remodelação do corpo. A expansão dos espaços-tronco pode ser alcançada pela introdução de grandes doses de células progenitoras pluripotentes embrionárias alogênicas, desde que o sistema imunológico do receptor seja reprogramado simultaneamente, o que aumenta significativamente a expectativa de vida de camundongos idosos no experimento.

A teoria da depleção do espaço-tronco pode mudar as ideias existentes não apenas sobre os mecanismos do envelhecimento, mas também sobre a doença, bem como as consequências de seu tratamento induzido por medicamentos. Em particular, a doença pode se desenvolver como resultado de patologia das células do espaço-tronco (oncopatologia). A depleção da reserva de células-tronco mesenquimais interrompe os processos de remodelação do tecido conjuntivo, o que leva ao aparecimento de sinais externos de envelhecimento (rugas, flacidez da pele, celulite). A depleção da reserva-tronco das células endoteliais causa o desenvolvimento de hipertensão arterial e aterosclerose. O tamanho inicialmente pequeno do espaço-tronco do timo determina sua involução permanente precoce relacionada à idade. O envelhecimento prematuro é uma consequência da diminuição patológica inicial no tamanho de todos os espaços-tronco do corpo. A estimulação medicamentosa e não medicamentosa das reservas de células-tronco melhora a qualidade de vida, reduzindo sua duração, uma vez que reduz o tamanho dos espaços-tronco. A baixa eficiência dos geroprotetores modernos se deve ao seu efeito protetor nas células somáticas diferenciadas envelhecidas, e não nos espaços-tronco do corpo.

Concluindo, gostaríamos de ressaltar mais uma vez que a medicina regenerativa-plástica representa uma nova direção no tratamento de doenças humanas, baseada no uso do potencial regenerativo-plástico das células-tronco. Entende-se, nesse caso, plasticidade como a capacidade de células-tronco exógenas ou endógenas se implantarem e darem origem a novos brotos celulares especializados em áreas danificadas do tecido de um organismo doente. A medicina regenerativa-plástica tem como objeto doenças humanas fatais atualmente incuráveis, patologias hereditárias, doenças nas quais os métodos da medicina tradicional alcançam apenas um efeito sintomático, bem como defeitos anatômicos do corpo, cuja restauração é o objetivo da cirurgia regenerativa reconstrutiva-plástica. Em nossa opinião, é muito cedo para considerar as primeiras tentativas de recriar órgãos inteiros e funcionalmente completos a partir de células-tronco como uma área separada da medicina prática. O tema da medicina regenerativa-plástica são as células-tronco, que, dependendo da fonte de sua obtenção, apresentam diferentes potenciais regenerativos-plásticos. A metodologia da medicina regenerativa-plástica baseia-se no transplante de células-tronco ou seus derivados.