Terapia genética não viral oferece esperança para dor lombar crônica

Em um estudo recente publicado na jornal Biomaterials, os pesquisadores desenvolveram uma nova terapia genética não viral para tratar a dor discogênica nas costas (DBP), fornecendo o fator de transcrição Forkhead Caixa F1 (FOXF1) usando vesículas extracelulares projetadas (eEVs) em discos intervertebrais degenerativos (IVDs) in vivo.

A dor lombar crônica (lombalgia) é um problema global crescente devido ao envelhecimento da população e ao agravamento dos problemas de opioides. Os tratamentos atuais incluem alívio de curto prazo ou cirurgias caras, destacando a necessidade de terapias não viciantes e menos invasivas.

As terapias biológicas atuais, incluindo a administração de fatores de crescimento, terapia celular e terapias genéticas virais, podem reduzir a degeneração em modelos animais e humanos. No entanto, preocupações como efeitos a curto prazo, fraca eficácia a longo prazo e imunogenicidade e tumorigenicidade desnecessárias podem impedir a aplicação direta destes métodos.

Neste estudo, os pesquisadores estabeleceram uma terapia genética não viral para a degeneração do disco intervertebral (DIV) usando FOXF1-eEV.

Os pesquisadores transfectaram fibroblastos embrionários primários de camundongos (PMEFs) com um plasmídeo contendo FOXF1 ou pCMV6 como controle e caracterizaram amostras de eEV usando ensaio de rastreamento de nanopartículas (NTA).

Eles avaliaram o carregamento eficiente de carga molecular em eEVs usando reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa quantitativa (qRT-PCR) e PCR convencional. A análise de Western blot identificou FOXF1 e proteínas EV específicas em formações de eEV. A equipe usou plasmídeos que melhoram as regiões poliligantes a montante e a jusante para determinar a presença do DNA do plasmídeo FOXF1 em células doadoras e geraram eEVs.

Eles examinaram mRNA completo produzido a partir de DNA plasmídico em eEVs e células doadoras.

Os pesquisadores criaram vesículas extracelulares com fatores de transcrição para restaurar a função do tecido e modificar as respostas à dor em um modelo animal de PAD.

Eles identificaram EVs para transportar e distribuir FOXF1 para discos intervertebrais danificados em um modelo de rato com dor discogênica nas costas para determinar a inibição do FOXF1 eEV da degeneração do disco intervertebral.

A equipe combinou testes biomecânicos de discos intervertebrais de camundongos com imagens, alterações na matriz extracelular (ECM) e respostas à dor avaliadas após 12 semanas para confirmar alterações na estrutura e função, bem como a dor induzida pela intervenção terapêutica.

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As avaliações da dor pré-operatória e pós-tratamento incluíram tomografia microcomputadorizada (micro-CT), ressonância magnética (MRI), testes mecânicos, coloração com azul Alcian (AB) e vermelho picrosirius (PSR), teste de azul de dimetilmetileno e imuno-histoquímica (IHQ). ) ).

O estudo envolveu uma técnica cirúrgica na qual os pesquisadores injetaram buprenorfina ER por via subcutânea em ratos para controlar a dor pós-operatória.

A equipe realizou avaliações comportamentais antes da cirurgia e a cada duas semanas, de quatro a doze semanas após a cirurgia, usando uma variedade de técnicas, como teste de campo aberto, placa fria, suspensão pela cauda e suspensão por fio.

O teste de campo aberto avaliou a atividade espontânea de camundongos; testes de placa fria mediram hiperalgesia térmica; Os testes de suspensão da cauda mediram a dor axial; e testes de suspensão de fio mediram a resistência.

Doze semanas após a cirurgia, a equipe dissecou a coluna lombar dos animais, usando o traçado do nervo e da artéria femoral para identificar os discos intervertebrais entre L4 e L5, L5 e L6, e L6 e S1 IVD. Eles usaram IVD L5/L6 para avaliar a histologia e determinar o conteúdo de glicosaminoglicanos (GAG).

Os eEVs FOXF1 reduziram significativamente as respostas à dor enquanto restauravam a estrutura e função do IVD, incluindo melhorias na altura do disco, hidratação dos tecidos, conteúdo de proteoglicanos e propriedades mecânicas.

O estudo focou na liberação de eEVs carregados com FOXF1 de fibroblastos primários transfectados com o fator de transcrição FOXF1. A RT PCR quantitativa mostrou um aumento significativo nos níveis de transcrição de mRNA de FOXF1 e nos níveis de mRNA de FOXF1 transcrito completo em comparação com células transfectadas com pCMV6.

A terapia FOXF1 eEV pode reduzir as respostas à dor em um modelo de rato com punção de disco lombar por até 12 semanas. Camundongos fêmeas apresentaram tempos de aquisição mais longos no grupo tratado com FOXF1 do que no grupo lesionado, que durou pelo menos 12 semanas após o tratamento.

A terapia FOXF1 eEV melhorou a hidratação e a altura do tecido IVD em animais feridos e degenerativos in vivo, mantendo os níveis de hidratação e a intensidade da imagem IVD ponderada em T2.

No entanto, a equipe observou uma diminuição na altura do disco em animais feridos e tratados com pCMV6 eEV. Os ratos tratados com FOXF1 eEV não tiveram redução na altura do disco 12 semanas após o tratamento. O gênero não influenciou os resultados funcionais.

Os eEVs FOXF1 restauraram a função mecânica de IVDs danificados e degenerados in vivo. Sob estresse axial, os IVDs tratados com FOXF1 eEV apresentaram maior rigidez NZ normalizada em comparação com os IVDs danificados.

Sob condições de fluência, os IVDs danificados exibiram deslocamentos de fluência normalizados aumentados, indicando uma diminuição na rigidez elástica de fluência normalizada.

Os resultados mostram que a redução do conteúdo de GAG em DIV danificados aumenta a flexibilidade mecânica, mas a terapia com eEV previne a perda de glicosaminoglicanos e alterações subsequentes na função mecânica.

Os eEVs FOXF1 causaram alterações estruturais e funcionais no DIV, aumentando os níveis de proteoglicanos e GAGs.

Os resultados do estudo mostraram que os eEVs carregados com fatores de transcrição do desenvolvimento podem tratar doenças articulares dolorosas, como a PAD, fornecendo esses fatores de transcrição às articulações degenerativas e dolorosas do DIV.

Essa estratégia pode ajudar a reduzir as anormalidades estruturais e funcionais causadas pela doença, bem como regular as respostas à dor específicas de cada gênero.

Os pesquisadores também recomendaram o uso de fatores de transcrição do desenvolvimento, como o FOXF1, para converter células NP degenerativas em um estado pró-anabólico in vivo. Mais pesquisas são necessárias para determinar sua eficácia terapêutica.