A terapia genética não viral oferece esperança para a dor lombar crónica

Em um estudo recente publicado no periódico Biomaterials, pesquisadores desenvolveram uma nova terapia genética não viral para tratar dor lombar discogênica (DBP) ao administrar o fator de transcrição Forkhead Box F1 (FOXF1) usando vesículas extracelulares modificadas (eEVs) em discos intervertebrais degenerativos (IVDs) in vivo.

A dor lombar crônica (LBP) é um problema global crescente devido ao envelhecimento da população e ao agravamento dos problemas com opioides. Os tratamentos atuais incluem alívio a curto prazo ou cirurgias caras, destacando a necessidade de terapias menos invasivas e que não causem dependência.

As abordagens biológicas atuais, incluindo a administração de fatores de crescimento, terapia celular e terapia genética viral, podem reduzir a degeneração em modelos animais e humanos. No entanto, questões como efeitos de curto prazo, baixa eficácia a longo prazo e imunogenicidade e oncogenicidade desnecessárias podem dificultar a aplicação direta dessas abordagens.

Neste estudo, os pesquisadores estabeleceram uma terapia genética não viral para degeneração do disco intervertebral (DVI) usando FOXF1-eEV.

Os pesquisadores transfetaram fibroblastos embrionários primários de camundongo (PMEF) com plasmídeos contendo FOXF1 ou pCMV6 como controle e caracterizaram amostras de eEV usando ensaio de rastreamento de nanopartículas (NTA).

Eles avaliaram a eficiência do carregamento de carga molecular em eEVs usando a reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa quantitativa (qRT-PCR) e PCR convencional. A análise de Western blot identificou proteínas específicas de FOXF1 e EV em formações de eEVs. A equipe utilizou plasmídeos que realçam as regiões poliligantes superior e inferior para determinar a presença de DNA plasmidial de FOXF1 em células doadoras e geraram eEVs.

Eles examinaram mRNA de comprimento total produzido a partir de DNA plasmídeo em eEVs e células doadoras.

Pesquisadores criaram vesículas extracelulares com fatores de transcrição para restaurar a função do tecido e alterar as respostas à dor em um modelo animal de DBP.

Eles identificaram EVs para o transporte e distribuição de FOXF1 em discos intervertebrais danificados em um modelo murino de dor lombar discogênica para determinar a inibição do eEV FOXF1 na degeneração do disco intervertebral.

A equipe combinou testes biomecânicos de discos intervertebrais de camundongos com imagens, alterações na matriz extracelular (ECM) e respostas de dor avaliadas após 12 semanas para confirmar mudanças na estrutura e função, bem como dor, induzidas pela intervenção terapêutica.

As avaliações de dor pré e pós-operatória incluíram microtomografia computadorizada (micro-CT), ressonância magnética (RM), testes mecânicos, coloração com azul de Alcian (AB) e vermelho de picrosirius (PSR), teste de azul de dimetilmetileno e imuno-histoquímica (IHQ).

O estudo envolveu uma técnica cirúrgica na qual pesquisadores administraram Buprenorfina ER por via subcutânea em camundongos para controlar a dor pós-operatória.

A equipe realizou avaliações comportamentais antes da cirurgia e a cada duas semanas, de quatro a 12 semanas após a cirurgia, usando uma variedade de métodos, incluindo teste de campo aberto, placa fria, suspensão de cauda e suspensão de fio.

O teste de campo aberto avaliou a atividade espontânea dos camundongos; os testes de placa fria mediram a hiperalgesia térmica; os testes de suspensão da cauda mediram a dor axial; e os testes de suspensão de fio mediram a força.

Doze semanas após a cirurgia, a equipe dissecou a coluna lombar dos animais usando o traçado do nervo e da artéria femoral para identificar os discos intervertebrais entre L4 e L5, L5 e L6 e L6 e S1. Eles usaram o DIV L5/L6 para avaliar a histologia e determinar o conteúdo de glicosaminoglicanos (GAG).

Os eEVs FOXF1 reduziram significativamente as respostas à dor ao mesmo tempo em que restauraram a estrutura e a função do DIV, incluindo melhora na altura do disco, hidratação do tecido, conteúdo de proteoglicanos e propriedades mecânicas.

O estudo se concentrou na liberação de eEVs carregados com FOXF1 a partir de fibroblastos primários transfectados com o fator de transcrição FOXF1. A RT-PCR quantitativa demonstrou um aumento significativo nos níveis de transcrição do mRNA de FOXF1 e nos níveis de mRNA de FOXF1 transcrito em sua totalidade em comparação com células transfectadas com pCMV6.

A terapia com FOXF1 eEV pode reduzir as respostas à dor em um modelo de punção de disco lombar em camundongos por até 12 semanas. Camundongos fêmeas apresentaram tempos de convulsão mais longos no grupo tratado com FOXF1 do que no grupo lesionado, que duraram pelo menos 12 semanas após o tratamento.

A terapia FOXF1 eEV melhorou a hidratação e a altura do tecido IVD em animais lesionados e degenerados in vivo, mantendo os níveis de hidratação e a intensidade da imagem ponderada em T2 do disco IVD.

No entanto, a equipe observou uma redução na altura do disco em animais lesionados e em animais tratados com pCMV6 eEV. Camundongos tratados com FOXF1 eEV não apresentaram redução na altura do disco 12 semanas após o tratamento. O gênero não afetou os resultados funcionais.

Os eEVs FOXF1 restauraram a função mecânica de IVDs danificados e degenerados in vivo. Sob estresse axial, os IVDs tratados com eEVs FOXF1 apresentaram maior rigidez NZ normalizada em comparação aos IVDs danificados.

Em condições de fluência, os IVDs danificados apresentaram deslocamentos de fluência normalizados aumentados, indicando uma diminuição na rigidez elástica de fluência normalizada.

Os resultados mostram que a redução do conteúdo de GAG em DIVs danificados aumenta a flexibilidade mecânica, mas a terapia eEV previne a perda de glicosaminoglicanos e alterações subsequentes na função mecânica.

Os eEVs FOXF1 induziram mudanças estruturais e funcionais no IVD aumentando os níveis de proteoglicanos e GAG.

Os resultados do estudo mostraram que eEVs carregados com fatores de transcrição de desenvolvimento podem tratar doenças articulares dolorosas, como DBP, ao fornecer esses fatores de transcrição para articulações degenerativas e dolorosas por meio de DIV.

Essa estratégia pode ajudar a reduzir as anormalidades estruturais e funcionais causadas pela doença e regular as respostas à dor de maneira específica para cada gênero.

Os pesquisadores também recomendaram o uso de fatores de transcrição do desenvolvimento, como o FOXF1, para levar células NP degenerativas a um estado pró-anabólico in vivo. Mais estudos são necessários para determinar sua eficácia terapêutica.