Trabalho experimental sobre o transplante de queratinócitos alogênicos em cicatrizes criadas artificialmente de ratos brancos

O desejo de usar o potencial celular ea necessidade de buscar novos métodos efetivos para melhorar a aparência estética das cicatrizes levou à idéia de tentar estudar a possibilidade de transplante de queratinócitos para superfícies cicatriciais.

A fim de provar a probabilidade de usar uma cultura de queratinócitos para melhorar o tipo de cicatrizes, o trabalho experimental foi realizado em ratos laboratoriais brancos, que criaram superfícies cicatriciais. O modelo do rúmen dos ratos foi obtido como resultado da cicatrização de feridas infligidas artificialmente nas costas, ao longo da coluna vertebral. Os ratos foram cortados pedaços do mesmo couro, o tamanho de 2x3 cm. Após 2,5 meses após a operação "simulação cicatrizes" ratos foi realizada cirurgia dermabrasão (remoção das camadas superiores via rúmen ignioperation) e queratinócitos alogénicos transplantados, isolado a partir de pele de ratos jovens de 2-4 dias após o nascimento.

Isolamento e crescimento de epidermócitos de ratos foi realizado no laboratório de tecnologias celulares do Instituto de Citologia RAS da seguinte tecnologia.

A pele foi lavada em solução salina de Hank contendo 200 U / ml de gentamicina, cortados em pedaços pequenos, uma área de 0,2-0,5 cm ². Os cubos de pele foram incubados numa solução a 0,5% de disaspase numa solução equilibrada com fosfato salino equilibrado a 37 ° C durante uma hora. As peças foram então transferidas para solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco e a epiderme foi separada da derme. A epiderme foi incubada numa solução de tripsina a 0,125% durante 10-15 minutos com agitação a 50 rpm, após o que a ação da enzima foi interrompida pela adição de 5% de soro bovino fetal. Um terço da suspensão celular obtida foi utilizada na sua forma pura para uma das variantes do transplante em cicatrizes, o segundo terço foi cultivado em revestimentos de película doméstica biocompatíveis "Polypor", o terceiro - em placas de Petri sem substrato. O funcionamento da dermabrasão das cicatrizes obtidas em ratos com subsequente transplante de epidermócitos de ratos foi realizado sob anestesia com éter usando um cauterio de calor.

O primeiro grupo de ratos, após a dermabrasão, eram pedaços esterilizados de cambric em polido, lavados com solução fisiológica e superfície seca do rúmen, em que uma suspensão agitada de epidermócitos de ratos alogênicos foi aplicada a uma concentração de 1,5 milhão de células por ml (de acordo com o Instituto de Citologia). As peças de Batistovye se encaixam na cicatriz polida, de modo que as células se encontram na superfície da cicatriz. Uma bandagem de várias camadas de gaze foi costurada no topo, que foi costurada nas bordas da cicatriz.

Parte da suspensão celular resultante foi plaqueada em placas de Petri em filmes Polypore estéreis cortados na forma de copos, a outra parte em placas de Petri sem película. O cultivo foi realizado em um meio FAD consistindo de uma mistura de DMEM e F12 numa proporção de 3: 1. Com a adição de 10% de soro bovino fetal, 5 μg / ml de insulina (Sigma), 0,5 μg / ml de hemaucucato de hidrocortisona (Sigma). Fator de crescimento epidérmico EGF 10 μg / ml (Institute of Cytology RAS, St. Petersburg). O segundo e terceiro grupos de ratos com 7 indivíduos foram operados 6 dias após o primeiro. Por esse tempo, os camadas multicamadas foram formados a partir da suspensão de queratinócitos semeados em placas de Petri, que foram transplantadas para ratos. O segundo grupo foi transplantado com epidermócitos no filme, o terceiro grupo - com uma camada multicamada sem um substrato. Após 7 dias, as camadas multicamadas de queratinócitos alogicos (MPALK), semeados em filmes Polypore, foram transplantadas por cultura diretamente para a superfície da ferida. Acima, o filme, para evitar o rasgão, foi fixado com um curativo de gaze multicamada e costurado à pele de ratos.

Antes do transplante de queratinócitos, um terceiro grupo de ratos cultivados sem substrato foi separado do fundo da placa de Petri por tratamento com uma disposição que teve a capacidade de quebrar seletivamente as conexões dermo-epidérmicas. Quando exposto a uma camada multicamada, disaspase destrói a conexão das células da camada basal ao fundo da placa de Petri e, em muito menor grau, afeta as ligações intercelulares, o que permite "tirar" a camada inteiramente. O desprendimento do estrato de células multicamadas pela disposição foi realizado da seguinte forma. O meio de transporte foi drenado das placas de Petri, as camadas celulares foram lavadas três vezes com um meio nutriente contendo antibióticos, em particular gentamicina (0,2 mg / ml). Os leitos multicamadas foram vertidos numa solução de dispersão a 0,125% ("Sigma") e colocados num termostato, onde foram incubados a t = 37 ° C durante 20 a 30 minutos. A aparência de uma corola branca que flanqueia a periferia da formação é uma indicação do início do processo de separação das bordas e do fundo da placa de Petri. Poucos minutos após o início do processo de separação, a solução de disaspase foi fundida, as camadas epiteliais foram lavadas 2-3 vezes com meio. Na superfície da camada epidérmica foi aplicada, cortado para o tamanho do copo peça ferida estéril vestir "Leith-cor, a qual é clivada separados dispase formação, mais delaminação do fundo do copo com uma espátula. Utilizando pinças oftálmicas camada em conjunto com o revestimento do penso" Leith-cor "(Russo ) separou-se a partir do fundo de uma placa de Petri e cuidadosamente transferidos para a superfície preparada da cicatriz. Guardanapos "Lita-cor" contém na sua composição e eksolin gentamicina (extracto de colagénio), a qual quando húmida ambiente permanece sprout no futuro solução salina Shem inchou e tornou-se o revestimento de feridas moderno, que proporciona boa proteção contra infecções externas e cura rápida devido ao incipiente com estrutura.

Os filmes de polipropileno e os guardanapos de cor Lita foram mergulhados com bandagens de gaze que foram costuradas sobre a pele de ratos para uma fixação mais durável. Cada rato foi plantado em uma gaiola separada, para criar condições ideais para a manutenção e o enxerto de queratinócitos transplantados. Os curativos dos ratos, que foram transplantados com uma suspensão e uma camada multicamada de epidermócitos, removidos pela disposição, foram umedecidos diariamente com várias vezes ao dia com solução salina estéril, para criar as condições mais favoráveis para o enxerto das células. Considerando que o filme "Polypor" era impermeável à água, os ratos do segundo grupo não humedeceram os pensos, uma das vantagens antes dos transplantes sem filmes. Após 10 dias, as ligaduras foram removidas. O quadro clínico de cicatrizes após o transplante de células diferiu pouco de cicatrizes sem transplante, com exceção de uma coloração mais cor-de-rosa (devido a dermoabrasão) e maior descamação. Esse fato sugere isso. Que imediatamente após o desaparecimento dos revestimentos da ferida com IPC, não ocorreram alterações no rúmen.

Tirar material de biópsia em ratos.

Após 1, 2, 5 e 9 meses após a transferência de queratinócitos alogicos de ratos para cicatrizes moídas de ratos brancos, o material foi tomado para exame microscópico histológico, citomorfológico e eletrônico. Como amostras de controle de pele e cicatrizes normais do rato foram tomadas sem transplante de células. A anestesia em ratos foi realizada com anestesia com éter.

Após a anestesia, das áreas marcadas, nas quais os queratinócitos foram transplantados, um perfurador de biópsia com um diâmetro de 2 mm. Os pedaços de tecido cicatricial foram retirados e colocados em solução de glutaraldeído 2,5% para preparar o material para microscopia eletrônica. Peças de tecido tomadas para exame histológico foram colocadas em uma solução a 10% de formalina neutra, seguidas de fiação através de espiritos e despejando em parafina, seguindo-se cortes de cortes ultra-finos e visualização em microscópios ópticos de luz.

Controle I. Pele de rato normal.

Para ver a diferença entre a imagem microscópica da pele normal alterada por cicatriz de ratos e cicatrizes após um certo período após o transplante do IPC, são demonstradas fotografias e descrições para eles em todas as etapas deste estudo.

A epiderme da pele normal consiste em 7-9 camadas de células. Capa Horny de espessura moderada. Em alguns lugares, ele consiste em 6-8 camadas de balas córneas. A camada basal é representada por células de forma cilíndrica com grandes núcleos de luz, regulares e vários nucleolos. As conexões desmosomal entre as células e a membrana basal são claramente expressas. Sob uma membrana basal bem marcada, que tem pequenos desfavimentos na camada subepidérmica, paralelamente a ela se encontram feixes delicados de fibras de colágeno e elastina, dentre elas uma forma alongada de fibroblastos, pequenos vasos. Em camadas mais profundas, os feixes de fibras de colágeno e elastina estão em diferentes direções. Entre eles, há muitos vasos com paredes finas do mesmo calibre, elementos celulares (fibroblastos, mastócitos, leucócitos). Em um grande número de folículos capilares, glândulas sebáceas.

Controle 2. Cicatriz de um rato de 2 meses de idade.

Imagem clínica. Cicatrizes rosa pálido, com descamação, em lugares as crostas permanecem. A sua área é diminuída devido à contracção de fibras de colagénio e tornar-se cerca de 3,0-3,5 cm ^:. Os acessórios para a pele estão ausentes.

Imagem microscópica. A epiderme consiste em 3-5 camadas de células, dobradas, representadas por células basais de forma arredondada, uma fileira de subulate, 1-2 fileiras de granulado com grãos de queratogialina na camada superior, existem seções de edema intracelular. A camada corneana é heterogeneamente alterada de muito fina para espessada. Existe um dobramento do rúmen devido a (contração) do tecido cicatricial. As dobras penetram na camada papilar e dão a impressão de papilas. O limite entre a epiderme e a derme é uma linha reta. A membrana basal não pode ser rastreada em todos os lugares. Na parte inferior das camadas subepidérmicas e mais profundas - vasos com uma parede grossa e afundada, muitos desertos, com fenômenos de iscas. Em torno dos vasos - um conjunto de macrófagos, fibroblastos. Os macrófagos cercam os eritrócitos emergentes dos capilares e os fagocitam. Nas camadas mais superficiais - pequenos capilares. Sob a epiderme, as fibras de colágeno estão soltas. Na camada mais profunda do rúmen - feixes grosseiros de fibras de colágeno entre os quais há muitos fibroblastos.

Cicatrização de um rato por mês após transplante de queratinócitos de rato de ratinho MPAl.

Imagem clínica. Cicatriz rosa, sua área diminuiu, especialmente em diâmetro e médias 2,5-3 cm ². O cabelo e as glândulas sebáceas estão ausentes.

Os dados de um exame microscópico do material obtido de ratos com um transplante MPALK em um filme e MPALK sem um substrato são praticamente idênticos. No entanto, tecnicamente, o trabalho com MPAlK não suportado muito mais difícil e trabalhoso do que quando cultivada MPAlK sobre o substrato, de modo que o estudo mais aprofundado da questão sobre o transplante de kertainotsitov cicatrizes que usamos como base para o cultivo ( "substrato") gramado em camadas.

Imagem microscópica. Há um espessamento da epiderme para 15-20 camadas, quase até o meio do qual os queratinócitos têm uma forma estreita, alongada e vertical e um arranjo compacto. As células basais estão dispostas em uma linha desigual. Os seus núcleos são leves, grandes, redondos em forma com um ou dois nucleolos, o que indica sua alta atividade sintética e proliferativa. O limite entre a epiderme e a derme é uma linha reta. A camada espinhosa está bem desenvolvida, consiste em 3-5 camadas de células de forma redonda, existem 2 células nucleolus.

Imediatamente sob a membrana basal - feixes finos densamente localizados de fibras de colágeno, em paralelo a eles um grande número de vasos vazios, as fibras de colágeno mais profundas são mais grossas, coletadas em feixes densos. Muitos fibroblastos grandes, mastócitos (2-3 no campo de visão), macrófagos, leucócitos e vasos vazios, cujas paredes são afrouxadas, em torno deles são fibras de colágeno locamente localizadas. Em alguns vasos - estase, diapedese de elementos uniformes. Em torno dos vasos - fibroblastos, linfócitos simples. Os acessórios para a pele estão ausentes.

Quando uma suspensão de queratinócitos é transplantada para uma cicatriz polida, a imagem microscópica é diferente da anterior. Na maioria dos animais - a epiderme é fina, consiste em 5-6 camadas de células. A camada inferior consiste de células de forma irregular e poligonal com núcleos de forma irregular arredondada. A condição da camada subepidérmica é semelhante à do grupo de animais sem transplante.

Neste caso, pode-se falar de atraso nos processos que acompanham o transplante de células, ou de uma grande perda de células transplantadas sob a forma de suspensão. Assim, concluiu-se que a correção da cicatrização por transplante de queratinócitos na forma de suspensão é inadequada.

Cicatrização do rato 2 meses após o transplante de queratinócitos de rato de ratinho MPAl.

Imagem clínica. A cicatriz parece fina, macia. Em alguns lugares há uma ecdise, escalas.

Imagens microscópicas. O estrato córneo é engrossado, em locais - hiperqueratose. A epiderme é engrossada, consiste em 12-20 linhas de células. O limite entre a epiderme e a derme é uma linha reta. Fibras delicadas de colágeno sob a epiderme encontram-se bem. Em camadas mais profundas do rúmen, elas são coletadas em grandes feixes grosseiros. Na camada subepidérmica, aparece uma nova formação de vasos. Nas camadas inferiores do tecido cicatricial - muitos vasos vazios, localizados paralelamente à superfície da epiderme. Grandes fibroblastos são uniformemente distribuídos na espessura do rúmen, existem gigantes, multifacetados, muitos macrófagos.

Cicatrização do rato 5 meses após o transplante do MP de espermócitos de ratos.

Imagem clínica. A cicatriz parece suave, suave sem descascar, há cabelos soltos, sua densidade é maior na periferia das cicatrizes, o que indica o crescimento marginal dos folículos pilosos na cicatriz e a formação de folículos pilosos. A área das cicatrizes continua a diminuir.

Imagem microscópica. A epiderme ainda é grossa (15-20 camadas, às vezes até 30) nas camadas superiores é preenchida com grãos de ceratogialina. A membrana basal é claramente visível. Sob suas fibras de colágeno estão soltas. Nas camadas mais baixas, o colágeno é mais poderoso e bem embalado. Entre os feixes de colágeno existem muitos capilares ... Nas camadas superiores o número de vasos vazios diminuiu. A epiderme e a derme são ligeiramente onduladas. Existem crescimentos epidérmicos profundos no tecido cicatricial. Entre as fibras de colágeno estão visíveis vasos recém formados. Aparecem folículos pilosos únicos e glândulas sebáceas.

Cicatrização do rato 9 meses após o transplante de epidermócitos de rato de IPA.

Imagem clínica. As cicatrizes tornaram-se muito menores em comparação com os termos anteriores, sua área é média de cerca de 1,5-2,0 cm ². As cicatrizes são desigualmente cobertas de cabelos finos, especialmente em torno da periferia. A escala menor de placas pequenas é mantida.

Imagem microscópica.

A epiderme tornou-se mais fina, representada de 6-8 linhas de células, remanescentes da estrutura epidérmica da pele normal dos ratos, apenas a densidade das células em 1 mm. Mais elevados e são menores. A camada basal consiste de pequenas células de forma cilíndrica redonda. A membrana basal está bem definida, os hemidesmossomos são claramente visíveis. Observa-se a presença de crescimento epidérmico na camada subepidérmica. A camada papilar é expressa em todo o comprimento da cicatriz. Esses fatos indicam que, durante este período de tempo, a adesão dos queratinócitos transplantados tornou-se muito mais durável com os tecidos subjacentes do rúmen. Conseqüentemente, o cuidado de cicatrizes de pessoas com transplante de MALC 9 meses após o transplante de IPC pode ser tradicional. Sob a epiderme são fibras de colágeno mais delicadas do que nas camadas profundas. Havia muitos navios, especialmente localizado superficialmente. Em vasos maiores, as paredes são engrossadas. Folículos capilares e glândulas sebáceas em grande quantidade. O padrão microscópico se assemelha a um tecido dérmico.

Resultados do trabalho experimental e sua discussão.

No decorrer deste trabalho, os queratinócitos foram transplantados para as cicatrizes artificialmente criadas da pele de ratos, após a operação de dermabrasão, em várias formas de cobertura de feridas, como uma suspensão em batiste e uma camada multicamada sem substrato. O trabalho foi feito para obter dados morfológicos sobre o efeito de queratinócitos alogênicos transplantados em cicatrizes, bem como para determinar as variantes óptimas de transplante.

Verificou-se que os três métodos de transplante são reais, mas o transplante de IPAA sem substrato é um procedimento muito laborioso, durante o qual o IPAC pode ser ferido, o que afeta os resultados do transplante. Além disso, este método de transplante exclui o trabalho em grandes superfícies.

O transplante da suspensão de queratinócitos é um método muito mais econômico, não requer cultura celular longa e é simples em nossa versão proposta, utilizando tarugos de canigrafia estéril cujas dimensões correspondem ao tamanho das cicatrizes. O atraso do efeito terapêutico durante o transplante da suspensão celular durante cerca de um mês em comparação com o MIC no revestimento da ferida não é um momento significativo com a duração do tratamento, calculado em muitos meses. Sabe-se que durante o transplante de IPC para queimar pacientes, a transformação do estado da estrutura da pele ocorreu gradualmente e por vários anos. O transplante da cultura de queratinócitos nas coberturas de feridas é o método mais conveniente e promissor, no entanto, também é muito mais caro. Além disso, exigindo hoje a busca de revestimentos mais sofisticados que devem ser plásticos, higroscópicos, possuem propriedades bacteriostáticas ou bactericidas e sejam biologicamente neutros para as células. O filme Polypore - uma variante intermediária do revestimento de feridas domésticas, apesar de alguma imperfeição, nos permitiu estudar no experimento um transplante de queratinócitos de ratos em cicatrizes e tirar conclusões sobre a eficácia dessa direção na cicatrização de cicatrizes.

Os autores que realizaram o transplante do IPC em feridas queimadas observaram que durante a primeira semana após o transplante da camada de queratinócitos multicamadas nas feridas higienizadas, a epiderme engrossou e estratificou. Todas as camadas da epiderme foram bem definidas. É interessante que o número de camadas celulares em transplantes seja 10-30% maior do que nos espécimes de biópsia cutânea. Os autores observaram o aparecimento de grânulos de queratogialina no 5º dia após o transplante de MPA, a membrana basal e hemidesmossomas - já no terceiro dia.

J.Rives et al. (L994), Paramonov BA (1996); NM Kuznetsov et al. (1998) descobriram que, durante os períodos iniciais após transplante de doentes BMD com defeitos da pele após queimaduras polnosloynymi, a comunicação entre a derme e a epiderme é muito fraco e é uma linha recta, uma camada papilar está ausente. No final do segundo mês, a formação de papilas rasas e apêndices da pele começa, a conexão entre a derme e a epiderme torna-se mais durável. Os dados da literatura referem-se ao transplante de queratinócitos alogênicos nas feridas de pacientes queimados, como um método promissor. Apesar do fato de que a rejeição dos queratinócitos alogênicos ocorre por diferentes autores no período de 10 dias a 3 meses, eles cumprem seu papel na cura da superfície da ferida, isolando os fatores de crescimento e fechando mecanicamente o defeito. Acredita-se que o MPALK tenha uma atividade antigênica reduzida, pois durante o cultivo in vitro, as células de Langerhans perdem, o que lhes permite existir por muito tempo no organismo receptor. Além disso, a cultura alogênica obtida da pele de pessoas jovens saudáveis tem um potencial biológico incomparavelmente maior do que a cultura autóloga de pacientes após trauma.

O objetivo principal do nosso estudo foi descobrir se os queratinócitos alogênicos sobreviverão nas cicatrizes e quais serão as mudanças no tecido cicatricial sob a influência de tal "revestimento de ferida" biologicamente ativo. Em caso de resultado positivo, desenvolva a tecnologia mais efetiva e com menor intensidade de mão-de-obra nesta área de medicina de reabilitação.

Os dados obtidos por nós em muitos aspectos revelaram-se semelhantes aos dados da literatura sobre as alterações morfológicas ocorridas na epiderme humana após a transferência de queratinócitos alógenos para queimar feridas. Mas há diferenças significativas, tanto em termos de substrato morfológico, que é transplantado, quanto em termos de tecnologia. Então. O processo de formação da membrana basal e conexões dermo-epidérmicas (hemidesmossomas, papilas) ocorrem em uma data posterior ao do transplante de queratinócitos para as superfícies da ferida sem alterações cicatriciais. Isso parece ser devido à má nutrição dos tecidos do rúmen em comparação com a derme ou fáscia muscular. A cicatriz, especialmente a antiga, é um tecido conectivo denso com um número muito pequeno de vasos, o fundo da ferida de queimação é um tecido de granulação rico em vasos sanguíneos. Assim, é óbvio que as condições em que o transplante eo enxerto de queratinócitos ocorrem são completamente diferentes. Quanto mais vascularizada a área de transplante de células, mais fácil é processá-las. A partir deste postulado, há uma conclusão sobre a preferência por trabalhar com cicatrizes jovens, em que o tecido conjuntivo ainda é solto e rico em vasos sanguíneos.

Como resultado deste trabalho experimental, está provado que:

1. Um transplante de MALK para cicatrizes é possível. 
2. O método ideal de transplante é o transplante de queratinócitos na cobertura da ferida.
3. A superfície da cicatriz deve ser moída usando uma dermabrasão operativa usando o laser de Schumann ou um cortador.
4. Sob a influência do MPALK, ocorre a epitelização rápida da superfície do solo do rúmen.
5. O tecido cicatricial mais vascularizado, ou seja, quanto mais jovem a cicatriz, melhor os resultados do transplante de queratinócitos.
6. O tecido cicatricial sob a influência de queratinócitos transplantados é gradualmente transformado e se transforma em tecido dérmico (tecido cicatricial mais friável com apêndices da pele).
7. O relaxamento gradual do tecido cicatricial começa com a camada subepidérmica. Melhora a sua vascularização, os feixes de fibras de colágeno nas partes superior e inferior do rúmen tomam uma localização mais friável do que no tecido cicatricial sem transplante de células. Existem folículos pilosos e glândulas sebáceas. A epiderme em sua estrutura, depois de passar a fase de hipertrofia, está se aproximando da epiderme da pele normal.
8. As alterações observadas estão associadas a fatores de crescimento derivados de queratinócitos, citoquinas, que melhoram o trofismo do tecido cicatricial e facilitam sua transformação de tecido fibroso grosseiro em um tecido mais solto, o que leva a uma melhora no tipo de cicatriz.

Assim, com base neste estudo, pode-se concluir que o efeito benéfico dos queratinócitos transplantados no tecido cicatricial, que pode ser de importância prática para a reabilitação de pacientes com vários tipos de cicatrizes.

Este trabalho em ratos também permitiu formular requisitos. Para os revestimentos de feridas, nos quais os queratinócitos são cultivados.

As coberturas de feridas devem ser:

• biocompatível com células,
• respirável
• tem uma base elástica, formadora,
• ser hidrofílico,
• Como os aditivos medicinais contêm medicamentos antibacterianos e os antioxidantes não são tóxicos para células cultivadas.

Resultados clínicos do tratamento biotecnológico de cicatrizes.

Anteriormente, N. Carver et al. (1993) descobriram que os pensos oclusivos são melhores para se conectar à ferida e a sobrevivência dos queratinócitos, mas não permitem a formação de uma epiderme estratificada (madura). Para formar uma epiderme estratificada, é necessário um ambiente de ar. Portanto, após a ligação da camada multicamada, foi sugerida uma cobertura de ferida oclusiva após 7-10 para remover e conduzir feridas sob ligaduras secas ou pomadas solúveis em água. Podemos dizer que a qualidade e as propriedades do "substrato" nas quais as células são cultivadas são muito importantes para a efetividade do transplante do material celular e, conseqüentemente, para os resultados do trabalho dos médicos. Mas hoje não existe uma cobertura de feridas ideal, apesar da abundância das opções propostas (couro artificial, tecido não tecido de carboximetilcelulose, revestimentos de fibrina, filmes de poliuretano semipermeáveis). Momento não importante neste caso é o custo dos "substratos" (revestimentos de feridas especiais), uma vez que seu alto custo aumenta o custo total do tratamento biotecnológico.

A eficácia das tecnologias celulares tem sido comprovada até o momento, mas, infelizmente, essas tecnologias são muito caras, especialmente em países onde a produção industrial de composições celulares não está estabelecida. No entanto, países como os Estados Unidos estabeleceram há muito tempo uma indústria para a produção de material celular para transplante de queimados. Em particular, a BioSurface Technology Inc, desde 1989, cresceu 37 mil estratos de queratinócitos multicamadas que foram utilizados para tratar 240 pacientes em 79 países (R.Dessey, 1992), com 1 cm ^{2 de} cultura ^de células, cerca de 7-8 $ US.

A tecnologia de tratamento de várias doenças e problemas de pele tem uma série de diferenças, mas no coração de qualquer tratamento com células é a produção de material celular de qualidade e seu transplante.

Este processo consiste nas seguintes etapas:

• Seleção de pele do afetado (ou de doadores),
• transporte de abas de pele para o centro de biotecnologia,
• o isolamento de células da camada basal e sua multiplicação,
• acumulação de camadas multicamadas de queratinócitos (IPC).
• transplante de culturas celulares.

O principal problema no tratamento com o transplante de estratos de queratinócitos multicamadas é a necessidade de células viáveis em todos os estágios do transplante celular. As peças de pele para isolar células autólogas ou alogênicas devem ser tão finas quanto possível, uma vez que, neste caso, são mais fáceis de separar usando métodos mecânicos e enzimáticos e obter uma suspensão de células vivas para o crescimento. Eles podem ser obtidos cortando o dermatoma ou usando a pele das pálpebras, o prepúcio, a superfície interna do ombro. Dado que as células são sensíveis aos halogéneos (cloro, iodo), peróxido de hidrogênio, não podem ser utilizadas no tratamento da pele no momento da tomada do material.

O rendimento quantitativo e qualitativo de células de enxertos de pele e a eficácia de seu cultivo também dependem do estado de saúde e idade do doador. Além disso, os espécimes de biópsia da pele devem ser entregues ao laboratório o mais rápido possível e em condições adequadas (ambiente, temperatura) entregues a um laboratório certificado e credenciado.

O meio médio ou meio de Eagle 199 com a adição de soro bovino a 10%, meio DMEM suplementado com 5% de soro fetal bovino e antibióticos podem ser usados para armazenar e transportar abas de pele.

No laboratório citológico, a biópsia cutânea é primeiro mecanicamente dividida em pequenos pedaços, e o processamento de fragmentos de pele é realizado com a ajuda de enzimas: tripsina, colagenase, dispase, etc.

Sob a ação das enzimas, ocorre a destruição por desmossomas e os queratinócitos são liberados para o meio, pois células ou agregados separados constituem diferentes números de células. Para a cultura, são utilizados apenas queratinócitos basais que são cultivados em meios especiais em incubadoras contendo 5% de CO., Em placas de Petri ou em frascos a t = 37 ° C. Dentro de 48 horas, observa-se a formação de colônias de queratinócitos, que gradualmente convergem para uma monocamada. Depois de obter um número suficiente de células, a suspensão resultante é espalhada nas tampas de ferida preparadas para este fim e colocadas em placas de Petri. A partir da suspensão, primeiro uma monocamada e, em seguida, uma camada multicamada de queratinócitos são formados. Esquematicamente, os estágios do processo de cultivo de queratinócitos são mostrados na Fig. 12 (33.43.54.65).

A formação de uma formação de queratinócitos multicamadas adequadas para o transplante geralmente leva de 7 a 10 dias. Às vezes, esse período é mais longo, o que depende da qualidade do material-fonte (idade, saúde do doador, correção do material, qualidade dos meios utilizados, etc.). Se a camada multicamada cresce, então, na sua superfície, pode haver células com fenômenos de apoptose inadequados para o transplante. Os pratos de Petri, cultivados neles em revestimentos de feridas por camadas multicamadas de queratinócitos (IPC), são entregues à clínica em recipientes especiais a uma temperatura não inferior a + 15 ° C.

O método de Green modificado para o crescimento do IPC

Em nosso trabalho como revestimento de feridas, utilizamos uma cambrica de camadas múltiplas, abandonando os filmes polypore com os quais começamos a trabalhar em um experimento com ratos. Assim, os estratos de queratinócitos multicamadas foram cultivados por nós em batiste prefat e estéril, embora também não seja a cobertura óptima da ferida.

Estudos clínicos foram realizados em voluntários com observância das normas éticas necessárias: assinar um tratado e consentimento informado.

1. Foi aplicada a cultura própria (autóloga) e retirada das células bancárias (alogênicas) queratinócitos.
2. Os queratinócitos próprios foram obtidos a partir de um pedaço de pele cortada no interior do ombro dos pacientes.
3. O funcionamento da dermabrasão de cicatrizes foi realizado com a ajuda de termopar, discos rotativos e laser erbium.
4. Foram realizados grupos de pacientes com cicatrizes normotróficas, hipotróficas e hipertróficas.

O processo tecnológico para a aplicação da tecnologia celular para melhorar o tipo de cicatrizes da pele consistiu nas seguintes etapas:

1. Seleção de pacientes.
2. Explique a essência do tratamento, o momento da obtenção dos resultados esperados, a assinatura de um tratado e o consentimento informado.
3. Nomeação de pacientes por 2-3 semanas antes da cirurgia selmevit por 1t. 3 vezes ao dia, zinkteral em 1t. 3 vezes ao dia.
4. Pegando um pedaço de pele de 2,0 cm de comprimento e 0,7-1,0 cm de largura da superfície interna do ombro, alto, quase no fundo da região axilar, para obter queratinócitos autólogos.
5. No caso de os pacientes se recusarem a isolar seus próprios queratinócitos devido à possibilidade de obter uma cicatriz linear na superfície interna do ombro, o material celular foi retirado de um banco de células (queratinócitos alogênicos).
6. Os queratinócitos foram isolados e cultivados nas condições de um laboratório certificado para este tipo de trabalho.
7. Depois de receber um IPC suficiente para o transplante, um dia de cirurgia foi administrado às cicatrizes na clínica, onde o material foi trazido em recipientes especiais em placas de Petri.
8. O funcionamento da dermabrasão do rúmen, a hemostasia foi realizada, a superfície do solo foi lavada com solução salina estéril, seca, após o que o IPC foi transplantado em células de batiste estéril para baixo. Ou seja, as células que estavam na parte superior da MIC eram menores, adjacentes à superfície polida.
9. Um filme estéril foi sobreposto no topo, que foi fixado à pele com uma bandagem elástica ou Omnifix elástica. Em vez do filme, também podem ser utilizados revestimentos de feridas indiferentes que contenham silicone, por exemplo Mepitel, Mepiform, placas de gel de silicone.

Após 5-7 dias, o filme ou revestimento de silicone é removido. Por este tempo, todos os queratinócitos têm de se arrastar para a cicatriz polida e anexar à sua superfície.

10. O ambiente úmido criado sob o filme e revestimento de silicone está contribuindo ativamente para isso. O baptista que permanece na cicatriz deste ponto pode ser impregnado com curioses ou gel de quitosana. Como resultado, no 2º dia, é criada uma crosta densa, que, para a conveniência do paciente, é melhor consertar com um elástico elástico permeável ao ar, por exemplo Omnifix. A crosta respirável permite que a epiderme recém formada se diferencie e se torne uma madura.

Dependendo do tipo de cicatriz e da profundidade de moagem, o curativo é rejeitado após 8 a 10 dias. A epiderme neste momento tem 30-40% mais camadas celulares do que na pele normal. A membrana basal não é formada. Os queratinócitos da epiderme espessada liberam uma massa de moléculas biologicamente ativas no tecido cicatricial.

O sucesso do tratamento biotecnológico das cicatrizes depende em grande parte da forma como são atendidas no pós-operatório. As culturas de células são um tipo de cobertura "ferrosa" e nos primeiros períodos após o transplante, a DMO pode ser facilmente separada dos tecidos subjacentes. Portanto, os pacientes são aconselhados a cuidar da cicatriz após a cirurgia. Por 8-9 meses, não esfregue e trabalhe facilmente com água fervida fria para evitar rasgar uma epiderme fina e recém-criada que não tenha um aperto apertado com os tecidos subjacentes.

Nota:

Antes da operação e no processo de dermabrasão, é permitido o uso de anti-sépticos e oxidantes contendo halogênio (iodopirônio, suliodopirona, iodinol, iodato, clorhexidina, peróxido de hidrogênio), antes do transplante celular ser categoricamente contra-indicado devido ao seu efeito citotóxico. Tóxico para as células também são azul de metileno. Verde brilhante.

Para evitar infecções, especialmente quando se trabalha com cicatrizes hipertróficas, é possível tratar o campo operacional com sulfato de neomicina, polimixina ou gentamicina. Eles não exercem um efeito citotóxico sobre os queratinócitos.

Como resultado desse tratamento, um efeito triplo é alcançado.

1. Alinhamento da superfície do rúmen.
2. Crie uma camada acima dela de uma nova epiderme, espessura normal.
3. A transformação do tecido cicatricial em dermóides, devido à ação das citocinas, fatores de crescimento e outras moléculas biologicamente ativas, segregadas por células transplantadas e estimuladas por eles, queratinócitos, fibroblastos e macrófagos.

A cicatriz torna-se menos perceptível, mais elásticas, os poros aparecem nele, cabelos inchados, a pigmentação pode ser restaurada devido à presença de melanócitos no MPC.

No entanto, todos esses momentos positivos na cicatriz não chegam imediatamente. A este respeito, é necessário alertar pacientes. Que o processo de transformação do tecido cicatricial na derme é lento e o resultado ótimo desse tratamento pode ser esperado não antes de 10-14 meses. Imediatamente após a rejeição do curativo, as superfícies polidas têm um policromado pronunciado, mais brilhante é o processo de moagem. O menor dano à pele ocorre ao moer as cicatrizes normotróficas com um laser erbium. A cor das cicatrizes e da pele circundante foi restaurada no período de 3 a 8 semanas. Apesar de tais precauções, às vezes há hiperpigmentação pós-operatória, que pode ocorrer independentemente por vários meses.

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