Trabalho experimental sobre o transplante de queratinócitos alogénicos em cicatrizes criadas artificialmente em ratos brancos

O desejo de utilizar o potencial celular e a necessidade de encontrar novos métodos eficazes para melhorar a aparência estética das cicatrizes levaram à ideia de tentar estudar a possibilidade de transplantar queratinócitos em superfícies cicatriciais.

A fim de comprovar a probabilidade do uso da cultura de queratinócitos para melhorar a aparência de cicatrizes, foi realizado um estudo experimental em ratos brancos de laboratório, nos quais foram criadas superfícies cicatriciais. O modelo de cicatriz do rato foi obtido a partir da cicatrização de feridas artificiais infligidas nas costas, ao longo da coluna vertebral. Foram cortados pedaços idênticos de pele dos ratos, medindo 2x3 cm. 2,5 meses após a operação de "modelagem da cicatriz", os ratos foram submetidos à dermoabrasão (remoção das camadas superiores da cicatriz com termocaustic) e queratinócitos alogênicos foram transplantados, isolados da pele de filhotes de ratos 2 a 4 dias após o nascimento.

O isolamento e o cultivo de células epidérmicas de ratos foram realizados no laboratório de tecnologias celulares do Instituto de Citologia da Academia Russa de Ciências usando a seguinte tecnologia.

A pele foi lavada em solução salina de Hank contendo 200 U/ml de gentamicina e cortada em pequenos pedaços, de 0,2-0,5 cm² de área ^. Os pedaços de pele foram incubados em solução dispase a 0,5% em solução salina tamponada com fosfato balanceada a 37°C por 1 hora. Os pedaços foram então transferidos para solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco e a epiderme foi separada da derme. A epiderme foi incubada em solução de tripsina a 0,125% por 10-15 minutos com agitação a 50 rpm, após o que a ação da enzima foi interrompida pela adição de 5% de soro fetal bovino. Um terço da suspensão celular resultante foi usado em sua forma pura para uma das opções de transplante em cicatrizes, o segundo terço foi cultivado em revestimentos de filme doméstico biocompatível "Polypor" e o terceiro terço em placas de Petri sem substrato. A operação de dermoabrasão das cicatrizes resultantes em ratos com subsequente transplante de células epidérmicas de rato nelas foi realizada sob anestesia com éter usando um cautério térmico.

No primeiro grupo de ratos, após a dermoabrasão, pedaços estéreis de cambraia foram colocados sobre a superfície polida, lavada com solução fisiológica e seca da cicatriz, sobre a qual foi aplicada uma suspensão agitada de epidermócitos alogênicos de rato na concentração de 1,5 milhão de células por 1 ml (de acordo com o Instituto de Citologia). Os pedaços de cambraia foram colocados sobre a cicatriz polida de forma que as células permanecessem na superfície da cicatriz. Por cima, foi colocada uma atadura com várias camadas de gaze, que foi costurada nas bordas da cicatriz.

Parte da suspensão celular obtida foi semeada em placas de Petri sobre filmes Polypore estéreis cortados no formato das placas, a outra parte - em placas de Petri sem filme. O cultivo foi realizado em meio FAD, consistindo de uma mistura de meio DMEM e F12 na proporção de 3:1, com a adição de 10% de soro fetal bovino, 5 μg/ml de insulina (Sigma), 0,5 μg/ml de hemisuccinato de hidrocortisona (Sigma). 10 μg/ml de fator de crescimento epidérmico EGF (Instituto de Citologia RAS, São Petersburgo). O segundo e o terceiro grupos de ratos, 7 indivíduos cada, foram operados 6 dias após o primeiro. Nesse momento, camadas multicamadas foram formadas a partir da suspensão de queratinócitos semeados nas placas de Petri, que foram transplantadas para os ratos. O segundo grupo foi transplantado com epidermócitos em um filme, o terceiro - com uma camada multicamadas sem substrato. Após 7 dias, as camadas multicamadas de queratinócitos alogênicos (MPALK) obtidas, semeadas nos filmes "Polypore", foram transplantadas como cultura diretamente para a superfície da ferida. Por cima, o filme, para evitar que se rasgasse, foi fixado com uma atadura de gaze multicamadas e costurado à pele dos ratos.

Antes do transplante dos queratinócitos para o terceiro grupo de ratos cultivados sem substrato, o PAC foi separado do fundo da placa de Petri por meio de tratamento com dispase, que tem a capacidade de romper seletivamente as ligações dermoepidérmicas. Ao atuar em uma camada multicamadas, a dispase rompe a conexão das células da camada basal com o fundo da placa de Petri e tem um efeito muito menor nas conexões intercelulares, o que torna possível "remover" a camada completamente. O descolamento da camada de células multicamadas com dispase foi realizado da seguinte forma. O meio de transporte foi drenado das placas de Petri, as camadas de células foram lavadas três vezes com um meio nutriente contendo antibióticos, em particular, gentamicina (0,2 mg/ml). As camadas multicamadas foram preenchidas com solução de dispase a 0,125% ("Sigma") e colocadas em um termostato, onde foram incubadas a t = 37 °C por 20 a 30 minutos. O aparecimento de uma borda branca descolando ao longo da periferia da camada é um indicador do início do processo de sua separação das bordas e do fundo da placa de Petri. Poucos minutos após o início do processo de separação, a solução de dispase foi drenada e as camadas epiteliais foram lavadas 2 a 3 vezes com o meio. Um pedaço de curativo estéril "Lita-color", cortado no tamanho da cápsula, foi aplicado na superfície da camada epidérmica, ao qual foi fixada a camada separada por dispase, adicionalmente descolada do fundo da cápsula com uma espátula. Com uma pinça ocular, a camada, juntamente com o revestimento do guardanapo "Lita-color" (Rússia), foi arrancada do fundo da placa de Petri e cuidadosamente transferida para a superfície preparada da cicatriz. Os guardanapos "Lita-color" contêm gentamicina e exolina (extrato de colágeno), que, quando umedecidos com os restos do meio de crescimento e depois com uma solução fisiológica, incharam e se tornaram um curativo moderno, proporcionando boa proteção contra infecções externas e cicatrização rápida devido à estrutura absorvente de umidade.

Ataduras de gaze multicamadas foram aplicadas aos filmes Polypore e aos guardanapos Lita-color e costuradas à pele dos ratos para uma fixação mais forte. Cada rato foi colocado em uma gaiola separada para criar condições ideais para sua manutenção e enxertia dos queratinócitos transplantados. As ataduras dos ratos para os quais a suspensão e a camada multicamadas de epidermócitos removidos por dispase foram transplantadas foram umedecidas com solução salina estéril várias vezes ao dia para criar as condições mais favoráveis para a enxertia das células. Considerando que o filme Polypore era impermeável à água, as ataduras dos ratos do segundo grupo não foram umedecidas, o que foi uma das vantagens em relação aos transplantes sem filmes. As ataduras foram removidas após 10 dias. O quadro clínico das cicatrizes após o transplante de células diferiu pouco das cicatrizes sem transplante, exceto pela coloração mais rosada (devido à dermoabrasão) e maior descamação. Esse fato sugere que, imediatamente após a queda dos curativos com o MPC, não ocorreram alterações na cicatriz.

Coleta de material de biópsia de ratos.

Após 1, 2, 5 e 9 meses do transplante de queratinócitos alogênicos de rato em cicatrizes polidas de ratos brancos, o material foi coletado para exames histológicos, citomorfológicos e de microscopia eletrônica. Amostras de pele normal e de cicatriz de rato sem transplante de células foram coletadas como controle. A anestesia dos ratos foi realizada com éter.

Após a anestesia, pedaços de tecido cicatricial foram retirados das áreas marcadas para as quais os queratinócitos foram transplantados, utilizando um punch de biópsia de 2 mm de diâmetro, e colocados em uma solução de glutaraldeído a 2,5% para preparar o material para exame microscópico eletrônico. Os pedaços de tecido retirados para exame histológico foram colocados em uma solução de formalina neutra a 10%, seguidos de passagem por álcoois e inclusão em parafina, seguidos de cortes ultrafinos para visualização em microscópio óptico de luz.

Controle I. Pele normal de rato.

Para ver a diferença entre a imagem microscópica da pele normal do rato alterada por cicatrizes e as cicatrizes em certos momentos após o transplante de MPC, fotografias e descrições delas são mostradas em todas as etapas deste estudo.

A epiderme da pele normal consiste em 7 a 9 camadas de células. O estrato córneo é de espessura moderada. Em alguns locais, consiste em 6 a 8 camadas de escamas córneas. A camada basal é representada por células cilíndricas com núcleos grandes, leves e de formato regular, e vários nucléolos. As conexões desmossômicas entre as células e com a membrana basal são claramente expressas. Sob a membrana basal bem definida, que apresenta pequenas protuberâncias na camada subepidérmica, paralelamente a ela encontram-se delicados feixes de fibras de colágeno e elastina, entre os quais fibroblastos alongados e pequenos vasos. Em camadas mais profundas, feixes de fibras de colágeno e elastina encontram-se em diferentes direções. Entre eles, encontram-se muitos vasos com paredes finas do mesmo calibre, elementos celulares (fibroblastos, mastócitos, leucócitos). Um grande número de folículos pilosos e glândulas sebáceas.

Controle 2. Cicatriz de rato, 2 meses de idade.

Quadro clínico. As cicatrizes são rosa-claras, com descamação, com crostas em alguns pontos. Sua área diminuiu devido à contração das fibras de colágeno e passou a medir aproximadamente 3,0-3,5 cm ^. Ausência de anexos cutâneos.

Imagem microscópica. A epiderme consiste em 3 a 5 camadas de células, dobradas, representadas por células basais arredondadas, uma fileira de subuladas, 1 a 2 fileiras de granulares com grãos de querato-hialina na camada superior, há áreas de edema intracelular. O estrato córneo é alterado de forma irregular, de muito fino a espessado. O dobramento cicatricial é observado devido à (contração) do tecido cicatricial. As dobras penetram na camada papilar e criam a impressão de papilas. A fronteira entre a epiderme e a derme é uma linha reta. A membrana basal não é traçada em todos os lugares. Na parte inferior das camadas subepidérmicas e mais profundas, há vasos com uma parede espessa e solta, muitos desertos, com estase. Ao redor dos vasos, há um acúmulo de macrófagos e fibroblastos. Os macrófagos circundam os eritrócitos liberados dos capilares e os fagocitam. Nas camadas mais superficiais, há pequenos capilares. Sob a epiderme, as fibras de colágeno estão localizadas frouxamente. Na camada mais profunda da cicatriz existem feixes grosseiros de fibras colágenas, entre as quais há muitos fibroblastos.

Cicatriz de rato um mês após transplante de queratinócitos de rato.

Quadro clínico. As cicatrizes são rosadas, sua área diminuiu, especialmente em diâmetro, e mede em média 2,5-3 cm² ^. Não há pelos e glândulas sebáceas.

Os dados do exame microscópico do material obtido de ratos com transplante de MPaLK em filme e MPaLK sem substrato são praticamente idênticos. No entanto, tecnicamente, trabalhar com MPaLK sem substrato é muito mais complexo e trabalhoso do que cultivar MPaLK em substrato. Portanto, em um estudo mais aprofundado da questão do transplante de queratinócitos em cicatrizes, utilizamos cambraia multicamadas como base para o cultivo ("substratos").

Imagem microscópica. Observa-se um espessamento da epiderme para 15 a 20 camadas, quase no meio das quais os queratinócitos apresentam formato vertical estreito e alongado, com arranjo compacto. As células basais estão dispostas em linha irregular. Seus núcleos são leves, grandes, arredondados, com um ou dois nucléolos, o que indica sua alta atividade sintética e proliferativa. A fronteira entre a epiderme e a derme é uma linha reta. A camada espinhosa é bem desenvolvida, composta por 3 a 5 camadas de células arredondadas, com células 2 nucleolares.

Imediatamente abaixo da membrana basal, encontram-se feixes finos e densos de fibras colágenas; paralelamente a eles, há um grande número de vasos desprovidos de fibras colágenas; as fibras colágenas mais profundas são mais grosseiras, reunidas em feixes densos. Existem muitos fibroblastos grandes, mastócitos (2-3 no campo de visão), macrófagos, leucócitos e vasos desprovidos de fibras colágenas, cujas paredes estão soltas; ao redor deles, fibras colágenas estão frouxamente localizadas. Em alguns vasos, há estase e diapedese de elementos figurados. Ao redor dos vasos, há fibroblastos e linfócitos isolados. Ausência de apêndices cutâneos.

Ao transplantar uma suspensão de queratinócitos para uma cicatriz polida, o quadro microscópico difere do anterior. Na maioria dos animais, a epiderme é fina e consiste em 5 a 6 camadas de células. A camada inferior consiste em células de formato poligonal irregular, com núcleos de formato arredondado-irregular. O estado da camada subepidérmica é semelhante ao do grupo de animais sem transplante de MPALK.

Nesse caso, podemos falar de um atraso nos processos que acompanham o transplante de células ou de uma grande perda de células transplantadas em suspensão. Assim, concluiu-se que a correção de cicatrizes com o transplante de queratinócitos em suspensão é inviável.

Cicatriz de rato 2 meses após transplante de queratinócitos de rato.

Quadro clínico. A cicatriz parece fina e delicada. Em alguns locais, observam-se descamação e manchas escamosas.

Imagem microscópica. O estrato córneo está espessado, em alguns pontos - hiperceratose. A epiderme está espessada, composta por 12 a 20 fileiras de células. A fronteira entre a epiderme e a derme é uma linha reta. Fibras de colágeno delicadas sob a epiderme encontram-se bastante densas. Nas camadas mais profundas da cicatriz, elas se agrupam em grandes feixes grosseiros. Na camada subepidérmica, surge uma nova formação vascular. Nas camadas inferiores do tecido cicatricial, existem muitos vasos desertos localizados paralelamente à superfície da epiderme. Grandes fibroblastos estão distribuídos uniformemente na espessura da cicatriz, e há macrófagos gigantes, multirramificados e numerosos.

Cicatriz de rato 5 meses após transplante de células epidérmicas de rato.

Quadro clínico. A cicatriz apresenta-se uniforme, lisa, sem descamação, com pelos isolados, cuja densidade é maior na periferia da cicatriz, o que indica crescimento marginal de folículos capilares na cicatriz e formação de novos folículos capilares. A área das cicatrizes continua a diminuir.

Imagem microscópica. A epiderme ainda é espessa (15 a 20 camadas, em alguns pontos até 30); nas camadas superiores, ela é preenchida com grãos de querato-hialina. A membrana basal é claramente visível. Abaixo dela, as fibras de colágeno se encontram frouxamente. Nas camadas inferiores, o colágeno é mais potente e compactado. Há muitos capilares entre os feixes de colágeno. Nas camadas superiores, o número de vasos abandonados diminuiu. A junção da epiderme e da derme é ligeiramente ondulada. Em alguns pontos, há crescimentos epidérmicos profundos no tecido cicatricial. Vasos neoformados são visíveis entre as fibras de colágeno. Aparecem folículos pilosos isolados e glândulas sebáceas.

Cicatriz de rato 9 meses após transplante de células epidérmicas de MPA de rato.

Quadro clínico. As cicatrizes diminuíram significativamente de tamanho em comparação com períodos anteriores, com uma área média de 1,5 a 2,0 cm² ^. As cicatrizes estão cobertas de pelos finos de forma irregular, especialmente na periferia. Permanece uma pequena descamação em lâmina fina.

Imagem microscópica.

A epiderme tornou-se mais fina, é representada por 6 a 8 fileiras de células, assemelhando-se à epiderme da pele normal de ratos em estrutura, apenas a densidade celular é 1 mm maior e elas são menores. A camada basal consiste em pequenas células cilíndricas redondas. A membrana basal é bem expressa, hemidesmossomos são claramente visíveis. A presença de protuberâncias epidérmicas na camada subepidérmica é notada. A camada papilar é expressa ao longo de toda a extensão da cicatriz. Esses fatos indicam que, nesse momento, a adesão dos queratinócitos transplantados se tornou muito mais forte com os tecidos cicatriciais subjacentes. Portanto, o cuidado da cicatriz em pessoas com transplante de MPALK 9 meses após o transplante de MPC pode ser tradicional. Sob a epiderme, as fibras de colágeno são mais delicadas do que nas camadas profundas. Muitos vasos apareceram, especialmente os superficiais. As paredes dos vasos maiores estão espessadas. Folículos pilosos e glândulas sebáceas estão em grande quantidade. A imagem microscópica assemelha-se a tecido semelhante à dérmica.

Resultados do trabalho experimental e sua discussão.

No decorrer deste trabalho, queratinócitos em diversas formas foram transplantados para cicatrizes de pele de ratos criadas artificialmente após cirurgia de dermoabrasão – em curativos, como suspensão em cambraia e como camada multicamadas sem substrato. O trabalho foi realizado com o objetivo de obter dados morfológicos sobre o efeito de queratinócitos alogênicos transplantados em cicatrizes, bem como determinar as opções ideais de transplante.

Constatou-se que todos os três métodos de transplante são viáveis, mas o transplante do MPAC sem substrato é um procedimento muito trabalhoso, durante o qual o MPAC pode ser danificado, o que afeta os resultados do transplante. Além disso, este método de transplante exclui o trabalho em grandes superfícies.

O transplante de suspensão de queratinócitos é um método muito mais econômico, não requer cultivo celular a longo prazo e é simples na versão que propomos, utilizando blanks de cambraia estéreis, cujos tamanhos correspondem ao tamanho das cicatrizes. O atraso no efeito terapêutico do transplante de uma suspensão celular em cerca de um mês, em comparação com o transplante de MPC em um revestimento de ferida, não é um ponto significativo com uma duração de tratamento de vários meses. Sabe-se que, quando o transplante de MPC é feito em pacientes com queimaduras, a transformação da estrutura da pele ocorre gradualmente e ao longo de vários anos. O transplante de cultura de queratinócitos em revestimentos de ferida é o método mais conveniente e promissor, mas também significativamente mais caro. Além disso, atualmente é necessária a busca por opções de revestimento mais avançadas, que sejam flexíveis, higroscópicas, tenham propriedades bacteriostáticas ou bactericidas e sejam biologicamente neutras para as células. O filme "Polypor" - uma versão intermediária do filme doméstico para revestimento de feridas -, apesar de algumas imperfeições, permitiu-nos estudar experimentalmente o transplante de queratinócitos de ratos em cicatrizes e tirar conclusões sobre a eficácia dessa direção de tratamento de cicatrizes.

Os autores que transplantaram MPC em feridas de queimadura observaram que, durante a primeira semana após o transplante de uma camada multicamadas de queratinócitos em feridas higienizadas, a epiderme se espessava e se estratificava. Todas as camadas da epiderme eram claramente visíveis. Curiosamente, o número de camadas celulares nos transplantes era de 10 a 30% maior do que nas biópsias de pele. Os autores observaram o aparecimento de grânulos de querato-hialina no 5º dia após o transplante de MPC, e da membrana basal e dos hemidesmossomos já no 3º dia.

J.Rives et al. (1994), Paramonov BA (1996); Kuznetsov NM et al. (1998) descobriram que nos estágios iniciais após o transplante de MPC para pacientes com defeitos de pele de espessura total após queimaduras, a conexão entre a derme e a epiderme é muito fraca e é uma linha reta, a camada papilar está ausente. Ao final do segundo mês, papilas rasas e apêndices de pele começam a se formar, a conexão entre a derme e a epiderme se torna mais forte. Dados da literatura indicam que o transplante de queratinócitos alogênicos em feridas em pacientes queimados é um método promissor. Apesar do fato de que a rejeição de queratinócitos alogênicos ocorre, de acordo com diferentes autores, dentro de 10 dias a 3 meses, eles ainda desempenham seu papel na cicatrização da superfície da ferida, secretando fatores de crescimento e fechando mecanicamente o defeito. Acredita-se que as MPALCs tenham atividade antigênica reduzida, visto que, durante o cultivo in vitro, perdem células de Langerhans, o que lhes permite existir no corpo do receptor por um longo período. Além disso, uma cultura alogênica obtida da pele de pessoas jovens e saudáveis tem um potencial biológico incomparavelmente maior do que uma cultura autóloga de pacientes após uma lesão.

O principal objetivo do nosso estudo foi descobrir se os queratinócitos alogênicos se enraizarão em cicatrizes e quais alterações ocorrerão no tecido cicatricial sob a influência desse "revestimento de ferida" biologicamente ativo. Em caso de resultado positivo, desenvolver a tecnologia mais eficaz e menos trabalhosa para esta área da medicina de reabilitação.

Os dados que obtivemos foram, em muitos aspectos, semelhantes aos dados da literatura sobre alterações morfológicas que ocorrem na epiderme humana após o transplante de queratinócitos alogênicos para feridas de queimadura. No entanto, também existem diferenças significativas, tanto em termos do substrato morfológico sobre o qual o transplante ocorre quanto em termos de tecnologia. Assim, o processo de formação da membrana basal e das conexões dermoepidérmicas (hemidesmossomos, papilas) ocorre em um estágio mais tardio em comparação ao transplante de queratinócitos para superfícies de feridas sem alterações cicatriciais. Aparentemente, isso ocorre devido à pior nutrição do tecido cicatricial em comparação com a derme ou a fáscia muscular. Uma cicatriz, especialmente uma antiga, é um tecido conjuntivo denso com um número muito pequeno de vasos, enquanto o fundo de uma ferida de queimadura é um tecido de granulação rico em vasos. Assim, é óbvio que as condições sob as quais o transplante e o enxerto de queratinócitos ocorrem são absolutamente diferentes. Quanto mais vascularizada for a área de transplante de células, mais fácil será o processo de seu enxerto. Deste postulado decorre a conclusão sobre a preferência de trabalhar com cicatrizes jovens, nas quais o tecido conjuntivo ainda é bastante frouxo e rico em vasos.

Como resultado deste trabalho experimental foi comprovado que:

1. O transplante de MPALK em cicatrizes é possível.
2. O método ideal de transplante é o transplante de queratinócitos na cobertura da ferida.
3. A superfície da cicatriz deve ser polida usando dermoabrasão cirúrgica a laser ou um cortador Schumann.
4. Sob a influência do MPALK, ocorre rápida epitelização da superfície polida da cicatriz.
5. Quanto mais vascularizado for o tecido cicatricial, ou seja, quanto mais jovem for a cicatriz, melhores serão os resultados do transplante de queratinócitos.
6. Sob a influência dos queratinócitos transplantados, o tecido cicatricial gradualmente se transforma e se torna dérmico (tecido cicatricial mais solto com apêndices de pele).
7. Afrouxamento gradual do tecido cicatricial, começando pela camada subepidérmica. Sua vascularização melhora, e os feixes de fibras colágenas nas partes superior e inferior da cicatriz assumem uma disposição mais solta do que no tecido cicatricial sem transplante celular. Folículos pilosos e glândulas sebáceas aparecem. A epiderme, em sua estrutura, após passar pela fase de hipertrofia, aproxima-se da epiderme da pele normal.
8. As alterações observadas estão associadas a fatores de crescimento e citocinas secretadas pelos queratinócitos, que, ao melhorar o trofismo do tecido cicatricial, promovem sua transformação de tecido fibroso grosseiro em tecido mais frouxo, o que leva a uma melhora no aspecto da cicatriz.

Assim, com base neste estudo, pode-se concluir que os queratinócitos transplantados apresentam efeito benéfico no tecido cicatricial, o que pode ter implicações práticas na reabilitação de pacientes com diversos tipos de cicatrizes.

Este trabalho em ratos também nos permitiu formular os requisitos para coberturas de feridas nas quais os queratinócitos são cultivados.

Os curativos devem ser:

• biocompatível com células,
• respirável,
• têm uma base elástica e modelável,
• ser hidrofílico,
• como aditivos medicinais contêm medicamentos antibacterianos e antioxidantes que não são tóxicos para células cultivadas.

Resultados clínicos do tratamento biotecnológico de cicatrizes.

Anteriormente, N. Carver et al. (1993) constataram que curativos oclusivos promovem melhor a adesão à ferida e a sobrevivência dos queratinócitos, mas não permitem a formação de epiderme estratificada (madura). Um ambiente arejado é necessário para a formação de epiderme estratificada. Portanto, após a adesão de uma camada multicamadas, propôs-se remover o curativo oclusivo após 7 a 10 dias e tratar as feridas com curativos secos ou pomadas hidrossolúveis. Pode-se afirmar que a qualidade e as propriedades do "substrato" no qual as células são cultivadas são um ponto muito importante para a eficácia do transplante de material celular e, portanto, para os resultados do trabalho dos médicos. No entanto, não existe um curativo ideal atualmente, apesar da abundância de opções propostas (pele artificial, tecido não tecido de carboximetilcelulose, revestimentos de fibrina, filmes de poliuretano semipermeáveis). Um ponto importante nesta questão é o custo dos “substratos” (coberturas especiais para feridas), uma vez que seu alto custo aumenta o custo total do tratamento biotecnológico.

A eficácia das tecnologias celulares foi comprovada até o momento, mas, infelizmente, essas tecnologias são muito caras, especialmente em países onde a produção industrial de composições celulares não foi estabelecida. No entanto, países como os Estados Unidos há muito tempo estabeleceram uma indústria para a produção de material celular para transplante de queimaduras. Em particular, a empresa BioSurface Technology Inc., desde 1989, cultivou 37.000 camadas de queratinócitos multicamadas, que foram usadas para tratar 240 pacientes em 79 países ao redor do mundo (R. Odessey, 1992), enquanto 1 cm² de cultura ^{de células} custa cerca de 7 a 8 dólares americanos.

A tecnologia para tratar diversas doenças e problemas de pele tem uma série de diferenças, mas qualquer tratamento celular se baseia na obtenção de material celular de alta qualidade e seu transplante.

Este processo consiste nas seguintes etapas:

• retirada de pele de vítimas (ou de doadores),
• transporte de retalhos de pele para um centro de biotecnologia,
• isolamento de células da camada basal e sua proliferação,
• crescimento de camadas de queratinócitos multicamadas (MLK).
• transplante de cultura de células.

O principal problema na realização do tratamento por transplante de lâminas multicamadas de queratinócitos é a necessidade de células viáveis em todas as etapas do transplante. Os fragmentos de pele para isolamento de células autólogas ou alogênicas devem ser os mais finos possíveis, pois, nesse caso, são mais fáceis de separar por métodos mecânicos e enzimáticos e de obter uma suspensão de células vivas para cultivo. Eles podem ser obtidos por corte com dermátomo ou utilizando a pele das pálpebras, prepúcio e superfície interna do ombro. Como as células são sensíveis a halogênios (cloro, iodo) e peróxido de hidrogênio, elas não podem ser utilizadas no processamento da pele durante a coleta do material.

O rendimento quantitativo e qualitativo das células dos enxertos de pele e a eficiência do seu cultivo também dependem da saúde e da idade do doador. Além disso, as biópsias de pele devem ser entregues o mais rápido possível e em condições adequadas (ambiente, temperatura) a um laboratório certificado e credenciado para esses fins.

Para armazenamento e transporte de retalhos de pele, pode-se utilizar meio de Eagle ou meio 199 com adição de 10% de soro bovino, meio DMEM com adição de 5% de soro fetal bovino e antibióticos.

No laboratório de citologia, a biópsia de pele é primeiramente dividida mecanicamente em pequenos pedaços, depois os pedaços de pele são processados usando enzimas: tripsina, colagenase, dispase, etc.

Sob a ação de enzimas, os desmossomos são destruídos e os queratinócitos são liberados no meio na forma de células individuais ou agregados constituídos por diferentes números de células. Apenas queratinócitos basais são utilizados para o cultivo, os quais são cultivados em meios especiais em termostatos contendo 5% de CO2, em placas de Petri ou em frascos a t = 37 °C. Já após 48 horas, observa-se a formação de colônias de queratinócitos, que gradualmente se fundem para se transformarem em uma monocamada. Após receber um número suficiente de células, a suspensão resultante é semeada em curativos preparados para esse fim e colocados em placas de Petri. Primeiramente, uma monocamada e, em seguida, uma camada multicamada de queratinócitos são formadas a partir da suspensão. As etapas do processo de cultivo de queratinócitos são mostradas esquematicamente na Figura 12 (33, 43, 54, 65).

A formação de uma camada multicamada de queratinócitos adequada para transplante geralmente leva de 7 a 10 dias. Às vezes, esse período é mais longo, dependendo da qualidade do material de origem (idade, estado de saúde do doador, correção da coleta do material, qualidade do meio utilizado, etc.). Se a camada multicamada crescer excessivamente, células com fenômenos de apoptose inadequadas para transplante podem aparecer em sua superfície. Placas de Petri com camadas multicamadas de queratinócitos (MLK) cultivadas em curativos são entregues à clínica em recipientes especiais a uma temperatura de pelo menos +15 °C.

Método de Green modificado para o cultivo de MPC

Em nosso trabalho, utilizamos cambraia multicamadas como cobertura de feridas, abandonando os filmes "Polypor" com os quais começamos a trabalhar no experimento com ratos. Assim, cultivamos camadas multicamadas de queratinócitos em cambraia pré-desengordurada e estéril, embora esta também não seja uma cobertura ideal para feridas.

Os estudos clínicos foram conduzidos em voluntários em conformidade com os padrões éticos necessários: assinatura de um acordo e consentimento informado.

1. Foi utilizada uma cultura de queratinócitos do próprio paciente (autólogos) e de banco (alogênicos).
2. Os queratinócitos dos próprios pacientes foram obtidos de um pedaço de pele cortado da parte interna da parte superior dos braços.
3. A cirurgia de dermoabrasão de cicatrizes foi realizada utilizando termocautério, discos rotatórios e laser de érbio.
4. Foram selecionados grupos de pacientes com cicatrizes normotróficas, hipotróficas e hipertróficas.

O processo tecnológico para aplicação da tecnologia celular para melhorar a aparência de cicatrizes cutâneas consistiu nas seguintes etapas:

1. Seleção de pacientes.
2. Explicações sobre a essência do tratamento, o prazo para obtenção dos resultados esperados, assinatura do contrato e consentimento informado.
3. Prescreva aos pacientes 2 a 3 semanas antes da cirurgia selmevit 1 comprimido 3 vezes ao dia, zinctheral 1 comprimido 3 vezes ao dia.
4. Retirar um pedaço de pele de 2,0 cm de comprimento e 0,7-1,0 cm de largura da superfície interna do ombro, alto, quase na parte inferior da região axilar para obter queratinócitos autólogos.
5. Nos casos em que os pacientes se recusaram a ter seus próprios queratinócitos isolados devido à possibilidade de uma cicatriz linear na superfície interna do ombro, o material celular foi retirado de um banco de células (queratinócitos alogênicos).
6. Os queratinócitos foram isolados e cultivados em laboratório certificado para esse tipo de trabalho.
7. Após a obtenção de quantidade suficiente de MPC para transplante nas cicatrizes, foi marcado um dia para a operação na clínica, onde o material foi trazido em recipientes especiais em placas de Petri.
8. Foi realizada uma cirurgia de dermoabrasão cicatricial, hemostasia, a superfície polida foi lavada com solução salina estéril, seca e, em seguida, as células miocutâneas (MPCs) foram transplantadas para ela em cambraia estéril, com as células voltadas para baixo. Ou seja, as células que estavam na parte superior da MPC ficaram na parte inferior, adjacentes à superfície polida.
9. Por cima, foi aplicada uma película estéril, que foi fixada à pele com uma bandagem elástica ou curativo elástico Omnifix. Em vez da película, podem ser utilizados curativos neutros contendo silicone, como Mepitel, Mepiform e folhas de gel de silicone.

Após 5 a 7 dias, a película ou revestimento de silicone é removido. Nesse momento, todos os queratinócitos devem ter se espalhado sobre a cicatriz polida e aderido à sua superfície.

10. O ambiente úmido criado sob a película e o revestimento de silicone contribui ativamente para isso. A cambraia remanescente na cicatriz a partir deste ponto pode ser embebida em gel de curiosina ou quitosana. Como resultado, no segundo dia, forma-se uma crosta densa, que, para maior comodidade do paciente, é melhor fixada com um adesivo elástico e respirável, como o Omnifix. A crosta respirável permite que a epiderme formada se diferencie e se transforme em uma epiderme madura.

Dependendo do tipo de cicatriz e da profundidade do desgaste, o curativo é rejeitado após 8 a 10 dias. Nesse período, a epiderme possui 30 a 40% mais camadas celulares do que a pele normal. A membrana basal não é formada. Os queratinócitos da epiderme espessada secretam muitas moléculas biologicamente ativas no tecido cicatricial.

O sucesso do tratamento biotecnológico de cicatrizes depende em grande parte do método de cuidado no pós-operatório. Culturas de células são um tipo de cobertura "suave" para feridas e, nos estágios iniciais após o transplante, as células intersticiais intestinais (CIPs) podem ser facilmente removidas dos tecidos subjacentes. Portanto, recomenda-se que os pacientes manuseiem a cicatriz com cuidado após a cirurgia. Por 8 a 9 meses, não esfregue e trate delicadamente com água fervida fria para evitar rasgar a fina epiderme recém-formada, que não possui uma ligação firme com os tecidos subjacentes.

Observação.

Antes da cirurgia e durante a dermoabrasão, o uso de antissépticos e oxidantes halogenados (iodopirona, suliodopirona, iodinol, iodato, clorexidina, peróxido de hidrogênio) é permitido, mas antes do transplante de células é estritamente contraindicado devido ao seu efeito citotóxico. Azul de metileno e verde brilhante também são tóxicos para as células.

Para evitar infecção, especialmente em cicatrizes hipertróficas, o campo cirúrgico pode ser tratado com sulfato de neomicina, polimixina ou gentamicina. Esses medicamentos não têm efeito citotóxico sobre os queratinócitos.

Como resultado desse tratamento, um efeito triplo é alcançado.

1. Nivelamento da superfície da cicatriz.
2. Criação de uma camada de nova epiderme de espessura normal acima dela.
3. Transformação do tecido cicatricial em tecido dérmico devido à ação de citocinas, fatores de crescimento e outras moléculas biologicamente ativas secretadas pelas células transplantadas e estimuladas por elas queratinócitos, fibroblastos e macrófagos.

A cicatriz fica menos perceptível, mais elástica, aparecem poros e pelos velus, e a pigmentação pode ser restaurada devido à presença de melanócitos no IPC.

No entanto, todos esses aspectos positivos da cicatriz não ocorrem imediatamente. Nesse sentido, é necessário alertar os pacientes de que o processo de transformação do tecido cicatricial em tecido dérmico ocorre lentamente e o resultado ideal desse tratamento pode ser esperado em, no máximo, 10 a 14 meses. Imediatamente após a rejeição dos curativos, as superfícies polidas apresentam uma policromia pronunciada, tanto mais brilhante quanto mais profundo o polimento foi realizado. O menor dano à pele é observado durante o polimento de cicatrizes normotróficas com laser de érbio. A cor das cicatrizes e da pele ao redor foi restaurada em 3 a 8 semanas. Apesar dessas precauções, às vezes ocorre hiperpigmentação pós-operatória, que pode desaparecer espontaneamente em poucos meses.

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